不同光照下褪黑素变化对鸡骨髓内c-fos原癌基因表达的影响
?１８６?经验交流中国畜牧兽医２００９年第３６卷第９期
不同光照下褪黑素变化对鸡骨髓内ｃ—ｆｏｓ
原癌基因表达的影响
宋丽霞。刘淑英
（内蒙古农业大学动物科学与医学学院，呼和浩特０１００１８）
摘要：为了找出褪黑素分泌变化与ｃ－ｆｏｓ原癌基因表达之间的关系，本研究控制不同光照时间饲养１日龄雏鸡５０只，取骨髓组织，经免疫组化试验，结果显示：①单核细胞系胞浆出现阳性信号；巨核细胞系、粒细胞系和淋巴细胞系胞核出现阳性信号；红细胞系无阳性信号；②随着光照时间的延长，ｃ－ｆｏｓ原癌基因的表达量呈增长趋势。结果表明，ｃ－ｌｏｓ与骨髓细胞的细胞增殖和分化相关。褪黑素的增高能够显著抑制ｃ－ｌｏｓ原癌基因的表达，且褪黑素的减少能够刺激ｃ－ｌｏｓ的表达。
关键词：褪黑素；ｅ－ｆｏｓ原癌基因；骨髓
中图分类号：ｓ８５２文献标识码：Ａ文章编号：１６７１－７２３６（２００９）０９－０１８６—０３
褪黑素（ｍｅｌａｔｏｎｉｎ，ＭＴ）是新近引起人们广泛注意的天然抗肿瘤药物，对多种恶性或良性肿瘤具有明显抑制作用（梅琦，１９９５）。其抗肿瘤机制可能与直接抑制肿瘤增殖、免疫增强作用及抗氧化作用有关（Ｓａｔｏｍｕｒａ等，２００７；Ｍｏｏｒｅ等，２００２；Ｔｏｍａｓ－Ｚａｐｉｃｏ等，２００５）。ＭＴ毒副作用相对小，且可减少其他抗肿瘤药的毒性（Ａｋａｇｉ等，２００４；Ｌｉｓｓｏｎｉ等，２００３），已成为研究的热点之一。ｃ－ｆｏｓ是原癌基因家族中的一员，它的蛋白质产物参与正常细胞的生长、分化和增殖，但是当ｃ—ｆｏｓ过量表达或出现突变时，就会导致细胞大量增生，出现癌变。笔者通过控制光照的方法改变鸡体内褪黑素的分泌水平，研究褪黑素分泌的变化与ｃ－ｆ０５基因表达之间的关系。１材料与方法
１．１材料ｃ—ｆｏｓ兔抗人多克隆抗体，购自ＬａｂＶｉ—ｓｉｏｎ公司。ＳＰ两步法试剂盒、ＤＡＢ显色液，购自天津津脉公司。１日龄鸡５０只。
１．２方法
１．２．１分组控制光照１日龄鸡适应性喂养１周后分为６ｈ短光照组、１２ｈ对照光照组和１８ｈ长光照组进行喂养。用照度计测得动物饲养室内自然光照强度为８５０Ｉｘ，控制动物饲养室人工光照强度与此相似。其他饲养管理条件相同。喂养３周后处死，取１ｃｍ左右骨髓组织备用。１．２．２免疫组化方法骨髓组织经固定脱水后石蜡包埋，切片厚度为４ｐｍ，６０℃烤片２ｈ后经脱蜡、水化，滴加３％Ｈ。Ｏ。（８０％甲醇）室温静置１０ｍｉｎ。１２８℃高压修复１ｍｉｎ，滴加正常血清封闭液，室温１０ｍｉｎ。甩去多余液体后直接滴加Ｉ抗（３７℃孵育１ｈ），ＰＢＳ洗３次，每次５ｍｉｎ。滴加Ⅱ抗（３７℃孵育３０ｍｉｎ），ＰＢＳ洗３次，每次５ｍｉｎ，ＤＡＢ显色，在显微镜下掌握染色程度。苏木精复染脱水、透明、封片、镜检。
１．２．３结果统计在镜下观察Ｐｆｏｓ基因在骨髓细胞内的表达位置。在镜下随机选择１０个视野，分别算出阳性率（阳性细胞数／总细胞数），取各组的平均值用ＳＰＳＳ软件的ＬＳＤ法进行分析数据处理。
２结果
２．１免疫组化结果骨髓细胞中的棕黄色显色为阳性信号。图１空白对照片没有棕黄色的阳性显色。图２阳性反应片有分散的棕黄色显色的阳性反应。图３为粒细胞。图４为单核细胞，从图中可以看出棕黄色显色在单核细胞的胞浆，胞核呈蓝色，未被染色。图４中箭头２所指为红细胞，可以看出红
收藕日期：２００９—０３一１１
作者简介：宋丽霞（１９８２一），女，内蒙古人，硕士生，主要从事动物生理学研究。
通信作者：刘淑英，博士，教授，主要从事动物生理学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕｓｈｕｙｉｎｇ—ｉｍａｕ＠１２６．ｃｏｒｎ
图ｌ空白对照（１００Ｘ）
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细胞没有被染成棕黄色，而是呈蓝色。图５为淋巴
细胞。图６为巨核细胞。图中显示棕黄色显色位置
在细胞核内，胞浆内没有显色，而是被苏木素染成
蓝色。
图２阳性反应（１００×）
注：冈中箭头指的棕黄色显色是阳性信号。
图３粒细胞（１０００×）
注：图中箭头ｌ指的是粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和巨核细胞；
箭头２指的是红细胞。下同。
图４单核细胞和红细胞（１０００×）
图５淋巴细胞和红细胞（１０００×）
图６巨核细胞和红细胞（１０００×）
２．２统计结果如表１所示，６ｈ短光照组阳性率为１９．９３％士４．５６％；１２ｈ对照光照组阳性率为３９．６４％士５．４７％；１８ｈ长光照组阳性率为４５．５０％士６．０７％。数据经ＳＰＳＳ软件的ＬＳＤ法进行分析处理，６ｈ短光照组与１２ｈ对照光照组阳性率相比存在极显著差异（Ｐ％０．０１），１２ｈ对照光照组与１８ｈ长光照组阳性率相比存在显著差异（Ｐ％０．０５）。结果显示，与１２ｈ对照光照组相比。６ｈ短光照组ｒｌｏｓ基因的表达量明显降低，１８ｈ光照组ｐｆｏｓ基因表达量升高。
表１不同光照组阳性率的比较
检测项目例数６ｈ短光照组１２ｈ对照光照组１８ｈ长光照组ｃ＿ｆｏ：粤譬率１０１９．９３士４．５６—３９．６４士５．４７４５．５０士６．０７＊～Ｆ０，
注：＊表示与１２ｈ对照光照组相比差异显著（Ｐ＜０．０５）；＊＊表示与１２ｈ对照光照组相比差异极显著（Ｐ＜０．０１）。
３讨论
Ｃ－ｆＯＳ原癌基因在正常细胞中起着促进细胞增殖分化的作用，但其不正常表达能够使细胞异常增殖癌变。Ｃ－ｌＯＳ在胚胎时期表达较强，但在成体器官中表达较弱。骨髓是各种血细胞生成、分化的场所，ｃ－ｌｏｓ在骨髓干细胞分化中起着重要的作用。有资料显示，骨髓中ｃ－｛ｏｓ表达量越多，干细胞所占比例就越高，干细胞的分化被抑制（Ｏｋａｄａ等，１９９９）。张蒙夏等（２００３，２００４）在对骨髓基质干细胞的研究中发现褪黑素可诱导骨髓基质于细胞分化为神经元样细胞。对成骨细胞的研究结果发现，ｃ—ｌｏｓ在骨和软骨形成的早期发挥作用，激活成骨细胞的增殖（Ｋｕｓｕｚａｋｉ等，２０００）。
在本试验中观察了不同光照下骨髓细胞中ｃ—ｆｏｓ表达的情况。ｃ—ｌｏｓ表达的核磷蛋白（ＦＯＳ）被认为是在外界刺激与转录偶联的信息传导过程中起着核内第三信使的作用（Ｂｌａｓｋ等，１９９３），可以通过免疫组化方法检测出来。由图３、４、５、６可知，Ｐｌｏｓ在
各种骨髓细胞中有广泛表达，但在红细胞系中却没
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有表达。鸡的红细胞虽然有细胞核，但是却不能进行ｍＲＮＡ的转录，所以在红细胞中就看不到ＦＯＳ蛋白显色。在图３、４、５、６中可以看到除单核细胞ＦＯＳ表达在胞浆外，粒细胞、巨核细胞和淋巴细胞均表达在胞核中。巨核细胞集落刺激因子（Ｍ—ＣＳＦ）作用于单核系造血细胞。其主要生物学作用是促进骨髓前体细胞发育成单核／巨噬细胞，促进单核／巨噬细胞增生、活化。Ｍ—ＣＳＦ受体是ｃ－ｆｏｓ编码的穿膜糖蛋白，分布于单核细胞的细胞表面，说明ｃ—ｆｏｓ与骨髓细胞的细胞增殖和分化相关。
褪黑素作为松果体分泌的主要激素。分泌主要受到光照的影响。白昼光照下褪黑素分泌减少，黑夜褪黑素分泌增多。鸡属光敏感动物，本试验通过控制光照改变鸡体内褪黑素的分泌。由表１可知，６ｈ短光照组ｃ—ｆｏｓ表达量低于对照组，１８ｈ长光照组ｃ－ｌｏｓ表达量高于对照组。说明褪黑素的升高能抑制鸡骨髓细胞中ｃ－ｆＯＢ的表达，而褪黑素的减少能够刺激ｃ－ｆｏｓ的表达。Ｍｏｌｉｓ等（１９９５）的研究结果已经发现褪黑素能够降低ｃ－ｆｏＢ原癌基因的ｍＲＮＡ水平。梅琦等（１９９６）研究离体条件下褪黑素对原代培养鸭肾上皮细胞ｃ—ｆｏｓ表达的影响，发现离体条件下褪黑素可能通过与鸭肾上皮细胞特异结合位点结合，从而抑制牛血清刺激引起的ｃ—ｆｏｓ表达，进而抑制细胞增殖。这些试验都与本试验结果相同。但近年来对脑内ｃ—ｆｏｓ表达的研究中有报道给大鼠注射褪黑素，可以诱导大鼠视交叉上核ｃ－ｆｏｓ表达（徐军等，２００５），与本试验所观察到的抑制作用相反，这可能是由于试验动物种属、部位及试验条件不同所致。本试验研究了骨髓内褪黑素与ｃ—ｌｏｓ原癌基因表达之间的关系，但褪黑素抑制ｃ—ｆｏｓ表达的作用机理还有待进一步的研究。
袁崇刚等（２０００）研究持续光照和褪黑素对小鼠骨髓细胞周期的影响时发现，持续光照褪黑素分泌减少时小鼠骨髓细胞周期延长，细胞增殖受到抑制，褪黑素的日周期性分泌节律具有促进骨髓细胞增殖的作用。本试验结果显示，褪黑素的升高能抑制鸡骨髓细胞中ｃ—ｆｏｓ的表达；减少却能够刺激ｃ－ｆｏｓ的表达。据此可以推测，褪黑素能够通过调节ｃ－ｆｏｓ的表达，影响骨髓细胞的增殖和分化。
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ＳＯＮＧＬｉ—ｘｉａ，ＬＩＵＳｈｕ－ｙｉｎｇ
不同光照下褪黑素变化对鸡骨髓内c-fos原癌基因表达的影响
作者：宋丽霞， 刘淑英， SONG Li-xia， LIU Shu-ying
作者单位：内蒙古农业大学动物科学与医学学院,呼和浩特,010018
刊名：
中国畜牧兽医
英文刊名：CHINA ANIMAL HUSBANDRY & VETERINARY MEDICINE
年，卷(期)：2009,36(9)
被引用次数：1次
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