DPPH和ABTS、PTIO自由基清除实验-操作图解-李熙灿-Xican-Li

DPPH?和ABTS+?自由基清除实验（含PTIO?自由基清除实验)：详细说明与疑难解答

李熙灿（广州中医药大学中药学院, 2019.7）

（以下内容系来源于实验经验及三个参考文献[1]Li, X., Comparative Study of 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl Radical (DPPH?) Scavenging Capacity of the Antioxidant Xanthones Family. Chemistryselect, 2018. 3,13081-13086. [2]Li, X.; Ouyang, X.; Cai, R.; Chen, D. 3’,8”-Dimerization Enhances the Antioxidant Capacity of Flavonoids: Evid ence from Acacetin and Isoginkgetin. 2019, Molecules. 24, 2039. [3]Li, X.C., 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl

3-Oxid e (PTIO?) Radical Scavenging: A New and Simpl e Antioxidant Assay In Vitro. J. Agric. Food Chem., 2017. 65,6288-6297

【概述】DPPH?、ABTS+?、PTIO?自由基三者，都是常用的自由基。概述如下表：

工作液外观

紫色

墨绿色

蓝紫色

工作液紫外光谱与最大吸收

200

400

6008000.00.51.0

1.5

2.0

2.5

3.0吸光度

波长/nm

519nm

(50 μg/mL)

200

300400

500600700800900

0.00.5

1.0

1.5

2.0

734nm

吸光度

波长/nm

415nm

（0.07mM (NH 4)2ABTS+0.03mM K 2S 2O 8）

200

400

600

800

01

2

吸光度

波长/nm

557nm

(50 μg/mL)

检测波长 519 nm 734nm

557nm （水溶液）

检测原理

当A 519 nm 值减少，表明DPPH·被清除。其清除机制主要是氢转移HAT (hydrogen atom transfer) 当A 734nm 值减少，表明ABTS·+被清除。其

清除机制主要是电子转移ET (el ectron transfer)

当A 557减少，表明ABTS·

+被清除。 其清除机制主要是电子移ET (electron transfer)加质子转移PT (proton transfer)

用途

主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。

主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。 主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。

通过调节缓冲液的pH 值，可以检测其抗氧化机制。

优势

清除速度较快，约30分钟（室温下）。 清除速度较快，约6分钟（室温下）。

（1）水溶性好，与生物相关性强；

（2）是氧自由基，能更好地表往ROS 清除水平；

（3）抗氧化机制明确：pH 值小于5.0时，为电子转移ET 机制。当调节pH 值（如pH=5.0，6.0，7.4）时，其清除能力也随之改变，表明与pH 值有关，也就是说与氢离子（质子）浓

【实验讲解】

1.DPPH?自由基清除实验[1]

1.1 DPPH测试液的配置

取DPPH固体1mg溶于24mL 95乙醇（或无水乙醇、甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。最好避光保存，5小时内用完。取1mL上述步骤配置好的DPPH溶液，加0.5mL 95乙醇（或无水乙醇、甲醇）稀释后，使其吸光度为0.6-1.0之间。若吸光度过大，则继续加溶剂；若吸光度过小，则补加DPPH固体或者原始溶液。

1.2 样品液的配置

样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。溶剂根据样品的极性进行选择，首选甲醇、95乙醇或无水乙醇（尽量与DPPH溶液所用溶剂相同），如不溶可用DMSO。

1.3 预试

取DPPH溶液1.0 mL，加0.5mL相应有机溶剂后，往其中加少量样品液。加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。如果反应缓慢可在37℃烘箱中放置半个小时。

此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。

【如】在预试过程中，发现加样到500 μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则500 μL为该样品液的最大用量。则对于该样品而言，其用量梯度宜设为100 μL、200 μL、300 μL、400 μL、500 μL。

A0值：取DPPH溶液1.0 mL到比色皿中，加对应有机溶剂0.5 mL，稀释混合，测A值，此A值为A0（A0须在0.8-1.0之间）。

A值：取（500-x）μL 有机溶剂到比色皿中，加样品液x μL （x是根据1.3预试结果确定样品液的用量），再加DPPH溶液1.0 mL，混合使反应液总体积为1.5 mL。测A值。

【如】某样品的用量梯度为100 μL、200 μL、300 μL 、400 μL、500 μL，则加样如下：

样品液95乙醇（或无水乙醇）DPPH测试液总体积

0μL 100μL 500 μL

400 μL

1.0 mL

1.0 mL

1.5 mL

1.5 mL

200μL300 μL 1.0 mL 1.5 mL 300μL200 μL 1.0 mL 1.5 mL 400μL100 μL 1.0 mL 1.5 mL 500μL0 μL 1.0 mL 1.5 mL 1.4 最终测量

每测一个用量需要测三个平行数据。

1.5 DPPH?清除率（抑制率）的计算

00

=

100A A

A -?清除率%

(A 0为不加样品时的值；A 为加入样品后的值。)

1.6 使用注意事项 1.6.1 测量前，要先用空白溶剂调零。 1.6.2 将溶液注入比色皿后应当充分摇匀，使颜色均匀分布。 1.6.3 每次使用前后要注意比色皿的清洁。 1.6.4 如果在实验过程中出现A 值大于A 0的情况，则可能是由于样品本身产生的本底吸收所致，此时，应该减去本底吸收的A 值(A 本)。这个A 本值可以通过，加样品但不加DPPH 的方法测得。此时的计算公式为：

00

()

=

100

A A A A --?本清除率%

1.7 疑难解答

问：DPPH 实验测量抗氧化性的原理是什么？

答：DPPH 法于1958年被提出，广泛用于定量测定生物试样、分类药物和食品的抗氧化能力。此法是根据DPPH 自由基有单电子，在519nm 处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有抗氧化剂存在时，DPPH 自由基被清除，溶液颜色减淡，其褪色程度与其被清除程度（即吸光度的改变）成定量关系，因而可用分光光度计或酶标仪进行快速的定量分析。 问：DPPH 自由基被清除的机制是什么？

答：DPPH 自由基的清除过程主要涉及到氢转移（HAT ），简要过程如下（以1,3,5,8-四羟基氧杂蒽酮为例）：

问：实验中的溶剂应该怎么确定？

答：优先选用甲醇、95乙醇或无水乙醇溶解DPPH固体和样品，若样品难溶于水和醇，再考虑DMSO等溶剂。值得注意的是，实验中应该尽量保证样品溶液和DPPH溶液使用相同的溶剂。另两个实验（ABTS+?清除和PTIO?清除）同理。

问：样品的浓度一定要设置成1mg/mL吗？

答：不同样品清除DPPH自由基的活性可能相差很大，为了保证结果的准确，应该尽量使样品的五个浓度点对DPPH?清除率均匀分布在0-100%之间，因此1mg/mL只是一个大概数值，实验中要根据预试结果进行调整。由于1 mg/mL这个数字方便稀释和计算，因此在这里统一写作1mg/mL。另两个实验（ABTS+?清除和PTIO?清除）同理。

问：测量完成后怎么计算IC50？

答：IC50值是指清除50%的自由基，所需要的样品的最终浓度。有两种计算方法。

第一，以实验所得的抗氧化剂浓度为横坐标，清除率为纵坐标，然后计算线性回归方程。将清除率50%代入方程中求得对应的横坐标值即为IC50值，注意最终结果将三次或三次以上的平行试验取平均值。第二，通过浓度曲线的图直接读出。在50%处画一横线，此横线与曲线的模拟线的交点的对应的横坐标，即IC50.

另两个实验（ABTS+?清除和PTIO?清除）同理。

问：为什么要用Trolox作为阳性对照？

答：维生素E（生育酚）是常见的抗氧化剂。不过，维生素E难溶于水，而且易变质。为此，化学家将其结构进行修饰，即得Trolox（化学名称：6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸）。Trolox不仅溶于水，而且易溶于有机溶剂，所以，广泛地用作抗氧化剂的阳性对照物。亦称水溶性维生素E。为了方便对比评价所测物质的抗氧化能力，通常采用Trolox作为DPPH自由基清除实验的阳性对照品。另两个实验（ABTS+?清除和PTIO?清除）同理。

问：为什么会出现清除率为负值的情况？

答：样品的活性太弱，所以，加入的样品的量较多；如果这个样本身在519nm处有吸收的话，就会产生一个可观的A值，导致A>A0,清除率为负。

问：DPPH?清除率会大于100%吗？

答：不可能。

1.8实例

茶黄素清除DPPH?

量效曲线图(Microcal Origin 绘制)：

D P P H 清除率 %

最终浓度 μg/mL

2. ABTS·

+自由基清除实验[2] 2.1 溶液配制 2.1.1 ABTS 二铵盐储备液(7.4 mmol/L)：取ABTS 二铵盐 3 mg ，加蒸馏水0.735mL 。（MW ＝548.7） 2.1.2 过二硫酸钾（K 2S 2O 8）储备液(2.6 mmol/L)：取K 2S 2O 8 1mg ，加蒸馏水1.43 mL 。（MW ＝270.32） 2.1.3 取0.2mL ABTS 二铵盐储备液和0.2mL K 2S 2O 8储备液混合，黑暗环境下室温放置12小时，用pH7.4磷酸盐缓冲液将混合液稀释10-20倍直至吸 光度为0.70±0.02，此溶液即为ABTS?+自由基工作液。（注：也可以用95乙醇或无水乙醇，但必须是原装分析纯试剂，回收或重蒸者均不可用。） 2.2 样品液的配置 样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1 mg/mL 浓度。溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO 。 2.3 预试 取ABTS?+自由基工作液0.8 mL ，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。如果反应缓慢，可在37℃烘箱中放置半个小时。此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。

【如】在预试过程中，发现加样到100 μL 时，ABTS?+自由基工作液颜色基本褪去，则100 μL 为该样品液的最大用量。则对于该样品而言，其用量梯度宜设为20 μL 、40 μL 、60 μL 、80 μL 、100 μL 。

A 0值：取ABTS?+自由基工作液800 μL 加入到比色皿中，加95乙醇（或无水乙醇）200 μL ，稀释混合，测A 值，此A 值为A 0（A 0宜在0.70±0.02）。

A 值：取（200-x ）μL 95乙醇（或无水乙醇）加入到96孔板中，加样品液 x μL （x 是根据2.3预试结果确定样品液的用量），再加ABTS?+自由基溶液800 μL ，混合使反应液总体积为1 mL ，测A 值。

【如】某样品的用量梯度为20 μL 、44 μL 、 60 μL 、80 μL 、100 μL ，则加样如下：

样品液 95乙醇（或无水乙醇） ABTS?+自由基溶液 总体积 0 μL 20 μL 200 μL 180 μL 800 μL 800 μL 1000 μL 1000 μL 40 μL 160 μL 800 μL 1000 μL 60 μL 140 μL 800 μL 1000 μL 80 μL 120 μL 800 μL 1000 μL 100 μL 100 μL 800 μL 1000 μL

2.4 最终测量

参照2.3节，每个浓度平行测三次。 2.5 ABTS?+清除率（抑制率）的计算

00

=

100A A

A -?清除率%

(A 0为不加样品时的值；A 为加入样品后的值。)

2.6疑难解答

问：ABTS?+清除实验测量抗氧化性的原理是什么？

答：ABTS二铵盐, 中文名：2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐，它与过二硫酸钾(K2S2O4)反应，可以生成绿色的ABTS?+自由基。该自由基在734nm 有最大吸收，所以，通过检测734 nm的吸光度，可以测定其浓度。一个物质加入到ABTS?+自由基工作液后，如果734nm的吸光度降低，则说明该物质具有自由基清除活性，属于抗氧化剂。该法称为ABTS自由基清除法，可以用评价植物（或中草药抽提物）、纯化合物的抗氧化能力。

问：ABTS?+自由基被清除的机制是什么？

答：由于ABTS?+自由基是一种带正电荷的自由基，因此它可以从抗氧化剂分子中获得一个电子形成稳定的中性分子，故ABTS?+自由基被清除主要涉及到电子转移(ET)机制。

问：ABTS?+自由基工作液如何配制？

答：需要用ABTS二铵盐与过二硫酸钾反应12小时才能配制。

2.7实例

仙鹤草酚B清除ABTS?+

2.0 1.0000 0.169 69.1793

67.7204 2.37 0.17 68.9970

0.192 64.9848

2.5 1.2500 0.103 81.2158

80.1216 0.95 0.112 79.5745

0.112 79.5745

量效曲线图：

3.PTIO?自由基清除实验[3]

3.1PTIO?测试液的配置

3.1.1 取PTIO固体3 mg溶于20 mL蒸馏水1中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀，得“PTIO测试液”。（PTIO M.W. 233.3）

3.1.2 用空白溶剂调零后，取800 μL “PTIO测试液”和200 μL缓冲液或甲醇（与PTIO溶液中的溶剂保持一致）于比色皿中，在557 nm处测A值，即得A0值。A0在0.2-0.6之间。

3.2样品液的配置

样品用缓冲液或甲醇、乙醇溶解，配成1 mg/ml浓度的溶液，可适当超声使之完全溶解。如果溶解性差，浓度小于1 mg/ml也可以。

3.3预试

3.3.1 取“PTIO测试液”800 μL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，不能立即褪色时则37℃水浴2小时后再观察，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。

3.3.2 此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。（如，在预试过程中，发现加样到200 μL时，PTIO 溶液颜色基本褪去，则200 μL为该样品液的最大用量。则对于该样品而言，其用量梯度宜设为0 μL、40 μL、80 μL、120 μL、160 μL、200 μL）。

3.4A值测量

用移液枪取“PTIO测试液”800 μL加入到比色皿中，加样品液x μL （x是根据3.3 预试结果确定样品液的用量），再加（200-x）μL 甲醇混合，37℃水浴（或烘箱）30分钟或更久后，测A557nm值。

【如】某样品的用量梯度为0μL(测出的A即A0值)、40 μL、80 μL、120 μL、160 μL、200 μL，其加样表如下：

样品液甲醇（或水）PTIO测试液总体积

0 μL200 μL800 μL1000μL

40 μL160 μL800 μL1000μL

80 μL120 μL800 μL1000μL

120 μL80 μL800 μL1000μL

160 μL40 μL800 μL1000μL

200 μL0 μL800 μL1000μL

3.5最终测量

参考3.4的操作，每测一个用量需要测3个平行数据。

3.6PTIO?清除率（抑制率）的计算

1用水（缓冲液）溶解PTIO时，检测波长为557nm。也可以用甲醇、DMSO溶解，此时检测波长均为585nm。

00

=

100A A

A -?清除率%

(A 0为不加样品时的值；A 为加入样品后的值)。 3.7 疑难解答

问：PTIO ?清除实验测量抗氧化性的原理是什么？

答：PTIO 溶解后为紫色溶液，当有抗氧化剂清除PTIO 时，溶液的颜色会减淡，通过测量吸光度的改变可以测量物质的抗氧化性。 问：PTIO 被清除的机制是什么？

答：PTIO 自由基能够在不同pH 的水缓冲溶液中稳定存在，当溶液pH ＜5.0时，PTIO?清除主要涉及到电子转移（ET ），当调节pH 值（如pH=5.0，6.0，7.4）时，其清除能力也随之改变，表明与pH 值有关，也就是说与氢离子（质子）浓度有关，据此，可证明其涉及PT 机制。 问：PTIO 为什么比DPPH 自由基难清除？

答：因为PTIO?比DPPH?自由基稳定。所以，一般需要2小时才可以清除，当然，活性好的样品，很快也可以发生清除反应，并褪色。为了较好的实验效果，可以考虑加热或延长反应时间。

3.8 实例

P T I O ? s c a v e n g i n g p o w e r /(%)

Trolox 清除PTIO ?自由基的浓度曲线图：(A)pH 4.5， (B)7.4.

The value is expressed as mean ± SD (n = 3).

参考文献

[1]

Li, X., Comparative Study of 1,1-Diphenyl-2-picryl-

hydrazyl Radical (DPPH?) Scavenging Capacity of the Antioxida

nt Xanthones Family. Chemistrysel

ect,

2018. 3,13081-13086.

[2]Li, X.; Ouyang, X.; Cai, R.; Chen, D. 3’,8”-Dimerization Enhances the Antioxidant Capacity of Flavonoids: Evidence from Acacetin and Isoginkgetin. 2019, Molecules. 24, 2039.

[3]Li, X.C., 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-Oxide (PTIO?) Radical Scavenging: A New and Simple Antioxidant Assay In Vitro. J. Agric. Food Chem., 2017. 65,6288-6297

羟基自由基清除注意事项

一般而言，对于Fenton试剂与有机化合物氧化能力的影响因素大致上可分为： A.亚铁离子浓度。 B.过氧化氢浓度。 C.溶液于反应时的反应温度。 D.溶液中的pH值。 以下将对此四项变因做详细的探讨： A.亚铁离子浓度的影响 在Fenton试剂的反应中，亚铁离子主要是扮演着催化过氧化氢的角色。因此，若溶液中没有亚铁离子当触媒，则其溶液可能就没有氢氧自由基的生成。所以，大致上分解反应会随亚铁离子的浓度增加而加快，亚铁添加量会影响脱色效率，亚铁剂量愈高效果愈佳，此原因为增加亚铁剂量将使氧化反应更加完全并且可产生混凝机制而进行脱色(26)。但亚铁离子本身会与有机物形成竞争，亚铁离子浓度过高会增加氢氧自由基的消耗，反而造成处理效果的下降，反应式如下： Fe2+ + ·OH Fe3+ + OH- 故当浓度到达某一定值时，则其分解速率便不会在随着亚铁离子浓度的增加而持续加快，且亚铁离子浓度和生成物的比值也将可能会影响生成物的分布。一般而言，亚铁离子浓度皆维持在亚铁离子与其反应物之浓度比值为1：10-50(wt/wt)。 此外，亚铁在Fenton程序中除了扮演催化过氧化氢的角色外，亦具有混凝的功能，因此过量的铁离子加入将会造成过度的混凝，降低Fenton程序处理的效果，其可能的反应如下所示: B.过氧化氢浓度的影响 反应过程中，过氧化氢的浓度会直接影响氧化有机物的效果。一般而言，随着过氧化氢添加量的增加，有机物的氧化效果亦将随之提升，并且过氧化氢的添加浓度不同，则分解反应生成的产物将会有所差异。大致而言，在过氧化氢浓度越高的情况下，则其氧化反应产物，将会更趋近于最终产物。但是，当溶液中的过氧化氢浓度过高时，反而会使过氧化氢与有机物竞争氢氧自由基，而造成反应速率的结果可能不如预期一般增加。此外，当Fenton试剂系统中过氧化氢浓度远高于亚铁离子浓度时，Fenton法所产生的氢氧自由基会与过氧化氢反应产生perhydroxyl radical (HO2．)及一系列反应，且三价铁离子会与HO2．进行氧化还原反应生成superoxide radical anion (O2．)，造成过氧化氢消耗量的增加，过量的过氧化氢加药量并不必然增加氢氧自由基的浓度，氢氧自由基达到稳定浓度所需反应时间随加药量增加而增加(27)。因此，若以连续之方式加入低浓度之过氧化氢，减少因为过氧化氢初始浓度过高所导致的抑制效应，亦可得到较好的氧化效果。 C.温度的影响 根据Arrhennius' Law：k=k0exp(-Ea/RT)可得知温度的改变会影响活化能及反应速率常数，进而影响反应速率。 对于Fenton试剂反应而言，一般若选用的反应温度条件是在小于20℃以下时，其对有机物的氧化速率将会随温度升高而加快。但是，倘若将其反应的温度升高至40-50℃时，其Fenton反应将会可能因为温度过高，进而使过氧化氢自行分解成水与氧(2H2O2 → 2H2O + O2 )，造成Fenton试剂对氧化有机物之反应速率减慢。 因此，当过氧化氢浓度超过10-20 g/L时，在其经济与安全的考量下，应谨慎选择适当的温度。在一般商业应用上，通常皆将其反应的温度设定在20-40℃之间。 D. pH值的影响 于Fenton试剂反应中，其反应溶液之pH值对Fenton法之影响，关系到铁离子错合效应、铁

DPPH自由基清除法

DPPH自由基清除法 李熙灿/Xican Li （广州中医药大学） [文献] Xican Li, Jing Lin, Yaoxiang Gao, Weijuang Han, Dongfeng Chen. Antioxidant activity and mechanism of Rhizoma Cimicifugae. Chemistry Central Journal. 2012; 6(1):140. [原理] DPPH（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。分子中，由于存在多个吸电子的-NO2和苯环的大π键，所以，氮自由基能稳定存在。 N 2 2 当DPPH自由基被清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小。DPPH这种稳定的自由基为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。 [实验步骤] 1.1 DPPH测试液的配制 取DPPH 1mg溶于约20mL溶剂（乙醇、95乙醇或甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。取1mL 该DPPH溶液，在519nm处测A值，使A＝1.2-1.3之间最佳。该DPPH溶液最好避光保存，3.5小时内用完。 1.2 样品液的配制 样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO。 1.3 预试 取DPPH溶液2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。 此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。 【如】在预试过程中，发现加样到200μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则100μL为该样品液的最大用量。其用量梯度宜设为40、80、120 、160、200μL。 1.4测量 A0值的测量：取DPPH溶液2 mL加入到小试管（或玻璃瓶）中，加95乙醇（或无水乙醇）1mL，充分混合，测A值（519nm），此A值为A0（A0多在0.7-0.9之间）。 A值的测量：取DPPH溶液2mL加入到小试管（或玻璃瓶）中，加样品液xμL （x是根据1.3 预试结果确定样品液的用量），再加（1000 -x）μL 95乙醇（或无水乙醇），混合，静置30分钟后，测A值（519nm）。如：某样品的用量梯度为40、80、120 、160、200μL，则加样表如下： 表1 加样表 1.5 正式测量

超氧自由基清除能力测定法-操作图解

超氧自由基（·O2-）的清除能力测定法（连苯三酚自氧 化法） （适用于：SOD及各种抗氧化剂） 操作图解 具体方法 1 溶液配制 1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。 1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。 1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA） 40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。用pH 计测量，pH应为7.4。用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。 1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中） 取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。再往里加连苯三酚14.6 mg (M。W.126.1 )，即得。（当天有效,以上为1个样品的用量）。 2 测试液 2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。（空白参比：Tris-HCl 缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。此时的ΔA为ΔA0。 3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。（空白参比：Tris-HCl缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。此时的ΔA为ΔA样。 3 计算公式

清除自由基能力的研究概况

清除自由基能力的研究概况 陶涛 （西南林业大学林学院农学（药用植物）昆明 650224） 摘要：自由基及其诱导的氧化反应是导致生物衰老和某些疾病如癌症、糖尿病、一心血管疾病等的重要因素。乳酸茵作为一种高效、低毒的生物源天然抗氧化荆，正逐步受到食品、制药、化工等领域的广泛关注。就目前国内外常用的乳酸茵抗氧化活性的筛选方法、乳酸茵抗氧化机理的国内外研究进展及未来的发展趋势作一综述。 关键词：自由基；乳酸茵；抗氧化． Study on the scavenging ability of lactic acid bacteria on free radical bstract：Free radical and its inducing oxiditative reaction may CaUSe biological doat and certain diseases such as Cancers，diabetes and the cat- diovascular．The lactic acid baaeria as one ofbiological SOUrCeS oxidation inhibitor is becoming more and more popular in the fields offood．，drug manufacture and chemical industry．This article mainly reviews the screening methods for antioxidative of lactic add bacteria among domestic and foreign countries，the advance of the research progress in lactic add bacteria antioxidative and r∞earch trends in future． 引言 氧化过程可以提供能量．对大多数生物体来说，是维持生命必不可少的一个能量转化过程。但过多的氧化过程会对生物大分子引起损伤．氧化损伤主要是由于自由基和过氧化产物作用于人体而产生的。 自由基(free radicals)27．．称游离基．为人体氧化代谢过程中形成含有一个不成对电子的原子或原子团。人体的自由基主要包括超氧阴离子自由基(o2)、

超氧阴离子清除实验

·O2ˉ自由基清除实验 (1) 实验原理 黄嘌呤氧化酶 黄嘌呤＋H2O+O2尿酸＋H2O2+·O2ˉ 即黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化黄嘌呤转化为尿酸，同时产生超氧阴离子自由基(·O2ˉ)。·O2ˉ与NBT结合后呈蓝色，样品清除能力越大，与NBT结合的·O2ˉ越少，溶液的颜色越浅。 (2)试剂 Xanthine(黄嘌呤): (C5H4N4O2 ), MW=152.1, 6.084mg/100mL(0.4mmol/l) 实际配制：1.216mg/10mL，与NBT等体积混合使用 Xanthine oxidase(黄嘌呤氧化酶)贮液: 1 unit/mL , (溶解酶的溶液要高压灭菌！防止蛋白酶对酶的降解！) 0.05 unit/mL，每次取200uL稀释到4mL(PBS溶解) NBT: (Nitro blue tetrazolium chloride氯化硝基四氮唑蓝), MW=817.65, 黄色19.6236mg/100mL(0.24mmol/l) 实际配制3.925mg/10mL，与Xanthine等体积混合使用 PBS(0.01mol/L,pH=8.0): NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4(无水) 1.44g, KH2PO4 0.24g, 800mL水，用NaOH(1M)调pH到8.0，定容到1000mL。 实际配制500mL。高压灭菌，室温保存。 PBS(0.01mol/L,pH=7.4): 配制同上 Ascorbic acid: MW=176.12 母液为1mg/mL 先两倍逐级稀释5个浓度 实际配制见记录本！ HCl(1M): MW=36.5 310ul/10ml.(36% HCl密度1.18g/ml) 实际配制：800uL浓盐酸+9mL水，于塑料管中4℃保存。 NaOH(1M): MW=40 0.4g/10mL, 存于冰箱 (3) 测定方法 超氧阴离子自由基清除能力的测定参照Bae等人的方法略加改进。样品溶液1-5mg/ml 起始浓度，用于水或50%乙醇溶液。 Bae, S.W., Suh, H.J., 2007. Antioxidant activities of ve different mulberry cultivars in Korea.

DPPH和ABTS、PTIO自由基清除实验-操作图解-李熙灿-Xican-Li

DPPH?和ABTS+?自由基清除实验（含PTIO?自由基清除实验)：详细说明与疑难解答 李熙灿（广州中医药大学中药学院, 2019.7） （以下内容系来源于实验经验及三个参考文献[1]Li, X., Comparative Study of 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl Radical (DPPH?) Scavenging Capacity of the Antioxidant Xanthones Family. Chemistryselect, 2018. 3,13081-13086. [2]Li, X.; Ouyang, X.; Cai, R.; Chen, D. 3’,8”-Dimerization Enhances the Antioxidant Capacity of Flavonoids: Evid ence from Acacetin and Isoginkgetin. 2019, Molecules. 24, 2039. [3]Li, X.C., 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-Oxid e (PTIO?) Radical Scavenging: A New and Simpl e Antioxidant Assay In Vitro. J. Agric. Food Chem., 2017. 65,6288-6297 【概述】DPPH?、ABTS+?、PTIO?自由基三者，都是常用的自由基。概述如下表： 1

紫色墨绿色蓝紫色 2

3

DPPH抗氧化能力测定

DPPH.法测定绿原酸清除自由基能力 2.1 待测液的制备 将绿原酸(纯度56%)、维生素C 和没食子酸分别配制成体积分数为0.1mg/mL 的无水乙醇溶液。 2.1.1 绿原酸母液的配制 称取 9.0 mg 绿原酸，定容到50ml ，即可得到绿原酸的母液0.1mg/mL 。然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。 分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。 2.1.2 Vc 母液的配制 称取 mg VC ，定容到100ml ，即可得到VC 的母液。然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。 分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。 2.1.3 没食子酸母液的配制 称取 mg 没食子酸，定容到100ml ，即可得到没食子酸的母液。然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。 分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。 2.1.4 DPPH 母液的配制 称取 mg DPPH ，用无水乙醇定容到100ml ，即可得到DPPH 的母液。然后，再将所配制的母液按照要求稀释成至一定浓度的溶液。C DPPH = mg/ml 。（建议用0.025mg/mL ） 2.2 DPPH.溶液的可见光谱 以无水乙醇为对照，在分光光度计上对DPPH.溶液进行在440～600nm 下扫描。A max = nm 2.3 抗氧化活性测定 DPPH.是一种稳定的自由基，它的乙醇溶液呈紫色，在可见光区最大吸收峰为 nm 。当DPPH.溶液中加入自由基清除剂时，溶液颜色变浅，517nm 处的吸光度变小，而吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系。因此，可用来检测自由基的清除情况，从而评价某物质的抗氧化能力，其能力用清除率(Scavenging Rate,SR)来表示，清除率越大，抗氧化能力越强 [4.5]。 具体实验步骤及方法： 精确吸取的DPPH.溶液2mL 与2ml 无水乙醇混合均匀后，以相对应的溶剂(4mL 无水乙醇)为对照，用分光光度计测定上述溶液在 nm 处的吸光度值(A 0)。 A 0= 2.3.1 绿原酸样品溶液的抗氧化能力测定 精确吸取上述不同浓度的绿原酸溶液2mL ，分别与浓度 mg/ml 的DPPH.溶液2mL 混合，摇匀后放置30min 。以相对应的溶剂(无水乙醇)为对照调零，用分光光度计分别测定上述溶液在 nm 处的吸光度值(A i )，分别测得A i 值。 A 1 ；A 2 ；A 3 ；A 4 ；A 5 ；A 6 ；A 7 。 精确吸取上述不同浓度的绿原酸溶液2mL ，分别与2mL 无水乙醇混合均匀后，以无水乙醇为对照，用分光光度计分别测定各混合液在波长 nm 处的吸光度值(A j )，分别测得A j 值。 A 1 ；A 2 ；A 3 ；A 4 ；A 5 ；A 6 ；A 7 。 将以上数据代入下列公式计算其清除率。 清除率SR(％)=%100A A A 10j i ???? ? ?? -- 其中， A i ：为2mL 绿原酸、维生素C 和没食子酸与 2mL 的DPPH.溶液混合后在波长 nm 处的吸光度值； A j ：为2mL 绿原酸、维生素C 和没食子酸分别与2mL 无水乙醇溶剂混合后在波长 nm 处的光值； A 0：2mLDPPH.溶液与2mL 无水乙醇溶剂混合后在波长 nm 处的吸光度值。

氧自由基与氧自由基清除剂依达拉奉

氧自由基与氧自由基清除剂依达拉奉 山东大学齐鲁医院麻醉科（250012）于金贵 一、氧自由基 （一）自由基的概念 自由基（free radical，FR）是指外层轨道上有未配对电子的原子、原子团、分子或离子的总称。因其含有未配对的电子，故化学性质非常活泼，极易与其生成部位的其他物质发生反应，而这种反应的最大特点是以连锁反应的形式进行。氧原子上有未配对电子的自由基称为氧自由基。人体吸入的分子氧，在正常状态下绝大多数（98%）都连接4个电子，它们最终与H+结合，代谢还原为H2O。但有极少数氧（1~2%）在代谢过程中被夺去或接受一个电子而形成活性氧，即氧自由基。 （二）氧自由基的生理作用 氧自由基在生理上是必需的物质，如合成ATP 和前列腺素、中性粒细胞杀灭细菌、酸性粒细胞杀灭寄生虫等过程都必须有氧自由基参与。氧自由基在体内的生成与清除保持动态平衡，且在体内存在时间甚短。由于其化学性极强，反应剧烈，过量产生会对机体造成极大危害。 （三）氧自由基的种类及其作用

1. 超氧化物阴离子：氧自由基连锁反应的启动者，使生物膜、激素和脂肪酸过氧化。 2. 羟自由基（OH∙）：作用最强的自由基，可破坏氨基酸、蛋白质、核酸和糖类。 3. 过氧化氢（H2O2）：过渡型氧化剂，主要使巯基氧化，可氧化不饱和脂肪酸。 4. 单线态分子氧（1O2）：氧分子的激发状态，亲电子性强，在光作用下可由O2直接产生，对细胞有杀伤作用。 5. 其他含氧的自由基如脂质过氧化物（ROOH）：易于分解再产生自由基，腐化脂肪，破坏DNA，可与蛋白质交联使之形成变性交聚物。 （四）机体抗氧化机制 机制一：直接提供电子，以确保氧自由基还原；机制二：增强抗氧化酶的活性，以有效地消除或抵御氧自由基的破坏作用如酶类抗氧化剂超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）；非酶类抗氧化剂如维生素E、维生素C、辅酶Q、还原型谷胱甘肽（GSH）、葡萄糖、含硫氨基酸和不饱和脂肪酸等。 SOD多存在于细胞的线粒体内，作用是将氧自由基歧化，将其一半转变成H2O，另一半转变成O2，从而清除氧自由基。CAT是血红蛋白酶类之一，作用是分解H2O2，并将其清除之。

如何清除体内自由基

如何清除体内自由基 消除体内自由基，应该要了解自由基的来源，从外界到身体内部的代谢一起中和性的描叙不要单方面的讲叙体内各种酶与自由基之间的关系 人体内的自由基有两个来源：其一是来自环境，如环境污染、食品污染、过度的紫外线照射和各种辐射、杀虫剂、室内外废气、吸烟、二手烟、酗酒、工作压力、生活不规律等等，都会直接导致人体内产生过多的自由基（活性氧）；食品添加剂、食用脂肪和熏炸烤肉、某些抗癌药物、安眠药、抗生素、有机物腐烂物、塑料用品制造过程、油漆干燥挥发、石棉粉尘、空气污染、化学致癌物、大气中的臭氧等也都能诱发人体内产生自由基。 其二是来自体内，人体内组织细胞的新陈代谢也会产生自由基，这是人体代谢过程的正常产物，十分活跃又极不稳定，它们会附着于健康细胞之上，再慢慢瓦解健康细胞，而被破坏的细胞则又再转而侵害更多健康的细胞，如此恶性循环从而导致人体的衰老和疾病的发生。另外，组织器官损伤后的缺血一段时间后又突然恢复供血(即重灌流)，如心肌梗塞、脑血栓、外伤、外科手术后，自由基会大量生成。正常人体有一套清除自由基的系统，但这个系统的力量会因人的年龄增长及体质改变而减弱，致使自由基的负面效应大大增强，引起多种疾病发病率的提高。活性氧自由基对人体的损害实际上是一种氧化过程。因此，要降低自由基的损害，就要从抗氧化做起。 听说过抗氧化剂吗？它对人体的健康可是有着密切的关系。既然自由基不仅存在于人体内，也来自于人体外，那么，降低自由基危害的途径也有两条：一是，利用内源性自由基清除系统清除体内多余自由基；二是发掘外源性抗氧化剂——自由基清除剂，阻断自由基对人体的入侵。 大量研究已经证实，人体内本身就具有清除多余自由基的能力，这主要是靠内源性自由基清除系统，它包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等一些酶和维生素C、维生素E、还原型谷胱甘肽、β-胡萝卜素和硒等一些抗氧化剂。酶类物质可以使体内的活性氧自由基变为活性较低的物质，从而削弱它们对肌体的攻击力。酶的防御作用仅限于细胞内，而抗氧化剂有些作用于细胞膜，有些则是在细胞外就可起到防御作用。这些物质就深藏于我们体内，只要保持它们的量和活力它们就会发挥清除多余自由基的能力，使我们体内的自由基保持平衡。 要降低自由基对人体的危害，除了依靠体内自由基清除系统外，还要寻找和发掘外源性自由基清除剂，利用这些物质作为替身，让它们在自由基进入人体之前就先与自由基结合，以阻断外界是自由基的攻击，使人体免受伤害。在自然界中，可以作用于自由基的抗氧化剂范围很广，种类极多。目前，国内外已陆续发现许多有价值的天然抗氧化剂。如β－胡萝卜素（维生素A）、维生素C、维生素E、番茄红素、辅酶q10、等等。此外，我国很多中草药植物中的有效成分都是天然抗氧化剂，例如，银杏黄酮、甘草黄酮等，另外还有巴西菇、灰树花、茯苓、黄芪、丹参、银杏、枸杞、灵芝、人参......。 吃什么可以减少体内自由基 在正常的生命过程中，自由基为维持生命所必需。体内自由基不断产生，也不断地被清除，两者 处于动态平衡之中，使之维持在一个正常的生理水平上。自由基在生物体内具有参与吞噬病原体，参 与前列腺素和凝血酶原的合成、解毒，参与体内部分生化反应和胶原蛋白的合成，调节细胞增殖与分化，参与机体免疫和环核苷酸的生物合成，以及生殖和胚胎发育等重要的生理功能。但是当自由基过 量时，自由基在机体内损伤蛋白质、核酸和生物膜，导致细胞凋亡，并参与许多疾病的发病过程。 由基清除剂即抗氧化剂清除机体自由基，保护机体免受氧化损害中起重要作用。因此，近年来对 自由基清除剂的研究备受关注。多吃点抗氧化剂食物有利于减少体内多余自由基。 方法/步骤 1.全面复方自由基清除剂：葡茶多酚胶囊。适当吃葡茶多酚可以全面清除体内多余自由

DPPH自由基SOP

主要目的： ——为了测定样品清除DPPH自由基的能力。 主要原理： ——自由基清除剂与DPPH单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用酶标仪进行快速的定量分析。 实验室签章

一、试剂 ——1 ,1-二苯基-1-苦味肼基自由基（DPPH）——甲醇（分析纯） 二、仪器设备 ——96孔酶标板 ——UV-Vis可见多功能酶标仪 ——移液枪 ——200 μL量程枪头

三、实验方法 ◆前期准备 配置2 g/L 的DPPH甲醇标准溶液。 ◆DPPH自由基清除能力 参照Brand-Williams (1995)[1]报道的方法，将其稍加改动后应用在96孔酶标板中[2]。在酶标板的每孔中，依次加入不同体积（10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 μL）的样品溶液和200 μL的DPPH标准溶液（2 g/L），最后用甲醇溶液补齐至总体积300 μL。 室温反应30 min后，于515 nm下用UV-Vis可见多功能酶标仪测定其吸光度（EL 340, Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA）。番茄样品消除自由基的能力表示为EC50（清除1 μg DDPH至50 %所需的样品用量（μg干重））。 EC50越小，表示抗氧化活性越高。平行测定三次，取平均值计算。 清除DPPH自由基能力用如下公式计算： 清除率%=（1- Ac Aj Ai ）×100% 其中：Ai为样品溶液加DPPH试剂混合液的吸光度，Aj为样品溶液加甲醇的吸光度，Ac为DPPH溶液加样品溶剂的吸光度。 [1] Brand-Williams W, Cuvelier M E. Berset C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity [J]. LWT - Food Science and Technology, 1995, 28(1): 25-30. [2] Verma A R, Vijayakumar M, Rao C V. Mathela C S. In vitro and in vivo antioxidant properties and DNA damage protective activity of green fruit of Ficus glomerata [J]. Food and Chemical Toxicology, 2010, 48(2): 704-709.

羟基自由基清除能力测定法的简易操作图解-脱氧核糖降解法-脱氧核糖分析法

羟基自由基(·OH)清除能力测定法的简易操作图解 （适用于各种抗氧化剂） 文献来源 [1] Xican Li. Solvent effects and improvements in the deoxyribose degradation assay for hydroxyl radical-scavenging. Food Chemistry, 2013, 141(3):2082-2088. 操作图解 图1 羟基自由基(·OH)清除能力测定法（脱氧核糖降解法）的实验操作图 具体方法 1 溶液配制 0.2 MKH2PO4溶液: 100mL蒸馏水+2.7218g KH2PO4。 0.2 M Na2HPO4溶液: 500mL蒸馏水+35.814g Na2HPO4·12H2O。 磷酸盐KH2PO4－Na2HPO4缓冲液phosphate buffer（0.2M, pH7.4, 100mL）：19mL0.2 MKH2PO4+ 81mL 0.2 MNa2HPO4. （注意：19：81是大概的体积比，具体的比例以pH=7.4为准）。 Na2EDTA溶液：（1mM, 25mL）：8.4 mg+25mL蒸馏水。 FeCl3溶液：（3.2mM, 5mL）：4.2 mg+5mL蒸馏水。 抗坏血酸溶液：（1.8mM, 50mL）：15 mg+50mL蒸馏水。 H2O2溶液：（50 mM,5mL）：30 mg 30% H2O2+5mL蒸馏水。 脱氧核糖溶液：（50 mM, 2 mL）：15 mg脱氧核糖+2 mL蒸馏水(该用量约可做40个数据) 。 三氯乙酸溶液TCA（10%, 10 mL）：1 g + 10 mL蒸馏水。 硫代巴比妥酸溶液TBA：（5%, W/V, 20mL）:取1gTBA+20mL蒸馏水+20mgNaOH (临用时配，超声溶解. 该用量可做40个数据) 。 样品溶液：选合适的溶剂（如甲醇、无水乙醇等），先配成1mg/mL的溶液试试。 2 操作方法与注意事项 2.1 操作方法（见图1） 2.2 注意事项 1 测试前，一定要检查试管是否干净，不净的试管不能用。正式测试前,盛装样品的容器(小瓶或试管) 必须用铬酸洗液洗净。 2 样品溶液加入到试管后，先彻底挥干溶剂，再用样品的残渣，进行实验检测（见：操作图解）。这一步至关重要，因为有机溶剂都会产生数十倍的干扰。其原因中文献[1]已做详细说明。 3 最后显色时，如颜色太淡，可能是加热温度不够高； 4 加样：在10μL以下最好用进样针，插到瓶底；取样：力保均匀。 5 如平行样之间差别太大，系混合不均所致。两次水浴前，都要充分振荡。振荡时，用保鲜膜盖住管 口上下剧烈振荡。

(完整版)抗氧化试验方法

一、试验方法 1、DPPH自由基清除率的测定 本实验采用1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)法测定样品清除自由基活性。 1.1实验原理 1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)）是一种稳定的以氮为中心的自由基，其乙醇溶液显紫色，最大吸收波长为517nm。当DPPH 溶液中加入自由基清除剂时，其孤对电子被配对时，吸收消失或减弱，导致溶液颜色变浅，显黄色或淡黄色，在517nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，故该法可用清除率表示，清除率越大，表明该物质清除能力越强。 1.2溶液的配制 0.08mmol/L DPPH溶液的配制：精密称取DPPH8.0mg，用无水乙醇溶解并定容至200ml棕色容量瓶中，得浓度为0.004%的DPPH溶液，避光保存，备用。 1.3实验步骤：分别取不同浓度的各样品溶液（0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml）1.0ml，置10ml离心管中，加入3.0ml的DPPH溶液，室温避光反应30min，同时以无水乙醇为空白，于517nm波长处测定吸光值。按下列公式计算DPPH自由基清除率。 DPPH自由基清除率（%）= A0-(A s-A c)/ A0×100% 公式中，A0—1.0ml蒸馏水+3.0mlDPPH溶液的吸光度值 A s—1.0ml样品溶液+3.0mlDPPH溶液的吸光度值 A c—1.0ml样品溶液+3.0ml无水乙醇的吸光度值

将实验重复三次，求得清除率的平均值。 2、总的抗氧化活性的测定 总的抗氧化活性实验采用改良后的Prieto法。 2.1实验原理：磷钼络合物测定方法的原理是Mo(VI)被抗氧化物质还原成绿色的Mo(V)络合物，其最大吸收波长为695nm。抗氧化物质活性越强，测定的吸光度值越大。此方法操作简单，所用试剂低廉、方法重现性好，非常适合抗氧化性的测定。 2.2溶液的配制 样品液:同上 磷钼试剂:0.6mol/L浓硫酸溶液、28mmol/L磷酸钠溶液和4mmol/L钼酸胺溶液混匀，即得。 2.3实验步骤 分别取不同浓度的各样品溶液（0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml）1.0ml，置10ml 离心管中，加入3.0ml试剂溶液（试剂溶液中包括0.6mol/L的硫酸、28mmol/L 的磷酸钠、4mmol/L的钼酸铵）。混合液于95℃水浴锅中分别水浴30min，60min、90 min、120 min、150 min。 放冷至室温，695nm处测吸光度值。以蒸馏水为空白，吸光度值越大，表明抗氧化能力越强。BHT做为阳性对照。将实验重复三次，求平均值。 三、还原力的测定 3.1 实验原理 以普鲁士蓝[Fe4(Fe(CN)6)3] 之生成量作为指标，将六氰合铁酸钾[K3 Fe(CN)6] 还原成K4Fe(CN)6，再利用Fe3+形成Fe4(Fe(CN)6)3，由700nm处吸光

清除自由基研究方法汇总

电子自旋共振法（ESR）、高效液相色谱法、化学发光法、比色法、分光光度法 自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。目前常用超氧阴离子自由基体系（O2-·）、羟基自由基体系（·OH）、二苯代苦味酰基自由基体系（DPPH·）对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进行了研究。 其中ESR法和气相色谱法、HPLC 法对自由基的检测灵敏度高，但对设备要求较高，操作复杂，无法在一般实验室普及。而其中的分光光度法、化学发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器，易于被一般实验室所采用，但测定过程中的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。分光光度法最常用。 原理部分： 1.DPPH·法测试机理 DPPH·（二苯代苦味脐基自由基）的甲醇溶液呈深紫色，可见光区最大吸收峰为492nm。当自由基清除剂加入到DPPH·溶液中时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度减少，而且颜色变浅的程度与配电子数成化学计量关系，因此，可通过吸光度减弱的程度来评价自由基被消除的情况。 2. 羟基自由基（·OH） 1）邻二氮菲法[70]

实验原理：邻二氮菲可与Fe2+形成络合物，此络合物在510nm 处有最大吸收峰，是一常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。H2O2/ Fe2+体系可通过Fenton 反应产生羟自由基，邻二氮菲－Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲－Fe3+后，其510nm 最大吸收峰消失。如果反应体系中同时存在羟自由基清除剂，则Fenton 反应产生的羟自由基将被此清除剂全部或部分清除，邻二氮菲－Fe2+络合物受到的破坏将会随之减少。根据这一原理，可建立以A510变化反映自由基清除剂对羟自由基清除作用的比色测定法。 2）水杨酸法[71] 实验原理：羟自由基易攻击芳环化合物产生羟基化合物，因此可用水杨酸捕集Fenton 反应体系中的·OH，生成的2,3－二羟基苯甲酸用乙醚萃取，用钨酸钠和亚硝酸钠显色，然后用分光光度计测定其在510nm 处的吸光值，此吸光值可反映体系中的羟自由基浓度。 3）甲基紫-Fe2+-H2O2反应体系 测定原理：在Fenton反应的基础上加入甲基紫作显色剂，反应式如下： Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH 甲基紫在酸性溶液中呈现紫色[9],在578nm 处有强吸收。反应产生的·OH 具有高的反应活性，容易进攻高电子云密度点，会与甲基紫中具有高电子云密度的-C=C-基团发生亲电加成反应，使甲基紫褪色。通过测定甲基紫在578nm 处吸光度值的变化可间接测定出·OH 的生成量。当有清除自由基的物质存在时，会阻断甲基紫与·OH 的反应，从而使得甲基紫的颜色有所加重，因此可利用抗氧化剂加入前后溶液吸光度值的变化来评价物质的抗氧化性强弱。

A清除自由基实验方法

1、DPPH 自由基清除实验 取0.2 mL 样品，加入4 mL 醋酸缓冲溶液、3.8 mL 乙醇和2 mLDPPH，混合均匀后室温避光放置30 min，测定在517 nm 处的吸光度A。同理，取0.2 mL 样品、4mL 醋酸缓冲溶液和3.8 mL 乙醇，测定在517nm处的吸光度A b。4 mL 醋酸缓冲溶液、4 mL 乙醇和2 mL DPPH，测定在517 nm 处的吸光度A0。自由基的清除率=[A0-(A－Ab)]/A0。 2、ABTS 自由基清除实验 20 mL 的7 mmol/L ABTS 和352 μL 的140 nmol/L 过硫酸钾混合，在室温、避光条件下静置过夜，形成ABTS＋自由基储备液。该储备液在室温、避光的条件下稳定，使用前用无水乙醇稀释成工作液，要求其在30 ℃、734 nm 波长下的吸光度为0.7±0.02。加入的提取液0.1 mL、ABTS 工作液5 mL，混合均匀后在室温下避光反应10 min 后，在734 nm 处测定吸光度At。ABTS 溶液作空白吸光度为Ar，样品0.1 mL、乙醇5 mL 混合均匀吸光度为A0。 ABTS＋自由基清除率(%)＝[1-(At-A0)/Ar]×100 式中：At 为样品的吸光值；Ar 为空白的吸光值。 3、超氧阴离子清除实验 采用邻苯三酚自氧化法，取4 mL 0.1 mol/L pH8.2 Tris-HCl 缓冲溶液和蒸馏水2 mL，混匀后在25 ℃水浴中保温20min，然后加入样品溶液2 mL，取出后立即加入在25 ℃预热过的5 mmol/L 邻苯三酚0.5 mL(以10 mmol/L HCL 配制，空白管用10 mmol/L HCL 代替邻苯三酚的HCL 溶液)，摇匀后倒入比色皿，325 nm下每隔30 s 测定吸光度，连续测定4 min，计算线性范围内每分钟吸光度的增加。在加入一定体积样品溶液时，减少蒸馏水的体积。 抑制率(%)=(△A0-△A)/△A0×100 式中：△A0 为邻苯三酚的自氧化速率；△A 为加入样品溶液后邻苯三酚的自氧化速率。

清除氧自由基

1、超氧负离子 黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统产生超氧负离子产生超氧负离子 黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、 清除超氧自由基负离子O2- 徐艳,曲婷婷. 甘草消除氧自由基的体外研究[J]. 食品研究与开发,2006,(8). 2、1.2.2NBT 光还原反应中主要试剂的配制 1.2.2.1 测试缓冲液: 0.026 mol/LMet- 磷酸钠缓冲液具体配制方法: 首先配制0.1 mol/LpH7.8Na2HPO4- NaH2PO4缓冲液 a 称取Na2HPO4·12H2O( MW=358.14) 3.581 4 g 于100 mL 小烧杯中, 加少量蒸馏水溶解后, 移入100 mL容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度。 b 称取NaH2PO4·2H2O(MW=156.01)0.780 g 于50 mL小烧杯中, 加少量蒸馏水溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度。 c 量取91.5 mL a 液与8.5 mL b 液混合后, 该液即为0.1 mol/LpH7.8 磷酸钠缓冲液。 d 称取L- Met( MW=149.2) 0.194 1 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量0.1 mol/LpH7.8 磷酸钠缓冲液溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用0.1 mol/LpH7.8 磷酸钠缓冲液定容至刻度。 1.2.2.2 NBT( 氯化硝基四氮唑蓝) 的配制(7.5×10-4mol/L) 称取NBT( MW=817.7) 0.061 3 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量蒸馏水溶解后, 移入100 mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度。 1.2.2.3 核黄素溶液(2×10-5 mol/L) a.称取EDTA( MW=292) 0.002 92 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量蒸馏水溶解。 b.称取核黄素( MW=376.36) 0.073 5 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量蒸馏水溶解。合并 a 液和 b 液, 移入100 mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度( EDTA0.1 mmol,核黄素2 mmol)。贮于冰箱中, 避光保存, 用时稀释100 倍。 1.2.3 甘草提取物溶液的配制 1.2.3.1 甘草酸溶液的配制 称取甘草酸0.05 g 用少量稀醇(10 %乙醇溶液)溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用稀乙醇定容至刻度, 即为 1 g/ mL 的甘草酸溶液。 1.2.3.2 甘草次酸溶液的配制 称取甘草次酸0.05 g 用少量稀醇(10 %乙醇溶液)溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用稀乙醇定容至刻度,即为 1 g/mL 的甘草次酸溶液。 1.2.3.3 甘草总黄酮组溶液的配制

超氧阴离子自由基清除

一．实验原理： 该方法利用NADH-PMS-NBT为超氧阴离子(O2·-)生成系统，超氧阴离子清除剂能减少NBT 的蓝色。通过检测560nm处吸光值可判断体系中还原物质的还原能力。 二．实验仪器：分光光度计 三．实验试剂： 一：液体40mL×1瓶； 二：液体1mL一瓶； 三：粉剂一支； 四：粉剂一支； 五：1mg/mL芦丁标准品，1mL 四．溶液配制： 一工作液：用时加双蒸水360mL，也就是10倍稀释，得到400mL试剂一工作液； 二工作液：用赠送的棕色瓶配制。试剂二工作液由试剂二加上100mL试剂一工作液配得，现配现用，注意避光； 三工作液：试剂三工作液由试剂三溶解于100mL试剂一工作液配得，现配现用； 四工作液：粉剂一支。用50mL双蒸水溶解，摇匀后，取10mL，加入90mL试剂一，配成试剂四工作液，现配现用，用赠送的棕色瓶盛装。注意避光，配好的试剂请于2小时内用完。五工作液：阳性对照，按需配制，-20℃保存。 五．实验步骤： 测定吸光值。

六．清除能力计算： 超氧阴离子自由基清除（%）=[空白孔吸光值-（测定孔吸光值-对照孔吸光值）]/空白孔吸光值*100 注： 1 如未做对照孔，可以将其视作为0； 2 阳性对照求值时将其视作测定孔进行计算即可。 七．注意事项： 1. 如样品中色素物质不是分析对象，建议先通过SEP C18柱进行脱色处理，处理后样品可不做对照孔； 2. 如不确定样品的超氧阴离子自由基清除能力，可先做不同浓度的稀释液进行摸索，并选择适宜浓度进行测定，高浓度下，浓度与清除率间并不线性相关。 3. 试剂三建议全程冰上操作。试剂四切记避光保存，特别是配制后，且应尽快用完。建议在做好一切其它准备工作后再配制试剂四应用液。试剂四正常颜色为黄色，强光照射下，5-10分钟内会变为绿色，随后变为蓝色，变色后试剂不可再用！ 4. 试剂二、三应用液和样品混匀后再加入试剂四，次序颠倒会导致不显色。 5. 部分物质会导致显色加深，导致求得的抑制率是负值，如遇到此类现象请先确定该物质是否具有超氧阴离子清除能力，再考虑更换方法，如邻苯三酚自氧化法等进行测试。

dpph自由基清除测定

dpph自由基清除测定 DPPH法测定黄芩黄酮的抗氧化活性 抗氧化就是任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质，其作用机理可以是直接作用在自由基，或是间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应。 目前对自由基清除剂的研究方法主要有2类，一类是体外模型，另一类是体内模型，其中DPPH法是体外模型中最常用的方法。 DPPH又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基，他的稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。它的无水乙醇溶液呈紫色，在517nm波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。。向其中加入自由基清除剂时，可以结合或替代DPPH?，使自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力。即通过在517nm波长处检测样品清除DPPH?的效果，来计算抗氧化能力。 [1]实验研究表明，黄芩黄酮中清除DPPH自由基活性的主要成分是黄芩苷，黄芩苷中含有羧羟基和酚羟基能与DPPH反应，反应式如下: ONON22 +H+NNONNONNH22 NONO22 DPPH与抗氧化剂反应原理 材料:DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼);无水乙醇; 仪器:分光光度计 1.DPPH贮备液的制备

准确称取DPPH试剂3(5mg，用无水乙醇溶解，并定量转入10mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，取2mL至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0178mmol,L DPPH贮备液，置于冰箱中冷藏备用。 2.试液的制备(只作参考) 准确称取5.2mg干燥的黄酮提取物(32.75%),用无水乙醇溶解，并定量转入 50ml容量瓶中，用无水乙醇定量至刻度，取10ml至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0233mmol,L试液。 3.DPPH?清除率的测定 在10mL比色管中依次加入4.0mLDPPH溶液和黄酮提取液，再加入无水乙醇至刻度，混匀立即用1cm比色皿在517nm波长处测吸光值(A)，吸光值记为Ai，再在温室避光保存30min后测吸光值，记为Aj，对照试验为只加DPPH的乙醇溶液，其吸光值记为Ac。按下式计算自由基清除率(K): K(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]*100% 试验重复三次，取其平均值作为最后结果。 [1].刘玉萍,Purusotam Basnet,小松かっ子,曹晖.黄芩清除自由基活性与黄芩苷含量的相关性研究[J].中国中药杂志,2002,27(8):575-579 药品:DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼); 推荐厂家:上海如吉生物科技发展有限公司; 北京诺博莱德科技有限公司; 报价:380元/瓶;500元/瓶; 规格:1g/瓶; 含量:99%; 产地:日本进口 DPPH稳定性不好，要用时,新鲜配制 DPPH浓度要根据样品的活性来定，一般在20-100μg/mL