具有抗氧化活性的绞股蓝内生真菌的分离及研究_尚菲

药物生物技术

Pharmaceutical Biotechnology2011，18（6）：519 521

具有抗氧化活性的绞股蓝内生真菌的分离及研究

尚菲，魏希颖*，刘竹，马彩霞

（陕西师范大学生命科学学院，陕西西安710062）

摘要从药用植物绞股蓝根部分离内生真菌，筛选出抗氧化活性菌株并对其成分进行初步检测，鉴定目的菌株。采用常规方法分离绞股蓝根部内生真菌；DPPH法和Fe3+还原力测定抗氧化能力；TLC和HPLC检测内生真菌代谢产物中绞股蓝皂苷；分子生物学方法进行种属鉴定。分离得到的10株内生真菌中G4菌株具有一定的抗氧化活性，经检测发现G4的胞内产物中含有绞股蓝皂苷，鉴定其为柔膜菌目（Helotiales）。

关键词绞股蓝；内生真菌；抗氧化；绞股蓝皂苷

中图分类号S567.23+7文献标志码A文章编号1005-8915（2011）06-0519-03

内生真菌（endophytic fungi）是指那些在其生活史中的某一个阶段存在于健康植物组织内部，不会引起宿主明显病症或者对宿主造成明显伤害的真菌［1］。有研究表明，内生真菌存在于所有植物种类当中，并且在与宿主长期的生态系统演化中形成了互惠共生关系，可产生与宿主相同或相似的具有生物活性的次生代谢产物［2-3］。我国是药用植物大国，资源丰富，有记载的药用植物11020种，隶属2313属，383科，约占药用资源总数的87%［4］。但目前随着大规模的开发利用，自然资源逐渐减少，通过药用植物内生真菌资源寻找药物活性成分，为解决资源短缺和生态破坏等问题提供了新的思路。

绞股蓝Gynostemma pentaPhyllum（Thunb.）Makino为葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物［5］，主要成分为绞股蓝皂苷（gypenoside，GP），具有抑制肿瘤、抗氧化、抗疲劳、滋补强壮、促进细胞新陈代谢、减肥、增强免疫、抗胃溃疡等多种生理活性［6-7］。本研究从绞股蓝根部内生真菌入手，寻找抗氧化活性菌株，以期为天然抗氧化剂提供新的来源。

1材料

1.1样品

绞股蓝，于2010年3月采于陕西师范大学，经陕西师范大学生命科学学院肖娅萍教授鉴定为绞股蓝Gynostemma pentaPhyllum（Thunb.）Makino。

1.2培养基

PDA培养基：200g新鲜马铃薯，去皮煮沸30min后过滤收集滤液，20g葡萄糖，1.5%琼脂，加水至1000mL，自然pH，121?灭菌30min。PDB培养基：未加琼脂的PDA培养基。分离培养基：采用加入青霉素和链霉素各200μg/mL的PDA培养基，待其冷却到60?左右时加入。

1.3药品与试剂

绞股蓝皂苷标品购于辽宁生物医药研究中心（121311-200402）；二苯基苦基苯肼（DPPH）购于Sigma公司；PCR相关试剂购于北京经科宏达生物技术有限公司（DOUPSON）；分析纯试剂均购于天津市天力化学试剂有限公司；色谱纯试剂均购于天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.4仪器

YXQ-50SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器，SPX-100B-Z型生化培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；BE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；CBILON88-Ⅱ型超声细胞粉碎机（上海比朗仪器有限公司）；2F-2型三用紫外仪（上海市安亭电子仪器厂）；LXJ-Ⅱ型离心沉淀机（上海医用分析仪器厂）；LC-2010型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；S1000型PCR仪（BIO-RAD）。

2方法

2.1内生真菌的分离

将新鲜，健康的绞股蓝根在自来水下冲洗干净，进行如下表面消毒：无菌操作台中用75%酒精漂洗5min，2.5%次氯酸钠漂洗7min，无菌水冲洗4 6次，使用无菌滤纸片吸干水分，切成长约1cm的小段种植于分离培养基上，每个培

915

收稿日期：2011-06-20修回日期：2011-07-31

基金项目：陕西师范大学研究生培养创新基金（No．2011CXS031）。

作者简介：尚菲，女（1987-），甘肃庆阳人，微生物学专业硕士研究生，主要从事药用植物内生菌的研究。Tel：187********，E-mail：angei526@https://www.wendangku.net/doc/5b12492288.html,。

*通讯作者：魏希颖，E-mail：xiyingwei@https://www.wendangku.net/doc/5b12492288.html,。

药物生物技术第18卷第6期

养皿中接3段，置28?恒温培养箱中培养3 30d，待断面边缘有菌丝长出后，采用尖端菌丝挑取法反复纯化培养，4?斜面保藏。

2.2内生真菌代谢产物粗提物的制备

于250mL的锥形瓶中加入100mL PDB培养液，将内生真菌接种在PDB培养液中，摇床（28?，180r/min）振荡培养10 15d，分别收集菌丝体和发酵液，菌丝体40?烘干，加入乙醇超声破碎，离心取上清得胞内产物的粗提液。发酵液用水饱和的正丁醇萃取3次，浓缩蒸干后用乙醇溶解得胞外产物的粗提液。

2.3绞股蓝全草中有效成分的提取

将绞股蓝全草粉碎，过40目筛，称取20g加入乙醇200mL，80?回流提取2次，每次3h。过滤合并滤液，减压浓缩得浸膏，80?通风烘干，制得提取物。

2.4抗氧化活性试验

2.4.1有机自由基（DPPH）清除能力的测定［7］以无水乙醇配制2?10－4mol/L的DPPH溶液，避光保存。取2mL DPPH溶液，加入2mL待测样品溶液，充分混合，30min后在517nm处测定其吸光度。清除率计算用公式K=［1－（Ai－Aj）/Ac］?100%（1）

式（1）中：Ai=2mLDPPH溶液+2mL待测溶液

Aj=2mL待测溶液+2mL无水乙醇

Ac=2mLDPPH溶液+2mL无水乙醇

2.4.2Fe3+还原力的测定［8］取2.5mL样品溶液加入0.2mol/L磷酸缓冲液及1%铁氰化钾2.5mL，50?水浴20min后急速冷却，加入2.5Ml10%三氯乙酸溶液混匀，离心，取上清5mL加入0.02%三氯化铁溶液5mL，10min 后于700nm处测定吸光度。

2.5内生真菌代谢产物中活性成分的初步鉴定

2.5.1薄层层析（TLC）采用硅胶GF254自制板，展开剂：氯仿-甲醇-水（13?7?2）10?以下放置的下层溶液，点样层析，取出晾干后喷10%的硫酸乙醇，105?加热数分钟至斑点显色清晰，置紫外光灯（365nm）下检视。

2.5.2高效液相色谱（HPLC）色谱条件：Diamomsil C

18（2）色谱柱，4.6mm?250mm，5μm；柱温30?；进样体积10μL；检测波长203nm；流速0.8mL/min；流动相：乙腈-水梯度。

2.6G4菌株的分子鉴定采用CTAB法提取G4菌株基因DNA并作为模板［9-10］，利用真菌rDNA内转录间隔区通用引物ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）和ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）扩增菌株的rDNA ITS区，PCR反应条件：94?预变性3min，94?变性1.5min，56?复性30s，72?延伸1.5min，共30个循环，最后72?延伸10min。PCR产物由上海生工生物测序。将测序所得真菌的部分rDNA序列与Gen-Bank数据库中已登录的序列利用BLAST软件进行对比，获得真菌的分类地位。3结果

3.1内生真菌分离结果

本实验从绞股蓝根中分离到内生真菌10株。

3.2抗氧化实验结果

采用DPPH法和Fe3+还原力测定法对其代谢产物进行抗氧化测试，其中G4胞内产物表现出一定的抗氧化能力（图1，图2），即随着质量浓度的增加，G4胞内产物对DPPH 的清除能力和对Fe3+的还原力呈增加趋势，但是在相同浓度下均低于药材提取物

。

Fig1The DPPH scavenging activities of ethanol extracts of herbs and intracellular products of G4

Fig2The reducing power of ethanol extracts of herbs

and intracellular products of G4

3.3内生真菌代谢产物中活性成分的初步鉴定

通过TLC分析发现G4胞内产物与绞股蓝皂苷标品有相同的Rf值。HPLC检测（图3）显示G4的胞内产物在前述色谱条件下与绞股蓝皂苷的标品在约17min处出现了相同的波峰，进一步说明其中含有绞股蓝皂苷。

Fig3 A.HPLC graph of authentic Gypenosides（GP）；

B.Intracellular products of G4.

025

尚

菲等：具有抗氧化活性的绞股蓝内生真菌的分离及研究

3.4

分子鉴定结果

以菌株G4基因组DNA 为模板，以ITS 特异性引物进行扩增，

将所得序列提交到GenBank ，所得序列注册号为EF591767。经过BLAST 比对分析，鉴定结果可初步定为柔膜菌目（Helotiales ），有待于DNA-DNA 杂交做进一步验证

。

Fig 4

Endogamy showing the phylogenetic position of G4

generated through the alignment of ribosomal gene sequences by using MEGA.

4讨论

自由基的大量生成与衰老、心血管等疾病有关，抗氧化

活性物质的筛选具有重要的理论、实践意义

［11］

。本研究对

绞股蓝内生真菌抗氧化能力的测试结果显示G4菌株的胞内产物随着质量浓度的增加，其对DPPH 的清除能力和对Fe

3+

的还原力也呈增加的趋势，经TLC 和HPLC 检测表明，

G4菌株的胞内产物含有绞股蓝皂苷，说明该菌株可能含有与宿主植物相同或相似的某种活性成分。该结果为从植物内生真菌中寻找抗氧化活性化合物开辟了新的途径。

菌株G4经鉴定为子囊菌门中的柔膜菌目。在真菌中，子囊菌亚门（Ascomycotina ）是最大的一个亚门，呈现了最为广泛和最复杂的分化现象，其对环境的适应能力、对其他生物难利用基物的特有利用能力等特性，表明了其次生代谢过程的复杂性与灵活性。因此子囊菌是获取有价值的药用

先导化合物的有效途径之一

［12-13］

。本论文为G4菌株进一

步获取有价值药用化合物的研究提供依据。

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．河北大学学报：自然科学版，2006，26（1）：58.Isolation ，Identification and Antioxidant Activity of an Endophytic Fungi

from Gynostemma pentaphyllum Makino

SHANG Fei ，WEI Xi-ying *，LIU Zhu ，MA Cai-xia

（School of Life Sciences ，Shaanxi Normal University ，Xian 710062，China ）

Abstract

Gynostemma pentaphyllum Makino was a well known edible and medicinal plant in oriental countries and its dominant

active constituents are mainly Gypenosides （GP ）．The objective is to select and identify endophytic fungus from Gynostemma pen-taphyllum Makino which displays antioxidant activity and produces Gypenosides （GP ）as its host．A total of 10strains of endophytic fungi were isolated from the root of healthy ，living ，and symptomless tissues of Gynostemma pentaphyllum Makino ，and the extracts from one strain （G4）showing antioxidant activity and had the same R f value in TLC as that of the authentic Gypenosides （GP ）and its extracts had a retention time identical with that of authentic Gypenosides （GP ）in HPLC．So the strain G4of endophytic fungus appeared to produce the same components as its host ，and rDNA sequence analysis proved that G4was identified to be Helotiales.Key words

Gynostemma pentaphyllum Makino ，Endophytic fungus ，Antioxidant ，Gypenosides （GP ）

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