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江苏伟禾-HLA-B1502荧光PCR试剂说明书

人类主要分子

特异性引物片段HLA-B*1502荧光分型试剂

HLA-B*1502 Real-Time PCR Typing Kit

操作说明书

Research Use Only

国内首创,国际领先!Taqman 探针技术!

产品名称:HLA-B*1502等位基因分型荧光探针PCR试剂盒

检测原理:

由已知人类主要组织相容性抗原分子基因序列设计特异性引物及探针,当引物序列与待测标的序列能完全配合时,引物进行聚合酶链锁反应。特殊核酸片段将被进行复制与放大,同时探针结合上待测标的序列并藉由聚合酶的分解作用产生荧光。荧光反应产生表示在样本中存在与特异性引物匹配的目的基因序列,反之则否。

检测意义:

HLA-B*1502等位基因已被证实与汉族人群因服用精神科常用药物卡马西平引起的史蒂芬-琼森症候群 (Steven-Johnson Syndrome, SJS)以及临床上致死率高达30%的毒性表皮坏死松解症(Toxic Epidermal necrolysis, TEN)有高度的关联性。研究发现,带有HLA-B*1502基因的病患如果服用此药,引起此两种症狀的严重药物过敏机率将比一般人高了193~1300倍。据可靠统计,中国人群中携带HLA-B*1502等位基因的比率超过10%。因此,通过检测HLA-B*1502等位基因是否携带,可降低患者服用卡马西平诱发SJS/TEN的风险。(美国FDA及日本,台湾等地的医疗监管部门已明确要求医生在对亚裔人群使用卡马西平前,必须进行HLA-B*1502基因检测,并且此项检测已纳入医保范围。)

产品特点:

特异:基于荧光探针PCR方法,特异性比普通PCR和荧光染料PCR的方法更高

准确:用三个反应孔进行扩增,每个反应孔均含特异性引物和探针及内对照引物和探针,最大限度的分出HLA-B*1502型别简便:操作简单,无需电泳

省时:检测时间短,约一小时完成检测

可靠:质控过关,结果可靠

防污染:无需进行电泳,防止电泳过程中的污染

检测流程:

、反应体

系配制

3、结果判荧光

PCR反应

每份样本测试时需同时进行MIX1,MIX2,MIX3三管反应。

注1: Indicates as B*1502, B*1588, B*1589, or B*9521

注2: 如还是同样结果则判定为阴性

订购信息:

联系方式:

地址:江苏省泰州医药高新区药城大道一号双子楼九楼 225300 电话:0523-******** 转分机产品咨询:8002 技术咨询:8007 传真:0523-********

网址:https://www.wendangku.net/doc/5a12597046.html,

邮箱:sales@https://www.wendangku.net/doc/5a12597046.html,(产品咨询)

上海办事处:上海市徐汇区蒲汇塘路158号201室

电话:021-******** 手机:188********/136********(张先生)本品仅供科研使用!

目录

1. 效能

2. 摘要与描述

3. 原理

4. 试剂

4.1人类主要组织相容性抗原分子特异性引物片段B1502荧光分型试剂内容4.2 警告及注意事项

4.3 储存条件

4.4 使用规范

5. 设备需求

5.1 荧光聚合酶链反应仪

6. 样本收集及前处理

6.1 血液样本采集

6.2 核酸样本提取

6.3 核酸样本定量

6.4 核酸样本质量规范

7. 操作说明

7.1 套组包含对象

7.2 套组未包含必需使用对象

7.3 样本前处理

7.4 试剂/设备

7.5 荧光聚合酶链反应

8. 实验结果

8.1 结果判读

8.2操作规范

1. 效能

本试剂利用核酸检测(荧光探针PCR法),提供HLA-B*1502型别鉴定。

2. 摘要与描述

人类主要组织相容性抗原分子(Human Leukocyte Antigen,简称HLA) 位于人类的第六条染色体的短臂上,共分成两大类,第一类有A、B、C三种,第二类有DP、DQ、DR;不同人类个体之间的HLA具有高度多态性(Highly polymorphism),目前研究已知HLA对于T细胞免疫的专一性鉴别以及一些临床疾病的用药判断扮演极重要的角色1。HLA-B*1502为HLA-B位点型别的其中一种,HLA-B 1502即是其中一个基因,且已被证实与汉族人群因服用卡巴西平药物引起的史蒂芬琼森症候群 (Steven-Johnson Syndrome, SJS)以及临床上致死率高达30%的毒性表皮坏死松懈症 (Toxic Epidermal necrolysis, TEN)有高度的关联性。根据研究发现,带有HLA-B 1502基因的病患如果服用此药,引起此两种症狀的严重药物过敏机率将比一般人多了193~1300倍的风险。

本人类主要组织相容性抗原分子特异性引物片段HLA-B*1502荧光分型试剂以序列特异性引物进行荧光聚合酶链反应用于人类主要组织相容性抗原分子型别鉴定。

3. 原理

人类主要组织相容性抗原分子特异性引物片段HLA-B*1502荧光分型试剂,以序列特异性引物进行荧光聚合酶链反应用于人类主要组织相容性抗原分子型别鉴定。首先由已知人类主要组织相容性抗原分子基因序列设计特异性引物及探针,当引物序列与待测标的序列能完全配合时,引物进行聚合酶链锁反应。特殊核酸片段将被进行复制与放大,特殊核酸片段复制与放大的同时探针结合上待测标的序列并藉由聚合酶的分解作用产生荧光。荧光反应产生表示在样本中存在与特异性引物完全相同之基因序列,反之则否。

同时在荧光聚合酶链锁反应试剂中,也加入了另外一对内部对照组的核酸引物及探针,进行一常存基因-囊胞纤维膜基因的核酸片段放大侦测,其目的在于证明聚合酶链锁反应的正常进行,当样本中的人类主要组织相容性抗原分子核酸片段被复制放大时,内部对照组基因核酸片段将有可能因放大效率的差异而受到抑制。

人类主要组织兼容性抗原分子特异性引物片段HLA-B*1502分型试剂提供HLA-B*1502主反应液及分型反应液进行聚合酶链锁反应,达到人类主要组织兼容性抗原分子HLA-B*1502型别鉴定分析。

4. 试剂

4.1人类主要组织兼容性抗原分子特异性引物片段B1502荧光分型试剂内容

本套组提供之试剂量足够提供48个样本测试使用。

4.1.1分型反应管共3管(MIX1,MIX2,MIX3):

MIX-1,MIX-2,MIX-3反应管中包含测定B1502所需核酸引物及探针。

注:8连管上标记蓝色依序为MIX1,MIX2,MIX3,另同排空一管后依序为MIX1,MIX2,MIX3,如下图所示:

4.1.2主反应液,每管150μl,共1管

提供聚合酶链锁反应之最适化缓冲液,成分包含0.18 mM脱氧核苷酸(dNTP),1.8 mM 氯化镁(MgCl2),60.3 mM 氯化钾(KCl),18.9 mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)及0.6% 甘油(glycerol)。

4.1.3 阳性对照,每管50μl,共1管

作为反应阳性对照。

4.2 警告及注意事项

4.2.1 本品仅用于科学研究;

4.2.2 需具有经验和专门培训过的人员进行操作;

4.2.3 PCR操作各阶段应在不同的实验室中进行;

4.2.4 PCR操作每个阶段使用专用的仪器和设备;

4.2.5 使用自卸管(滴头)移液器(加样器)或填塞性滴管(滴

头);

4.2.6 穿工作服,戴一次性手套;

4.2.7 必须使用一次性吸头,吸完即弃;

4.2.8 用10%次氯酸或70%酒精或紫外线灯处理工作台和加样

器;

4.3储存条件

本试剂组在未拆封状态下可于-20o C环境存放12个月;为避免污染及重复冷冻解冻影响测试正确性,请将Master 缓冲液依使用习惯进行分装;拆封后未使用完的分型试剂盘请妥善封存于原包装袋中并置回-20o C,且须于四周内使用完毕。

4.4使用规范

分型试剂盘如有破损请勿使用。

5. 设备需求

5.1 聚合酶链锁反应自动循环控温仪

本套组使用聚合酶链锁反应以Applied Biosystems Prism 7000/7300/7500进行之标准条件如下,整个反应需时约50分钟。

聚合酶链锁反应程序设定

请依各型号之自动循环控温仪操作手册进行程序设定

荧光信号采集点设定在65℃

荧光信号采集波长设定FAM(520nm)和HEX (560nm)

荧光阀值: FAM 5.0+03e

HEX 1.0+03e

荧光仪基线参考值5~20。

6. 样本收集及前处理

6.1 血液样本采集

血液样本可以含抗凝血剂柠檬酸钠(Sodium citrate)及乙二胺四乙酸(EDTA)的采血管进行采集,以肝素(Heparin)为抗凝血剂采集之样本会干扰后续之聚合酶链锁反应故不建议使用,样本储存与安定性请参照采血管说明书。

6.2 核酸样本萃取

可由全血或白血球层等含有核细胞的样本,以沉淀法、管柱法或磁珠法进行核酸萃取,取得足量与质量合格的核酸以进行聚合酶链锁反应。

6.3 核酸样本定量

提取的核酸样本必须溶解于灭菌水或其它适当的溶液(如TE Buffer)之中,且浓度应介于10-20 ng/ l,不可将核酸样本溶解于含有超过0.5 mM螯化物如乙二胺四乙酸(EDTA)之溶液。

6.4 核酸样本质量规范

核酸样本A260/A280比值应介于1.65 到 1.8之间。

7. 操作说明

7.1 套组包含对象

见『4.试剂』部分

7.2 套组未包含之必需使用对象

7.2.1 聚合酶链锁反应

7.2.1.1 Taq 核酸聚合酶(DNA polymerase,5 U/μl) (建议 Fermentas, Cat. #EP0401 or EP0402)

7.2.1.2 蒸馏水或核酸稀释液(TE Buffer)

7.2.1.3 可调式微量分注器(pipette)

7.2.1.4 抛弃式微量分注器管尖(tip)

7.2.1.5 震荡混合器(Vortex)

7.2.1.6 桌上型离心机

7.2.1.7 荧光PCR仪Applied Biosystems Prism 7000/7300/7500、Stratagene Mx3000p/3005p

7.3 样本前处里

见『6. 样本收集及前处理』部分

7.4 试剂/设备

7.4.1 为避免污染及重复冷冻解冻影响测试正确性,请将Master 缓冲依使用习惯进行分装,每个反应需3μl的Master 缓冲液,建议每次至少进行4个以上

的测试。

7.4.2见『5. 设备需求』部分

7.5扩增反应

7.5.1从冰箱中取出核酸样本及HLA-B*1502分型试剂套组并回复至室温 (20-25o C)。

7.5.2待核酸样本完全溶解后以震荡混合器混合均匀,于桌上型离心机短暂离心使所有液体沉降至管底。

7.5.3打开B1502分型试剂套组包装,包装内共有1管主反应液及数排分型反应8连管(MIX1,MIX2,MIX3)。每份样本每次测试时需同时进行

MIX1,MIX2,MIX3三管反应。

7.5.4从冰箱中取出Taq核酸聚合酶(DNA polymerase, 5 U/μl)置放于冷冻盒上。

7.5.5每个反应配制方式如下:取2.5μl主反应液、8μl灭菌水至新的离心管中,加入0.5 μl Taq核酸聚合酶,盖上盖子后以震荡混合器混合均匀,于桌上型

离心机短暂离心使所有液体沉降至管底。

7.5.6取11 μl的上述混合液至各反应管中,注意避免液体附着于管壁上。

7.5.7每个反应管加入4 μl核酸样本或阳性对照,确认样本与上述混合液充分混合均匀。

7.5.8将反应管盖上盖子后放入荧光PCR仪中。

8. 实验结果

8.1 结果判读

注1: Indicates as B*1502, B*1588, B*1589, or B*9521

注2:如还是同样结果则判定为阴性

8.2 操作规范

8.2.1仅严格遵守本说明书规范所得到之测试结果方被认可为

有效的测试数据。

8.2.2本套组所有使用的仪器设备包括荧光PCR仪及微量分注器

(pipette)等皆需依照规定进行校正。

8.2.3本摩根人类主要组织兼容性抗原分子特异性引物片段

HLA-B*1502分型试剂所使用的Taq核酸聚合酶(DNA

polymerase) 以Fermentas厂牌为标准,使用其它厂牌之Taq

核酸聚合酶可能造成非专一性的伪阳性结果。

8.2.4核酸样本的质量及含量必须在规定的范围内,且必须依照

说明以适当的条件进行保存。

8.2.5以本摩根人类主要组织相容性抗原分子特异性引物片段 HLA-B*1502分型试剂所得测试结果不得作为临床诊断依

据。

9. 参考文献

1.Cruse JM and Lewis RE, 1998, Atlas of Immunology. CRC Press: 77-97

2.Brewerton D.A., Hart F.D., Nicholls A., Caffrey M., James D.C., Sturrock R.D. Ankylosing spondylitis and HLA B27. Lancet 1:904-907, 197

3.

3.Schlosstein L., Terasaki P.I., Bluestone R., Pearson C.M. High association of an HLA antigen, W27 with ankylosing spondylitis. New England Journal of Medicine

288:704-706

4.Newton, C.R., Graham, A., Heptinstall, E., Powell, S.J., Summers, C., Kalsheker, N., Smith, J.C., and Markham, A.F. Analysis of any point mutation in DNA. The

amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Research 17:2503-2516, 1989.

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