乙型肝炎病毒X蛋白相关微小RNA_省略_达在乙型肝炎病毒复制中的作用研究_陈静
乙型肝炎病毒X 蛋白相关微小ＲNA 差异表达在乙型肝炎病毒复制中的作用研究
陈静，陈磊，吴孟超，石晓祯
基金项目：国家自然科学基金资助项目（91029723）
作者单位：200437上海市缔达生物科技有限公司（陈静，石晓祯）；第二军医大学附属东方肝胆外科医院（陈磊，吴孟超）；国际合作信号转导实验室（陈磊）
通信作者：陈静，200437上海市缔达生物科技有限公司；E －mail ：dida_bio@https://www.wendangku.net/doc/5313792732.html,
【摘要】背景
乙型肝炎病毒X 蛋白（HBX ）在乙型肝炎病毒复制及肝癌形成中扮演着重要的角色。研究HBX
相关微小ＲNA （miＲNAs ）的差异表达有可能为调控乙型肝炎病毒复制、阐明肝癌发展进程及开展预后干预提供重要
信息。目的
探讨肝癌细胞中HBX 相关miＲNAs 的差异表达及其在乙型肝炎病毒复制中的作用。方法
选取2014年
1—10月第二军医大学附属东方肝胆外科医院收治的13例肝癌患者的肝癌组织及距离肝癌组织＞2cm 癌旁组织的新鲜石蜡包埋标本，采用微阵列技术分析HBX 相关miＲNAs 的差异表达，实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（ＲT-qPCＲ）法定量分析肝癌组织与癌旁组织中7个与肝脏功能相关的miＲNAs 及HBX mＲNA 表达水平，同时分析过表达hsa －miＲ－373或抑制hsa －miＲ－22对乙型肝炎病毒复制的影响。结果
微阵列技术分析显示，HepG2－X 细胞系
和HepG2－CAT 细胞系中有46种miＲNAs 差异表达，与HepG2－CAT 细胞系相比，HepG2－X 细胞系中20种miＲNAs 表达上调，26种miＲNAs 表达下调。肝癌组织与癌旁组织中hsa －miＲ－22、hsa －miＲ－373、hsa －miＲ－92、hsa －miＲ－155及HBX mＲNA 表达水平比较，差异均有统计学意义（P ＜0.05）；肝癌组织与癌旁组织中hsa －miＲ－181a 、hsa －miＲ－34a 、hsa －let －7i 表达水平比较，差异均无统计学意义（P ＞0.05）。Pearson 相关性分析结果显示，hsa －miＲ－22表达水平与HBX mＲNA 表达水平呈正相关（r =0.415，P =0.018），hsa －miＲ－373、hsa －miＲ－92、hsa －miＲ－155表达水平与HBX mＲNA 表达水平呈负相关（r =－0.322，P =0.043；r =－0.369，P =0.028；r =－0.426，P =0.016）；hsa －miＲ－181a 、hsa －miＲ－34a 、hsa －let －7i 表达水平与HBX mＲNA 表达水平无直线相关关系（r =0.076，P =0.363；r =0.017，P =0.676；r =0.122，P =0.242）。第2天和第3天hsa －miＲ－22抑制剂组、hsa －miＲ－373前体组HepG2.2.15细胞系及HepAD －38细胞系乙型肝炎病毒拷贝数较阴性对照组降低（P ＜0.05）；第2天和第3天hsa －miＲ－373前体组HepG2.2.15细胞系乙型肝炎病毒拷贝数较hsa －miＲ－22抑制剂组降低（P ＜0.05）。第2天hsa －miＲ－373前体组HepAD －38细胞系乙型肝炎病毒拷贝数较hsa －miＲ－22抑制剂组升高，第3天hsa －miＲ－373前体组HepAD －38细胞系乙型肝炎病毒拷贝数较hsa －miＲ－22抑制剂组降低（P ＜0.05）。第2天和第3天hsa －miＲ－373前体组HepG 2.2.15细胞系乙型肝炎病毒拷贝抑制率较hsa －miＲ－22抑制剂组升高（P ＜0.05）。第2天hsa －miＲ－373前体组HepAD －38细胞系乙型肝炎病毒拷贝抑制率较hsa －miＲ－22抑制剂组降低，第3天hsa －miＲ－373前体组HepAD －38细胞系乙型肝炎病毒拷贝抑制率较hsa －miＲ－22抑制剂组升高（P ＜0.05）。结论HBX 相关
miＲNAs 的差异表达可通过靶向相关信号转导通路影响乙型肝炎病毒在肝癌细胞内的复制。
【关键词】
肝肿瘤；乙型肝炎病毒X 蛋白；微小ＲNA ；病毒复制
【中图分类号】Ｒ512.62
【文献标识码】A
doi ：10.3969/j.issn.1007－9572.2016.15.010
陈静，陈磊，吴孟超，等.乙型肝炎病毒X 蛋白相关微小ＲNA 差异表达在乙型肝炎病毒复制中的作用研究［J ］．中国全科医学，2016，19（15）：1786－1791.［
https://www.wendangku.net/doc/5313792732.html, ］Chen J ，Chen L ，Wu MC ，et al.Effect of differential expression of HBX －regulated miＲNAs on HBV replication ［J ］．Chinese General Practice ，2016，19（15）：1786－1791.
Effect of Differential Expression of HBX －regulated miＲNAs on HBV Ｒeplication CHEN Jing ，CHEN Lei ，WU Meng －
chao ，et al .Shanghai DIDA Biotechnology Co .，Ltd ，Shanghai 200437，China
【Abstract 】
Background
Hepatitis B virus X protein （HBX ）plays a very important role in HBV replication and
hepatocarcinogenesis （HCC ）.Ｒesearch on the differential expression of HBX －regulated miＲNAs may provide important
https://www.wendangku.net/doc/5313792732.html,
本文摘自当代临床医刊
information for the regulation of HBV replication，the elaboration of the development process of liver cancer and intervention on prognosis.Objective To explore the differential expression of HBX－regulated miＲNAs in HCC cells and its potential role in HBV replication.Methods We collected fresh specimens with paraffin embedding of HCC tissue and para－carcinoma tissue ＞2cm from HCC tissue from13HCC patients who were admitted into Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital Affiliated to the Second Military Medical University from January to October in2014.Microarry technology was used to analyze the differential expression of HBX－regulated miＲNAs.Quantitative analysis was conducted to investigate the expression of seven miＲNAs relevant with liver function and HBX mＲNA in HCC tissue and para－carcinoma tissue byＲT-qPCＲmethod，and the influence of over－expression of hsa－miＲ－373and inhibiting－expression of hsa－miＲ－22on HBV replication was explored.Ｒesults The microarray results showed that there were a total of46differential expressions of miＲNAs in HepG2－X and HepG2－CAT cell lines，and compared with HepG2－CAT cell line，20miＲNAs expressions were higher and26miＲNAs expressions were lower in HepG2－X cell line.HCC tissue and para－carcinoma tissue were significantly different in the expression levels of hsa－miＲ－22，hsa－miＲ－373，hsa－miＲ－92and hsa－miＲ－155and the expression level of HBX mＲNA（P＜0.05）；HCC tissues and para－carcinoma tissues were not significantly different in the expression levels of hsa－miＲ－181a，hsa－miＲ－34a and hsa －let－7i（P＞0.05）.Pearson correlation analysis showed that the expression level of hsa－miＲ－22was postitvely correlated with the expression level of HBX mＲNA（r=0.415，P=0.018），and there was negative correlation between the expression level of hsa－miＲ－373，hsa－miＲ－92and hsa－miＲ－155and the expression level of HBX mＲNA（r=－0.322，P =0.043；r=－0.369，P=0.028；r=－0.426，P=0.016）；no linear correlation existed between the expression level of hsa－miＲ－181a，hsa－miＲ－34a and hsa－let－7i and the expression level of HBX mＲNA（r=0.076，P=0.363；r =0.017，P=0.676；r=0.122，P=0.242）.On day2and day3，hsa-miＲ-22inhibition group and hsa－miＲ－373 precursor group were higher than negative control group in HBV replication number of HepG2.2.15and HepAD－38cell lines （P＜0.05）；on day2and day3，hsa－miＲ－373precursor group was lower than hsa－miＲ－22inhibition group in HBV replication number of HepG2.2.15cell line（P＜0.05）.On day2，hsa－miＲ－373precursor group was higher than hsa－miＲ－22inhibition group in HBV replication number of HepAD－38cell line，and on day3，hsa－miＲ－373precursor group was lower than hsa－miＲ－22inhibition group in HBV replication number of HepAD－38cell line（P＜0.05）.On day2and day 3，hsa－miＲ－373precursor group was higher than hsa－miＲ－22inhibition group in the inhibition rate of HBV replication of HepG2.2.15cell line（P＜0.05）.On day2，hsa－miＲ－373precursor group was lower than hsa－miＲ－22inhibition group in the inhibition rate of HBV replication of HepAD－38cell line，and on day3，hsa－miＲ－373precursor group was higher than hsa－miＲ－22inhibition group in the inhibition rate of HBV replication of HepAD－38cell line（P＜0.05）．Conclusion The regulation of miＲNAs by HBX can influence the replication of HBV in HCC cells by target－related signaling pathway.
【Key words】Liver neoplasms；Hepatitis B virus X protein；Micro－ＲNAs；Virus replication
微小ＲNA（microＲNA，miＲNAs）是一类长度为19 25个核苷酸分子的小ＲNA，在动、植物体内介导转录后基因沉默，在细胞生长、增殖、分化、凋亡过程中扮演重要的角色［1－2］。研究miＲNAs差异表达、miＲNAs 的调控网络及其对细胞功能的影响，对病毒感染以及肿瘤发生发展具有重要意义［3］。肝癌是一个全球健康问题，肝癌的发生发展与乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染密切相关［4］。乙型肝炎病毒X蛋白（HBX）是乙型肝炎病毒基因组HBX基因编码的蛋白，是一种反式激活因子，参与乙型肝炎病毒复制及肝癌进展［5］。因此，鉴别HBX相关miＲNAs的差异表达及其潜藏的生物学功能，对研究肝癌形成、针对关键miＲNAs开展干预治疗以及调控乙型肝炎病毒复制具有重要的临床意义［6］。本研究利用微阵列技术分析肝癌细胞系，采用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（ＲT-qPCＲ）法分析肝癌细胞中HBX相关miＲNAs的差异表达，并研究了过表达hsa
－miＲ－373或抑制hsa－miＲ－22对乙型肝炎病毒复制的影响。
1材料与方法
1.1标本选取2014年1—10月第二军医大学附属东方肝胆外科医院收治的慢性乙型肝炎致肝癌患者13例为研究对象，其中男8例，女5例；年龄35 56岁，平均年龄（43.2?7.2）岁；慢性乙型肝炎病史10年以上，无其他脏器合并症。收集肝癌患者肝癌组织及距离肝癌组织＞2cm癌旁组织的新鲜石蜡包埋标本。
1.2细胞系HepG2－X细胞系（为稳定表达HBX的细胞系）、HepG2－CAT细胞系〔为稳定表达报告基因———细菌氯霉素乙酰转移酶（CAT）的细胞系〕及HepAD－38细胞系［7］由美国托马斯杰斐逊大学Mark A Feitelson教授惠赠，稳定细胞系构建根据文献［5］。HepG
2.2.15细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，并按已报道流程培养［8］。
lcykzzw@https://www.wendangku.net/doc/5313792732.html,
当代临床医刊杂志投稿邮箱
1.3试剂miＲVana miＲNA Isolation Kit、miＲNA Negative control#1、hsa－miＲ－373前体和anti－miＲ－22购自Ambion（美国）；Qiagen Blood Kit购自Qiagen （德国）；hsa－miＲ－22、hsa－miＲ－181a、hsa－miＲ－34a、hsa－miＲ－373、hsa－miＲ－92、hsa－miＲ－155、hsa－let－7i和U6的ＲT－qPCＲ和PCＲ引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.4HBX免疫组织化学染色切割新鲜石蜡包埋标本并根据文献［9］提供的实验流程用兔抗人anti－HBX 抗体x－99多克隆抗体（由国际合作信号转导实验室制备）进行HBX染色。所有肝癌组织及癌旁组织先用10%甲醛溶液固定，然后脱水、石蜡包埋、连续切片（5μm厚），切片脱蜡、水合，并在枸橼酸盐缓冲液中煮沸修复抗原。1%牛血清清蛋白（BSA）室温封闭30 min，一抗4?孵育过夜后滴加二抗DAKO，37?孵育45min。二氨基联苯胺（DAB）显色（DAB显色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司），苏木素复染。在显微镜下观察肝癌组织及癌旁组织切片中HBX的染色强度。所有染色步骤按试剂盒说明书进行。
1.5miＲNAs及总ＲNA分离按miＲVana miＲNA Isolation Kit的流程抽提HepG2－X细胞系、HepG2－CAT细胞系及13对新鲜肝癌组织/癌旁组织标本中的miＲNAs。将细胞悬液或组织匀浆用试剂盒中的Lysis /Binding Buffer裂解，剧烈震荡以破解细胞释放miＲNAs；加入1/10体积的miＲNA Homogenate Additive 蜗旋震荡后冰浴，加入和Lysis/Binding Buffer等体积的苯酚和三氯甲烷溶液，混匀后10000?g离心5min，取上层水相与1/3体积的100%乙醇溶液充分混合后，加到结合柱中，10000?g离心15s，收集滤液，再添加2/3滤液体积的室温100%乙醇溶液混匀，加入一个新的结合柱中，10000?g离心15s后弃去滤液，用miＲNA Wash Solution1、2、3各洗涤1次，最后用95?预热的无ＲNA酶水或者Elution Solution洗脱。按总ＲNA抽提液TＲIZOLＲeagent（Invitrogen，美国）的流程抽提13对新鲜肝癌组织/癌旁组织标本中的总mＲNA。将组织匀浆用TＲIZOLＲeagent裂解，加入三氯甲烷溶液混匀，10000?g离心5min后吸取上层含有总ＲNA的水相置入新EP管，加入异丙醇沉淀总ＲNA，20000?g 离心15min用75%乙醇洗涤总ＲNA沉淀，晾干后用焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解。提纯后的miＲNAs及总ＲNA测定260nm/280nm处的吸光度，－80?保存。
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本研究要点：
（1）本研究采用微阵列技术分析肝癌细胞中乙型肝炎病毒X蛋白（HBX）相关微小ＲNA
（miＲNAs）的差异表达，并初步分析了其中部分
miＲNAs在乙型肝炎病毒复制中的作用。
（2）本研究发现，肝癌细胞中有46种miＲNAs 受HBX影响，其中有20种miＲNAs表达上调，26
种miＲNAs表达下调。
（3）7种可能参与乙型肝炎病毒复制或肝癌发生的miＲNAs中，hsa－miＲ－22、hsa－miＲ－373、hsa－miＲ－92、hsa－miＲ－155表达水平在肝癌组
织与癌旁组织中有差异，同时hsa－miＲ－22表达
水平与HBX mＲNA表达水平呈正相关，hsa－miＲ
－373、hsa－miＲ－92、hsa－miＲ－155表达水平与
HBX mＲNA表达水平呈负相关。
（4）过表达hsa－miＲ－373或抑制hsa－miＲ－22可显著抑制HepG2.2.15细胞系和HepAD－38
细胞系中乙型肝炎病毒的复制。
1.6微阵列技术分析HBX相关miＲNAs的差异表达HepG2－X细胞系和HepG2－CAT细胞系中抽提得到ＲNA样品各50μl，进行配对miＲNAs微阵列技术分析（LC Sciences，美国），计算HepG2－X/HepG2－CAT，确定差异表达倍数进行排序。
1.7ＲT-qPCＲ法定量分析miＲNAs及HBX mＲNA表达水平采用ＲT-qPCＲ法分析肝癌组织/癌旁组织中miＲNAs及HBX mＲNA表达水平。基于文献［10］，选取7个与肝脏功能相关的miＲNAs，包括3个在HepG2－X细胞系中表达上调的miＲNAs（hsa－miＲ－22、hsa －miＲ－181a、hsa－miＲ－34a）和4个在HepG2－X细胞系中表达下调的miＲNAs（hsa－miＲ－373、hsa－miＲ－92、hsa－miＲ－155、hsa－let－7i）。检测miＲNAs时每个ＲT-qPCＲ体系中将25ng miＲNAs、miＲNA反转录引物、dNTPs、5?ＲT buffer、ＲNasin、MMLV酶、DEPC 水混合，37?反转录60min后，85?热灭活5min；随后加入miＲNAs qPCＲ引物及FastStart Universal SYBＲGreen Master mix（Ｒox）（ＲOCHE，德国），采用ABI 7500Ｒeal－Time定量PCＲ仪（ABI，美国）进行检测，PCＲ程序为95?预变性3min，95?变性15s，60?退火30s，重复40个循环；以U6作为内参。检测HBX mＲNA表达水平时每个ＲT-qPCＲ体系中将100ng mＲNA、反转录6nt随机引物、dNTPs、5?ＲT buffer、ＲNasin、MMLV酶、DEPC水混合，37?反转录60min后，85?热灭活5min；随后加入HBX mＲNA qPCＲ引物及FastStart Universal SYBＲGreen Master mix（Ｒox），采用
ABI7500Ｒeal－Time定量PCＲ仪进行检测，PCＲ程序为95?预变性3min，95?变性15s，60?退火30s，重复40个循环；以18s rＲNA作为内参。miＲNAs表达水平用miＲNAs与内参U6Ct值的差值ΔCt
miＲNAs
〔ΔCt
miＲNAs =－（Ct
miＲNAs
－Ct
U6
）〕表示；HBX mＲNA表
达水平用HBX mＲNA与内参18s rＲNA Ct值的差值
ΔCt
HBX mＲNA 〔ΔCt
HBX mＲNA
=－（Ct
HBX mＲNA
－Ct
18s rＲNA
）〕
表示。
1.8过表达hsa－miＲ－373或抑制hsa－miＲ－22对乙型肝炎病毒复制的影响进一步研究与HBX mＲNA表达水平相关性最显著的2个miＲNAs（hsa－miＲ－373和hsa－miＲ－22）是否会影响乙型肝炎病毒的复制。HepG
2.2.15细胞系和HepAD－38细胞系以1.5?104 /孔细胞密度接种到96孔胶原蛋白包被的细胞培养板上，每个细胞系做3个复孔，完全培养基中37?、5% CO
2
条件下培养过夜；根据说明书使用转染试剂INTEＲFEＲin siＲNA transfection reagent（Polyplus，法国）瞬时转染hsa－miＲ－373前体（hsa－miＲ－373前体组）或anti－miＲ－22（hsa－miＲ－22抑制剂组），37?孵育4h后，更换成完全培养基；继续培养第2天、第3天时，采用Qiagen Blood Kit从100μl培养液中抽提乙型肝炎病毒DNA后，利用乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCＲ－荧光探针法）〔凯杰生物工程（深圳）有限公司〕采用ＲT-qPCＲ法分析乙型肝炎病毒拷贝数。以转染miＲNA Negative control#1的HepG2.2.15细胞系和HepAD－38细胞系作为阴性对照组。乙型肝炎病毒拷贝抑制率（Ｒ）由如下公式计算：
Ｒ=（1－Σ
C
i
C
NC
n
）%，C
i
为瞬时转染hsa－miＲ－373前
体或anti－miＲ－22的复孔的乙型肝炎病毒拷贝数，C
NC 为阴性对照组的乙型肝炎病毒拷贝数的平均数，n为复孔数量。
1.9统计学方法采用SPSS20.0统计学软件进行数据处理，符合正态分布计量资料以（x?s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验；相关分析采用Pearson相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1HBX调控的miＲNAs差异表达微阵列技术分析显示，HepG2－X细胞系和HepG2－CAT细胞系中有46种miＲNAs差异表达，与HepG2－CAT细胞系相比，HepG2－X细胞系中20种miＲNAs表达上调，26种miＲNAs表达下调（见表1、图1）。
2.2ＲT-qPCＲ法定量分析miＲNAs及HBX mＲNA表达水平肝癌组织与癌旁组织中hsa－miＲ－22、hsa－miＲ－373、hsa－miＲ－92、hsa－miＲ－155及HBX mＲNA 表达水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；肝癌组织与癌旁组织中hsa－miＲ－181a、hsa－miＲ－34a、hsa－let－7i表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05，见表2）。
2.3相关性分析Pearson相关性分析结果显示，hsa－miＲ－22表达水平与HBX mＲNA表达水平呈正相关（r =0.415，P=0.018），hsa－miＲ－373、hsa－miＲ－92、hsa－miＲ－155表达水平与HBX mＲNA表达水平呈负相关（r=－0.322，P=0.043；r=－0.369，P=0.028；r =－0.426，P=0.016）；hsa－miＲ－181a、hsa－miＲ－34a、hsa－let－7i表达水平与HBX mＲNA表达水平无直线相关关系（r=0.076，P=0.363；r=0.017，P =0.676；r=0.122，P=0.242）
。
注：miＲNAs=微小ＲNA
图1HBX调控的miＲNAs差异表达微阵列技术分析图Figure1Microarray technology images of HBX－regulated miＲNAs
表2肝癌组织与癌旁组织中miＲNAs及HBX mＲNA表达水平比较（x?s）
Table2Comparison of miＲNAs and HBX mＲNA expression between HCC and paracancerous tissue
组织例数hsa－miＲ－22hsa－miＲ－181a hsa－miＲ－34a hsa－miＲ－373hsa－miＲ－92hsa－miＲ－155hsa－let－7i HBX mＲNA 肝癌组织13－1.22?3.07－2.50?2.64－1.27?3.34 1.80?2.55 1.81?2.68 1.28?2.46－0.14?2.88－8.10?2.88癌旁组织13 1.55?2.35－0.49?2.62－0.94?3.10－1.24?2.22－0.94?1.82－1.24?2.10－0.90?4.43－5.23?3.04 t值－2.329－1.579－0.350 2.421 2.305 2.2710.388－5.038 P值0.038＞0.05＞0.050.0320.0400.042＞0.050.001
表1HBX相关miＲNAs差异表达微阵列技术分析结果
Table1Differentially expressed HBX－related miＲNAs by microarray analysis
编号探针标识HepG2－X
细胞系HepG2－CAT
细胞系
HepG2－X
/HepG2－CAT
HepG2－X细胞系中miＲNAs表达上调
1hsa－miＲ－542－5p412.65 4.67－6.21 2hsa－miＲ－222091.08814.17－1.30 3hsa－miＲ－6631252.37559.82－1.15 4hsa－miＲ－63814865.087188.07－1.05 5hsa－miＲ－575371.21195.98－0.95 6hsa－miＲ－181a2162.731084.31－0.90 7hsa－miＲ－5741054.20656.37－0.72 8hsa－miＲ－148a847.00515.70－0.69 9hsa－miＲ－99b803.62517.24－0.64 10hsa－miＲ－34a2287.221593.84－0.55 11hsa－miＲ－425－5p1531.641048.80－0.55 12hsa－miＲ－146a1573.181092.16－0.52 13hsa－miＲ－181b2302.841565.25－0.50 14hsa－miＲ－10310746.357735.30－0.46 15hsa－miＲ－1079513.037142.21－0.44 16hsa－miＲ－2223486.072660.43－0.43 17hsa－miＲ－2410474.498423.06－0.36 18hsa－miＲ－19110090.308037.62－0.34 19hsa－miＲ－935534.524334.91－0.33 20hsa－miＲ－2158338.6048732.69－0.26 HepG2－X细胞系中miＲNAs表达下调
1hsa－miＲ－37336.34184.87 2.24 2hsa－miＲ－422b96.69399.79 2.07 3hsa－miＲ－7112.72391.41 1.80 4hsa－miＲ－30e－3p39.01122.55 1.69 5hsa－miＲ－365133.18353.57 1.38 6hsa－let－7i179.62472.25 1.36 7hsa－miＲ－15555.96125.52 1.29 8hsa－let－7g1232.012950.18 1.08 9hsa－miＲ－454－3p625.461180.56 1.00 10hsa－let－7d487.32915.180.90 11hsa－let－7c438.03768.580.84 12hsa－let－7f1471.042924.930.74 13hsa－miＲ－148b768.371204.550.69 14hsa－miＲ－15b3203.725179.950.68 15hsa－miＲ－15a476.88790.580.68 16hsa－miＲ－146b975.771552.230.67 17hsa－miＲ－92b4883.127353.030.51 18hsa－miＲ－5942168.712918.820.42 19hsa－miＲ－2157817.8110169.990.42 20hsa－miＲ－4832011.732654.540.41 21hsa－let－7a2700.143681.230.41 22hsa－miＲ－20b8008.7110597.250.38 23hsa－miＲ－9211881.0514904.740.32 24hsa－miＲ－26b11502.1613990.540.28 25hsa－miＲ－27b10394.6612018.330.21 26hsa－miＲ－23a14559.3416142.120.18注：miＲNAs=微小ＲNA 2.4过表达hsa－miＲ－373或抑制hsa－miＲ－22对乙型肝炎病毒复制的影响第2天和第3天阴性对照组、hsa－miＲ－22抑制剂组、hsa－miＲ－373前体组HepG2.2.15细胞系及HepAD－38细胞系乙型肝炎病毒拷贝数比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中第2天和第3天hsa－miＲ－22抑制剂组、hsa－miＲ－373前体组HepG2.2.15细胞系及HepAD－38细胞系乙型肝炎病毒拷贝数较阴性对照组降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）；第2天和第3天hsa－miＲ－373前体组HepG2.2.15细胞系乙型肝炎病毒拷贝数较hsa－miＲ－22抑制剂组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；第2天hsa－miＲ－373前体组HepAD－38细胞系乙型肝炎病毒拷贝数较hsa－miＲ－22抑制剂组升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；第3天hsa－miＲ－373前体组HepAD－38细胞系乙型肝炎病毒拷贝数较hsa－miＲ－22抑制剂组降低，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。
第2天和第3天hsa－miＲ－373前体组HepG2.2.15细胞系乙型肝炎病毒拷贝抑制率较hsa－miＲ－22抑制剂组升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。第2天hsa －miＲ－373前体组HepAD－38细胞系乙型肝炎病毒拷贝抑制率较hsa－miＲ－22抑制剂组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；第3天hsa－miＲ－373前体组HepAD－38细胞系乙型肝炎病毒拷贝抑制率较hsa－miＲ－22抑制剂组升高，差异有统计学意义（P＜0.05，见表4）。
3讨论
据统计，全球范围内约有3亿慢性乙型肝炎病毒感染的患者，慢性乙型肝炎诱发的肝硬化是肝癌发生的主要病因之一［4，11］。而其中乙型肝炎病毒编码的HBX则是导致肝细胞癌变的关键因素［12］。因此，研究HBX相
表3阴性对照组、hsa－miＲ－22抑制剂组、hsa－miＲ－373前体组HepG2.2.15细胞系及HepAD－38细胞系乙型肝炎病毒拷贝数
比较（x?s，?106个，n=3）
Table3Comparison of HBV replication number of HepG2.2.15and HepAD－38cell lines among negative control group，hsa－miＲ
－22inhibition group and hsa－miＲ－373precursor group 组别
HepG2.2.15细胞系
第2天第3天
HepAD－38细胞系
第2天第3天
阴性对照组0.87?0.01 1.27?0.0265.5?1.072.1?1.8 hsa－miＲ－22
抑制剂组0.81?0.01
a 1.14?0.02a40.2?0.1a58.3?1.4a hsa－miＲ－373
前体组0.68?0.01
ab1.01?0.03ab49.8?1.0ab53.4?2.0ab F值378.81133.74701.0489.14
P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001
注：与阴性对照组比较，a P＜0.05；与hsa－miＲ－22抑制剂组比较，b P＜0.05
表4hsa－miＲ－22抑制剂组、hsa－miＲ－373前体组HepG2.2.15细胞系及HepAD－38细胞系乙型肝炎病毒拷贝抑制率比较（x?s，%，n=3）
Table4Comparison of HBV replication inhibition rate of HepG2.2.15and HepAD－38cell lines between hsa－miＲ－22inhibition group
and hsa－miＲ－373precursor group
组别HepG2.2.15细胞系
第2天第3天
HepAD－38细胞系
第2天第3天
hsa－miＲ－22
抑制剂组 6.7?0.910.2?1.238.6?0.219.0?1.9 hsa－miＲ－373
前体组21.4?0.920.7?2.123.9?1.626.8?2.8
t值－20.579－7.59915.957－3.404
P值＜0.0010.002＜0.0010.027
关miＲNAs的差异表达将加深对乙型肝炎病毒慢性感染诱发肝癌过程中复杂调控网络的认识，为干预肝癌进展、抗肿瘤复发转移提供新方法、新思路。
本研究利用微阵列技术分析稳定表达HBX的HepG2－X细胞系及其对照HepG2－CAT细胞系中miＲNAs差异表达情况，结果发现46种受HBX调控的miＲNAs。随后，对与肝脏功能相关的候选的7个差异表达miＲNAs，在13对肝癌组织及癌旁组织中进行了检测，并与HBX表达情况进行了对比，其中有4个miＲNAs（hsa－miＲ－22、hsa－miＲ－373、hsa－miＲ－92、hsa－miＲ－155）与HBX mＲNA表达水平相关。进一步研究发现，当引入has－miＲ－373前体或has－miＲ－22抑制剂后HepG2.2.15细胞系（产生低拷贝乙型肝炎病毒）和HepAD－38细胞系（产生高拷贝乙型肝炎病毒）中乙型肝炎病毒的复制水平均被显著抑制。
上述结果提示，HBX可通过调控miＲNAs的表达，在乙型肝炎病毒复制中扮演着非常重要的角色。由于HBX可作为反式激活因子参与调节细胞内基因的转录过程，因此推测HBX有可能通过与不同的转录因子相结合从而分别实现抑制has－miＲ－373的表达和促进has－miＲ－22的表达。同时由于不同miＲNAs可通过不完全互补配对方式与基因转录本3'非翻译区结合从而抑制基因的表达，因此本研究推测HBX可通过调控has－miＲ－373和has－miＲ－22的表达，负向调节不同下游基因的表达，从而实现对乙型肝炎病毒复制的精细调控。
综上所述，HBX相关miＲNAs的差异表达可通过靶向相关信号转导通路有效影响乙型肝炎病毒在肝癌细胞内的复制。对于发现的显著影响乙型肝炎病毒复制的has－miＲ－373和has－miＲ－22是如何通过干预不同基因的表达来实现对乙型肝炎病毒复制的调控以及其介导的下游信号转导通路之间是否存在交互调控尚需后续深入研究。
作者贡献：陈静提出研究思路，设计研究方案，进行实验实施和数据分析，撰写论文；陈磊完善研究方案，采集样本，数据分析复核，修改论文；吴孟超负责最终版本修订；石晓祯协助采集样本并进行实验。
本文无利益冲突。
参考文献
［1］Yates LA，Norbury CJ，GilbertＲJ.The long and short of microＲNA ［J］．Cell，2013，153（3）：516－519.
［2］Lin S，GregoryＲI.MicroＲNA biogenesis pathways in cancer［J］．NatＲev Cancer，2015，15（6）：321－333.
［3］Suzuki HI，Katsura A，Matsuyama H，et al.MicroＲNA regulons in tumor microenvironment［J］．Oncogene，2015，34（24）：3085
－3094.
［4］Arzumanyan A，Ｒeis HM，Feitelson MA.Pathogenic mechanisms in HBV－and HCV－associated hepatocellular carcinoma［J］．NatＲev Cancer，2013，13（2）：123－135.
［5］Hu L，Chen L，Li L，et al.Hepatitis B virus X protein enhances cisplatin－induced hepatotoxicity via a mechanism involving degradation of Mcl－1［J］．J Virol，2011，85（7）：3214－3228.［6］Soifer HS，Ｒossi JJ，Saetrom P.MicroＲNAs in disease and potential therapeutic applications［J］．Mol Ther，2007，15（12）：2070
－2079.
［7］Dews M，Homayouni A，Yu D，et al.Augmentation of tumor angiogenesis by a Myc－activated microＲNA cluster［J］．Nat
Genet，2006，38（9）：1060－1065.
［8］Bourne C，Lee S，Venkataiah B，et al.Small－molecule effectors of hepatitis B virus capsid assembly give insight into virus life cycle［J］．
J Virol，2008，82（20）：10262－10270.
［9］Chen L，Hu L，Li L，et al.Dysregulation ofβ－catenin by hepatitis
B virus X protein in HBV－infected human hepatocellular carcinomas
［J］．Front Med China，2010，4（4）：399－411.
［10］Feitelson MA，Lee J.Hepatitis B virus integration，fragile sites，and hepatocarcinogenesis［J］．Cancer Lett，2007，252（2）：157
－170.
［11］Wang HY，Chen L.Tumor microenviroment and hepatocellular carcinoma metastasis［J］．J Gastroenterol Hepatol，2013，28
（Suppl1）：43－48.
［12］Tian Y，Yang W，Song J，et al.Hepatitis B virus X protein－induced aberrant epigenetic modifications contributing to human
hepatocellular carcinoma pathogenesis［J］．Mol Cell Biol，2013，33（15）：2810－2816.
（收稿日期：2015－12－03；修回日期：2016－03－16）
（本文编辑：陈素芳）
慢性乙型肝炎的抗病毒药物研发进展
慢性乙型肝炎的抗病毒药物研发进展 乙型病毒性肝炎是指由B型肝炎病毒（HBV）感染而引起的，肝细胞坏死和炎症，可分为急性肝炎和慢性炎，能引起一系列的并发症，如肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌（HCC）。其中，慢性乙型肝炎（CHB）是指能够检测出至少连续6个月的乙肝表面抗原（HBsAg）或（和）HBV DNA阳性。这是一个非常严重的世界性的公共问题。全球曾感染HBV约20亿人，其中CHB感染者为3.5亿人，每年约有78.6万人死于HBV感染所致的并发症。世界卫生组织对肝癌统计显示中国的新发病例数和死亡病例数均占全球的50%以上，且不断上升。全球肝硬化和HCC患者中，由HBV感染引起的比例分别为30%和45%。我国肝硬化和HCC患者中，由HBV感染引起的比例分别高达60%和80%。20多年的乙型肝炎疫苗政策的实施和近些年抗病毒治疗的广泛应用，使得我国婴幼儿HBV的感染率大幅下降，急性HBV发生明显减少，但感染HBV人口逐渐老龄化，近年HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者的所占比例也不断上升。本文对近些年慢性乙型肝炎治疗的靶点和药物做一综述。 1 乙型肝炎病毒的复制周期和抗病毒靶点 HBV生命周期开始于吸附到肝细胞上，即病毒膜表面抗原大蛋白（LHBsAg）与肝细胞膜上的钠离子-牛磺胆酸协同转运蛋白结合(NTPC)结合，然后通过受体介导的内吞作用进入到肝细胞质。经内化释放出病毒核衣壳蛋白(CP)包裹的松弛状DNA，CP经机制不详的磷酸化后在肝细胞核孔入口处脱去衣壳，使裸露的rcDNA进入肝细胞核。之后的rcDNA发生了在宿主DNA聚合酶帮助下的正链缺口修复和在拓扑异构酶作用下的两条环状DNA链的共价连接,最终形成具有超螺旋结构的共价闭合环状DNA（cccDNA）。通常cccDNA主要是以游离基因的形式存在于肝细胞中，作为后续病毒RNA转录的模板。另外cccDNA可以沉默，也可以整合到宿主的基金组里且高度稳定存在于干细胞的生命周期中。尽管肝细胞内cccDNA水平能够通过抗病毒治疗来抑制，但是cccDNA似乎很难被根除。cccDNA可以编码4种主要的RNA转录体，其中最大的RNA转录体具有信使RNA（mRNA）和前基因组RNA（pgRNA）的功能。pgRNA作为逆转录、聚合酶翻译和核衣壳蛋白合成的模板。病毒蛋白的翻译涉及到4种重叠的开放阅读框（ORF）：表面包膜（S）、核衣壳（C），聚合酶（P）和X。S的ORFs编码3种不同表面膜蛋白：大、中、小的HBsAg蛋白，C的ORFs编码病毒核心抗原（HBcAg）和前核蛋白。HBcAg介导pgRNA的衣壳化。前核蛋白最终在内质网中经过蛋白水解变成病毒e抗原（HBeAg）。HBeAg可能有免疫调节作用，能够促进宿主内的慢性感染，是病毒复制的重要标志。P的ORFs编码HBV聚合酶，该聚合酶在复制过程中有多种功能，包括促进病毒DNA的合成，逆转录和pgRNA的降解。X的ORFs编码病毒X蛋白（HBxAg），被认为涉及多个功能如细胞周期调控，信号传导，转录激活和病毒DNA修复，还与肝癌的发生相关。HBV核衣壳的装配是在肝细胞质里开始的'。PgRNA封装在核衣壳里成为逆转录和新的HBVDNA合成的模板。PgRNA在HBV DNA聚合酶的介导下发生逆转录生成新病毒粒子，即衣壳化的rcDNA。病毒rcDNA接下来既可以重新脱衣壳进入肝细胞核形成新的循环，增加肝细胞核内的病毒cccDNA存储，也可以同富集在内质网上的HBsAg蛋白发生进一步的装配，形成成熟的子代HBV，最终通过发芽或膜泡运输分泌到宿主细胞外。 通过上述乙肝病毒生命周期的介绍，知道如果能切断生命周期中的某一个环节，就可以破换病毒的复制甚至杀死病毒细胞。如此本文以病毒的生命周期的不同阶段及发生过程来总结潜在的靶点，如表1所示。
乙肝病毒的复制过程之令狐文艳创作
乙肝病毒的复制过程 令狐文艳 在医学上，病毒的繁殖被称之为“复制”，在复制的过程中，有两个很重要的因素：一个是催化剂，另一个是模板。没有这两个因素，乙肝病毒就不能复制。乙肝病毒复制的“催化剂”就是乙肝病毒DNA（即HBV-DNA）聚合酶。没有这种聚合酶的作用，乙肝病毒的复制就会停止。 乙肝病毒的基因组（HBV-DNA）是由两条螺旋的DNA 链围成的一个环形结构。其中一条较长负链已经形成完整的环状；另一条长度较短的正链，呈半环状。在感染肝细胞之后，这条半环状的DNA链就会以负链为模板，在催化剂──HBV-DNA聚合酶的作用下延长，最终形成完整的环状。这时的乙肝病毒基因组就形成了一个完全环状的双股DNA。把这种DNA称做共价闭合环状DNA（即cccDNA），可以把它看作是病毒复制的原始模板。模板形成后，病毒基因会以其中的一条cccDNA为模板，利用肝细胞基因中的酶和DNA 聚合酶的“催化”，一段基因又一段基因地复制，形成负链和正链。最后再装配到一起形成新的HBV-DNA颗粒。 复制的第一步：黏附
HBV人侵人体后，依靠其外膜(表面抗原，HBsAg)能粘附在肝细胞膜上，当然，粘附的首要条件是HBsAg先要识别肝细胞膜。一旦粘附成功，HBv的外膜也就完成了它的使命，甩掉了外膜，HBV钻进肝细胞内。 复制的第二步；脱壳 HBV核心部分来到肝细胞内，在肝细胞浆中还要脱掉它的“核壳”(核心抗原即HBcAG及E抗原即HbEAG)，这样，就暴露出了它最核心部分，即乙肝病毒核酸(HBv DNA)，HBV大有“赤膊上阵”之意。HBVDNA包涵着乙肝病毒的全部基因，是它主宰着HBv的复制的。 复制的第三步：入核 HBv DNA从肝细胞浆内进入肝细胞核，在这里它要进一步发育完善，形成了HBv的“共价闭合环状脱氧核塘核酸”(HBv cccDNA)。这个cccDNA十分了得，它深深藏匿在肝细胞核内，而肝细胞核外面有一层坚韧的核膜。目药物都难以通过这坚韧的核膜，因而对cccDNA也无可奈何，但cccDNA却掌控着HBv 所有的遗传信息，指令着HBv的复制。因此．现有的药物想彻底消灭人体内的HBv真比登天还难，这些药物只能抑制HBv的繁殖或复制，“全部转阴”也只能是一种幻想。 复制的第四步：转录
乙肝病毒复制过程
乙肝病毒复制过程 乙肝病毒DNA复制过程 不同于一个真正的生物体，病毒并不通过生长和分裂等方式繁殖自身，而是像铸造机器零件一样，按照一定的模具拷贝出来的。病毒DNA中包含有一些程序，指导病毒的遗传物质和其它一些结构蛋白组分增殖。另外，病毒DNA中还包含有一些信息，使得单一组分能够在细胞因子的帮助下，自发组装成新的病毒颗粒。 在医学上，病毒的繁殖被称之为“复制”，在复制的过程中，有两个很重要的因素：一个是催化剂，另一个是模板。没有这两个因素，乙肝病毒就不能复制。乙肝病毒复制的“催化剂”就是乙肝病毒DNA
（即HBV-DNA）聚合酶。没有这种聚合酶的作用，乙肝病毒的复制就会停止。 乙肝病毒的基因组（HBV-DNA）是由两条螺旋的DNA 链围成的一个环形结构。其中一条较长负链已经形成完整的环状；另一条长度较短的正链，呈半环状。在感染肝细胞之后，这条半环状的DNA 链就会以负链为模板，在催化剂──HBV-DNA聚合酶的作用下延长，最终形成完整的环状。这时的乙肝病毒基因组就形成了一个完全环状的双股DNA。把这种DNA称做共价闭合环状DNA（即cccDNA），可以把它看作是病毒复制的原始模板。模板形成后，病毒基因会以其中的一条cccDNA为模板，利用肝细胞基因中的酶和DNA 聚合酶的“催化”，一段基因又一段基因地复制，形成负链和正链。最后再装配到一起形成新的HBV-DNA颗粒。 复制的第一步：黏附 HBV人侵人体后，依靠其外膜(表面抗原，HBsAg)能粘附在肝细胞膜上，当然，粘附的首要条件是HBsAg先要识别肝细胞膜。一旦粘附成功，HBv的外膜也就完成了它的使命，甩掉了外膜，HBV钻进肝细胞内。 复制的第二步；脱壳 HBV核心部分来到肝细胞内，在肝细胞浆中还要脱掉它的“核壳”(核心抗原即HBcAG及E抗原即HbEAG)，这样，就暴露出了它最核心部分，即乙肝病毒核酸(HBv DNA)，HBV大有“赤膊上阵”
HBV-DNA
HBV-DNA DNA即脱氧核糖核酸，病毒的复制是靠DNA的复制来完成的，DNA浓度越高表明病毒毒复制越活跃，HBV-DNA是HBV感染最直接、特异性强和灵敏性高的指标，HBV-DNA阳性，提示HBV复制和有传染性。 HBV-DNA的复制 不同于一个真正的生物体，病毒并不通过生长和分裂等方式繁殖自身，而是像我们铸造机器零件一样，按照一定的模具拷贝出来的。病毒DNA中包含有一些程序，指导病毒的遗传物质和其它一些结构蛋白组分增殖。另外，病毒DNA中还包含有一些信息，使得单一组分能够在细胞因子的帮助下，自发组装成新的病毒颗粒。 在医学上，病毒的繁殖被称之为“复制”，在复制的过程中，有两个很重要的因素：一个是催化剂，另一个是模板。没有这两个因素，乙肝病毒就不能复制。乙肝病毒复制的“催化剂”就是乙肝病毒DNA（即HBV-DNA）聚合酶。没有这种聚合酶的作用，乙肝病毒的复制就会停止。 乙肝病毒的基因组（HBV-DNA）是由两条螺旋的DNA 链围成的一个环形结构。其中一条较长负链已经形成完整的环状；另一条长度较短的正链，呈半环状。在感染肝细胞之后，这条半环状的DNA链就会以负链为模板，在催化剂──HBV-DNA 聚合酶的作用下延长，最终形成完整的环状。这时的乙肝病毒基因组就形成了一个完全环状的双股DNA.我们把这种DNA称做共价闭合环状DNA（即cccDNA），可以把它看作是病毒复制的原始模板。模板形成后，病毒基因会以其中的一条cccDNA 为模板，利用肝细胞基因中的酶和DNA 聚合酶的“催化”，一段基因又一段基因地复制，形成负链和正链。最后再装配到一起形成新的HBV-DNA颗粒。 HBV-DNA正常值 通常低于10的3次方，就结论为阴性，报告上写阴性，或“＜10的3次方”。HBV-DNA检查非常灵敏，在同一数量级变化通常不能说明病毒变化，例如2X10 的5次方和5X10的5次方很可能就是没有变化，但2X10的5次方和2X10的4 次方，就有变化了。 需要指出的是，HBV-DNA阳性的乙肝携带者未必需要治疗，还要结合转氨酶（ALT）水平。一般来说，只有当转氨酶大于正常值的2倍时，才应考虑治疗；HBV-DNA值的多少和肝损伤的程度没有直接的关系。乙肝大三阳携带者的HBV-DNA一般都比较高，但肝损伤未必就严重，因为乙肝病毒本身并不直接伤害肝细胞
病毒复制
北京大学医学部
Peking University Health Science Center
病毒复制
The replication of virus
北京大学医学部病原生物学系 邹清华
zouqinghua@https://www.wendangku.net/doc/5313792732.html, 医学微生物学 精品课程
Medical Microbiology Excellent Curriculum
复制周期
1、吸附 2、穿入 3、脱壳 4、生物
合成 5、组装 6、释放
病毒单周期生长曲线
病毒的复制
复制（replication） 病毒在细胞内由病毒基因组引导合成病毒核 酸、蛋白质及其它病毒结构成分，在宿主细胞 质内或核内装配成熟，释放到细胞外的增殖方 式。
复制周期 从病毒体侵入细胞到子代病毒体生成释放， 称为一个复制周期。
病毒的复制周期
? 复制早期：识别、吸附、穿入、脱壳。 ? 复制晚期：生物合成、装配、病毒包膜
芽生和释放。
? 隐蔽期：病毒脱壳后进入复制的生物合成阶段，此时电镜 法在细胞内查不到完整病毒颗粒，血清学方法测不到病毒 的抗原，也没有感染性，称为隐蔽期（Eclipse period）。
? 潜隐期：从病毒进入细胞至释放子代病毒前，细胞外无感 染性病毒存在，此段时间称为潜隐期（latent period）。
病毒的异常增殖
顿挫感染（abortive infection）
病毒基因组不完整或发生了改变。 宿主细胞缺少病毒复制所需要的酶、能量等条件。 以上两方面因素使病毒进入宿主细胞后不能在细 胞内完成增殖的全过程或不能装配出有感染性的 病毒体。
伪病毒颗粒 (pseudovirion)
病毒衣壳包裹一段宿主细胞的DNA形成的病毒颗粒。
HBV持续性感染机制
HBV持续性感染机制？ 答：免疫耐受和免疫抑制是乙肝病毒持续性感染的关键因素 （1）机体因素：免疫抑制，免疫耐受 （2）病毒因素：主要是变异和抑制 1.HBV持续性感染的免疫学机制 HBV进入人体后，首先激活固有免疫系统，启动细胞凋亡、分泌IFN-α/β等细胞因子途径，杀灭被感染细胞，抑制病毒生长与扩散，同时促进抗原递呈细胞( APC)、HBV特异性CD4+辅助细胞( Th) 、HBV特异性CD8+杀伤性T细胞和B细胞等增殖，建立适应性免疫。CD4+激活分化为Th1或Th2表型，前者主要调节细胞免疫应答，后者则介导体液免疫，在清除病毒过程中发挥关键作用。可引起细胞毒性T细胞(CTL)快速增殖及抗病毒分子干扰素γ(IFN—γ)、α和穿孔素的产生，从而以细胞裂解和非细胞裂解的方式清除感染HBV 的细胞。在此过程中，任何一个细胞细胞因子的数目和功能失调都可导致宿主对HBV的 清除能力下降，形成HBV持续性感染。 1.1固有免疫异常 INF-α/β受体(INFAR1) 启动子突变可导致激活物PRAR-1表达下降，使INF-α和INF-γ分泌减少，HBV的清除能力降低。检测HBV感染患者外周血免疫功能，发现患者体内巨噬细胞受体( NKR) 的表达水平较低，与之关的细胞溶解效应TNF和INF等因子也低。这可能是HBV持续感染的原因之一。 1.2抗原提呈细胞(APC) 数目减少、功能降低 未成熟的浆细胞样树突状细胞( pDC) 是产生内源性Ⅰ型干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ) 的主要细胞，其可在细胞核内表达Toll样受体-7(TLR-7) 和TLR-9当病毒感染时，pDC通过TLR-7和TLR-9刺激产生大量的Ⅰ型IFN，后者不仅直接抑制病毒复制，更重要的还可激活NK细胞、B细胞、T细胞和髓系DC(mDC)细胞，诱导并增强抗病毒的免疫应答。P HBV感染可下调TLR-9介导的干扰素调节因子-1(IRF-1）的表达和核异位，上调pDCs浆膜上负调控因子SOCS-1和IFN-а的抑制性受体BDCA-2的表达，阻断TLR9-MyD88-IRF-7-IFN-а信号途径，从而使IFN-а产生减少。 1.3CD4+、CD8+分化异常 由于CD8+的上升及CD4+T细胞生成的减少，使特异性抗体产生不足，不能有效清除游离的乙型肝炎病毒，而导致病毒在体内持续存在，并影响CD8+T细胞活性。CD8+细胞主要为T抑制(Ts )/T 细胞毒性细胞(CTL ) ，正常情况下，两者保持一定的比例，以维持机体的细胞免疫功能。CD8+增加是由于抑制性T细胞的增加所致，Ts细胞能够抑制免疫反应，其增殖可加重免疫抑制，使机体对乙型肝炎病毒反应低下。 1.4Th1、Th2水平低下，而Treg水平增高 Th1主要介导细胞免疫，在IFN-γ的作用下通过MHC-Ⅱ类分子作用分化而来，主要产生IL-4、IFN-γ; Th2主要介导体液免疫，在IL-4的作用下通过MHC-Ⅰ类分子作用分化而来，主要产生IL-4、IL-6、IL-10和IL-13; 同时IL-4可抑制Th1细胞功能，IFN-γ则抑制Th-1细胞功能; 而Treg可抑制免疫反应。有学者通过观察HBV转基因小鼠(Tg鼠) DC抗原呈递功能和T淋巴细胞的免疫活化状态，发现Tg 鼠DC表面MHC-Ⅱ类分子和CD80 表达低下，DC诱导脾淋巴细胞对HBsAg刺激的增生反应减弱，TC分泌的mIFN-γ、mIL-2、mIL-6及mIL-10均显著减少。说明TC针对HBV 的免疫活化状态欠佳，包括Th1和Th2功能都受到影响。也提示HBV相关的特异性细胞免疫和体液免疫均受到抑制。另外，宿主体内细胞因子，如Th1细胞因子( IL-2、IFN-γ) 和Th2细胞因子(IL-4、IL-6如IL-10) 的多态现象亦会影响T辅助细胞的活化。有研究发现，慢性乙型肝炎(CHB ) 患者外周血Treg 频率明显高于急性肝炎组，肝脏内Treg频率增加。CHB患者外周血Treg频率与病毒载量呈
病毒的复制过程
病毒的复制过程 病毒增殖的方式--- 自我复制( self replication) 当病毒进入活细胞后便发挥其生物活性。由于病毒缺少完整的酶系统，不具有合成自身成份的原料和能量，也没有核糖体，因此决定了它的专性寄生性，必须侵入易感的宿主细胞，依靠宿主细胞的酶系统、原料和能量复制病毒的核酸，借助宿主细胞的核糖体翻译病毒的蛋白质。病毒这种增殖的方式叫做“复制（Replication）”。病毒复制的过程分为吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配释放五个步骤，又称复制周期(Replication cycle)。 一、复制周期: （一）吸附(adsorption):病毒表面接触蛋白---- 细胞表面受体 吸附（Adsorption）是指病毒附着于敏感细胞的表面，它是感染的起始期。细胞与病毒相互作用最初是偶然碰撞和静电作用，这是可逆的联结。随后的特异性吸附是非常重要的，根据这一点可确定许多病毒的宿主范围，不吸附就不能引起感染。 脊髓灰质炎病毒的细胞表面受体是免疫球蛋白超家族，在非灵长类细胞上没有发现此受体，而猴肾细胞、Hela细胞和人二倍体纤维母细胞上有它的受体，故脊髓来质炎病毒能感染人体鼻、咽、肠和脊髓前角细胞，引起脊髓灰质炎（小儿麻痹）。 水磨石病毒的细胞表面受体是含唾液酸（N-乙酰神经氨酸）的糖蛋白，它与流感病毒表面的血凝素剌突（受体连结蛋白）有特殊的亲和力，如用神经氨酸酶破坏该受体，则流感病毒不再吸附这种细胞。 此外，HIV受体为CD4；鼻病毒的受体为细胞粘附分子-1（1CAM-1）；EB病毒的受体为补体受体-2（CR-2）。病毒吸附也受离子强度、pH、温度等环境条件的影响。研究病毒的吸附过程对了解受体组成、功能、致病机理以及探讨抗病毒治疗有重要意义。 （二）穿入(penetration):膜融合；病毒胞饮等 穿入（Penetration）是指病毒核酸或感染性核衣壳穿过细胞进入胞浆，开始病毒感染的细胞内期。 主要有三种方式：（1）融合(Fusion)，在细胞膜表面病毒囊膜与细胞膜融合，病毒的核衣壳进入胞浆。副粘病毒以融合方式进入，如麻疹病毒、腮腺炎病毒囊膜上有融合蛋白，带有一段疏水氨基酸，介导细胞膜与病毒囊膜的融合。（2）胞饮(Viropexis)，由于细胞膜内陷整个病毒被吞饮入胞内形成囊泡。胞饮是病毒穿入的常见方式，也是哺乳动物细胞本身具有一种摄取各种营养物质和激素的方式。当病毒与受体结合后，在细胞膜的特殊区域与病毒病毒一起内陷形成膜性囊泡，此时病毒在胞浆中仍被胞膜覆盖。某些囊膜病毒，如流感病毒借助病毒的血凝素（HA）完成脂膜间的融合，囊泡内低Ph环境使HA蛋白的三维结构发生变化，从而介导病毒囊膜与囊泡膜的融合，病毒核衣壳进入胞浆。（3）直接进入，某些无囊膜病毒，如脊髓灰质炎病毒与受体接角后，衣壳蛋白的多肽构形发生变化并对蛋白水解酶敏感，病毒核酸可直接穿越细胞膜到细胞浆中，而大部分蛋白衣壳仍留在胞膜外，这种进入的方式较为少见。 （三）脱壳(uncoating):细胞溶酶体酶；病毒脱壳酶 穿入和脱壳是边续的过程，失去病毒体的完整性被称为“脱壳(Uncoating)”。脱壳到出现新的感染病毒之间叫“隐蔽期”。经胞饮进入细胞的病毒，衣壳可被吞噬
乙肝病毒的复制过程
乙肝病毒的复制过程 在医学上，病毒的繁殖被称之为“复制”，在复制的过程中，有两个很重要的因素：一个是催化剂，另一个是模板。没有这两个因素，乙肝病毒就不能复制。乙肝病毒复制的“催化剂”就是乙肝病毒DNA（即HBV-DNA）聚合酶。没有这种聚合酶的作用，乙肝病毒的复制就会停止。 乙肝病毒的基因组（HBV-DNA）是由两条螺旋的DNA 链围成的一个环形结构。其中一条较长负链已经形成完整的环状；另一条长度较短的正链，呈半环状。在感染肝细胞之后，这条半环状的DNA链就会以负链为模板，在催化剂──HBV-DNA聚合酶的作用下延长，最终形成完整的环状。这时的乙肝病毒基因组就形成了一个完全环状的双股DNA。把这种DNA 称做共价闭合环状DNA（即cccDNA），可以把它看作是病毒复制的原始模板。模板形成后，病毒基因会以其中的一条cccDNA为模板，利用肝细胞基因中的酶和DNA 聚合酶的“催化”，一段基因又一段基因地复制，形成负链和正链。最后再装配到一起形成新的HBV-DNA 颗粒。 复制的第一步：黏附 HBV人侵人体后，依靠其外膜(表面抗原，HBsAg)能粘附在肝细胞膜上，当然，粘附的首要条件是HBsAg先要识别肝细胞膜。一旦粘附成功，HBv的外膜也就完成了它的使命，甩掉了外膜，HBV钻进肝细胞内。 复制的第二步；脱壳 HBV核心部分来到肝细胞内，在肝细胞浆中还要脱掉它的“核壳”(核心抗原即HBcAG 及E抗原即HbEAG)，这样，就暴露出了它最核心部分，即乙肝病毒核酸(HBv DNA)，HBV 大有“赤膊上阵”之意。HBVDNA包涵着乙肝病毒的全部基因，是它主宰着HBv的复制的。 复制的第三步：入核 HBv DNA从肝细胞浆内进入肝细胞核，在这里它要进一步发育完善，形成了HBv的“共价闭合环状脱氧核塘核酸”(HBv cccDNA)。这个cccDNA十分了得，它深深藏匿在肝细胞核内，而肝细胞核外面有一层坚韧的核膜。目药物都难以通过这坚韧的核膜，因而对cccDNA 也无可奈何，但cccDNA却掌控着HBv所有的遗传信息，指令着HBv的复制。因此．现有的药物想彻底消灭人体内的HBv真比登天还难，这些药物只能抑制HBv的繁殖或复制，“全部转阴”也只能是一种幻想。 复制的第四步：转录 HBV在这一阶段会以cccDNA为“模子”，像录音带似的把HBv cccDNA上的所有信息全都转录到“信息核糖核酸”(mRNA)上。这个转录过程需要人体内的酶类帮忙，因为所有的
HBV论文
关于乙肝型病毒（HBV）论文 课程医学微生物学 姓名陈洺 学号 11203090103 学院计算机科学与工程学院 专业网络工程 指导教师叶翠莲 2014 年4月 16 日
1.关于乙肝 1.1简要概述 乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一种以肝脏炎性病变为主并可引起多器官损害的一种病。主要侵犯儿童及青壮年。发展中国家发病率高，据统计，全世界无症状乙肝病毒携带者超过2.8亿，我国约占1.3亿。多数无症状，其中1/3出现肝损害的临床表现。目前我国有乙肝患者3000万。乙肝的特点为起病较缓，以亚临床型及慢性型较常见。无黄疸型持续阳性者易慢性化。本病主要通过血液、母婴和性接触进行传播。乙肝疫苗的应用是预防和控制乙型肝炎的根本措施。乙肝病毒是个古老的病原体，包括现在所谓的新发现病种其实在古代都有，只是随着科技的进步和化验手段的进步才被发现，并不等于发现他了才存在，没有发现即不存在。乙肝的标志性产物表面抗原在1965年在澳大利亚首次被发现，故简称‘澳抗’，这一天开始意味着乙肝病毒开始被了解、发现。 乙型肝炎病毒 (HBV) 属嗜肝DNA 病毒科 (hepadnaviridae)，基因组长约3.2kb ，为部分双链环状DNA。HBV 的抵抗力较强，但65℃10 小时、煮沸10 分钟或高压蒸气均可灭活HBV。含氯制剂、环氧乙烷、戊二醛、过氧乙酸和碘伏等也有较好的灭活效果。 我国的乙肝病毒感染率约60%-70%；乙肝表面抗原携带率约占总人口的7.18%，以此计算，全国约有9300万人携带乙肝病毒，其中乙肝患者大约有3000万。 这是传染性疾病，不是遗传病，早已经有了安全的乙型肝炎病毒疫苗，所以不要为这些数据而恐慌，请及时注射乙型肝炎病毒疫苗，这样就不会被感染。 1.2病发机制 乙肝病毒在肝内繁殖复制，但是对肝细胞无明显的直接损伤作用，这一点在HBV甲亢携带者中的得到病例和动物实验证实。有关慢性乙肝发病机制尚未清楚，但是已认识到与机体对HBV免疫应答异常有关，HBV持续感染所形成的慢性化主要是病毒诱导机体对其感染形成的一种持续免疫耐受状态，特别是与细胞毒性T细胞低反应状态有关。一般认为，乙肝病毒侵入人体后所引起的各种不同的临床表现，可能与机体免疫反应有关。病毒在肝细胞内复制和逸出本身不引起明显的肝细胞病变，只有当人体的免疫功能破坏含有病毒抗原物质的肝细胞膜时，才引起肝细胞的坏死和炎症。因此，如果人体免疫功能正常，肝炎病毒数量较少，毒力较弱，仅部分肝细胞受损，则表现为无黄疸型；如病毒数量较多，毒力较强，较多的肝细胞受损，则表现为黄疸型。如果人体免疫功能有严重缺陷（如先天愚型、白血病等），或为免疫耐受状态（特异性免疫无应答，如胎儿或新生儿感染HBV），或为免疫“麻痹”（病毒抗原过多或过少），则肝细胞内虽有病毒，但由于缺乏有效的免疫反应，肝细胞可不出现或仅出现轻微损害，则表现为病毒携带者。如果人体免疫功能低下，仅能清除一部分病毒，因而肝细胞不断受到一定损害，则表现为慢性迁延性。如果人体免疫调节功能发生紊乱，产生自身免疫或其他病理改变，使肝细胞和其他脏器受到更严重、更持久的损害，则形成慢性活动性。如果人体免疫活动过强，短时间内在门静脉内形成大量的抗原抗体复合物，引起大量肝细胞坏死，则出现急性重型肝炎，亚急性和慢性重型肝炎的发病机制可能与重型慢性活动性肝炎相似。在重型肝炎的发病机制中，肿瘤坏死因子也起着重大作用。
第三章 病毒的复制
第三章病毒的复制 第一节研究病毒复制的一般性方法 1.1建立病毒复制的实验研究系统 研究病毒的常用培养系统 ①噬菌体——细胞培养系统 用该系统研究噬菌体复制的优点： 敏感的宿主细菌易于在琼脂平板上培养，其数目易于控制； 噬菌体在细菌内增殖导致细菌培养物变清亮，在合适的接种密度下很容易在琼脂平板上形成噬斑，其结果容易观察； 噬菌体和细菌的增殖速度快、增殖周期短，在一定时间内可多次反复实验。 噬菌体同步感染敏感的细菌培养物—建立了测定一步生长曲线的实验方法，弄清了噬菌体的复制循环。 ②动物病毒—动物细胞培养系统 目前已建立了很多细胞株，包括脊椎动物细胞（哺乳动物细胞株）和无脊椎动物细胞（昆虫细胞株），为研究病毒复制打下了良好的基础。 在离体条件下，避免了机体内的控制机制及其他因素的影响，因此只能近似反映动物机体内病毒的复制过程。 ③植物病毒—原生质体培养系统 高活性的原生质体的分离和培养方法的建立，把病毒与植物机体或组织之间的复杂关系，转变为病毒与植物单细胞的简单关系，提高了感染效率。 植物体的单细胞体外培养目前无法实现。在植物体外，有由纤维素组成的细胞壁，植物病毒感染植物体的感染效率要低很多。前二者都是一个病毒感染一个细胞，但是要104～106个植物病毒才能感染一个植物体。 采用原生质体（去掉细胞壁），则病毒的感染效率大大提高。但是总的效率还是比噬菌体和动物病毒差。 无论是哪种培养系统，都要考虑： ①宿主细胞的敏感性与生理状态 ②注意感染复数病毒感染宿主细胞后，会导致宿主细胞出现裂缝，胞内的物质渗漏，使宿主细胞死亡。要尽可能做到感染复数为1，即一个对一个。 感染复数(multiplicity of infection, m.o.i) ：用以起始病毒感染的每个细胞所需的病毒颗粒数目。单位（PFU/cell） 1.2一步生长实验（定量描述烈性噬菌体的生长规律） 以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的敏感细胞，待病毒吸附后，再高度稀释病毒－细胞培养物（避免二次吸附），或以抗病毒抗血清处理病毒－细胞培养物（去除过量的噬菌体，也是为了避免二次吸附）以建立同步感染，然后继续培养，定时取样测定培养物中的病毒效价，并以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线，即一步生长曲线。体现3个时期：①潜伏期②突破期③平稳期 潜伏期中包含有隐蔽期(有感染性的病毒粒子从消失到出现这段时期) 潜伏期：噬菌体吸附到细胞到释放出新噬菌体的时间
中医药治疗乙型病毒性肝炎研究进展
作者：孔祥廉林慧盖丽丽梅全喜 【摘要】综述了近几年来中医药治疗乙型病毒性肝炎的药理作用和临床应用，显示出中医药具有抗乙型肝炎病毒、降低血清胆红素及转氨酶、抗肝纤维化、改善肝功能、调节免疫功能、改善临床症状等作用。指出在今后的研究中，统一中医诊断标准和疗效标准，以中医基础理论为指导，综合运用多种疗法，充分发挥中医药的治疗优势，以缩短疗程提高临床疗效。 【关键词】乙型病毒性肝炎中医药治疗药理作用临床应用 乙型肝炎病毒是一种嗜肝dna病毒感染人体后引起急性、慢性乙型肝炎、重型肝炎或成为无症状病毒携带者，迁延难愈，可发展成为肝硬化、肝癌等，给人体健康带来极大危害。目前全世界大约有二十亿的病毒感染者，其中3.5亿为慢性乙型肝炎患者。在我国就有一亿二千万乙型肝炎病毒携带者，比艾滋病的患者多一百倍。每年有30～50万人死于乙型肝炎引起的肝硬变或肝癌［1，2］，但对其发病机理至今尚未彻底明了。多数学者认为与免疫应答或免疫调节功能紊乱有关。目前国内外尚无满意的治疗方法与特效药物，虽有拉米夫定、干扰素等抗病毒药物问世，但由于治疗周期长、副作用大、易反跳、费用高等缺陷，尚不能满足于临床需求。令人可喜的是中医药治疗乙型病毒性肝炎显示出了独特的优越性，现就近年来中医药应用情况作一综述。 1 中药抗乙型肝炎病毒作用应国红等［3］对800种中草药水提物进行抗hbv的实验研究。实验筛选出15种对hbv活性有抑制作用的中草药，即土牛膝、鬼羽箭、蛇床子、钻骨龙、蛇莓、香薷、泽兰、益母草、女贞子、地骨皮、桑椹子、半枝莲、茜草、羊蹄、天花粉。其中天花粉、香薷可高效抑制hbv。应国红等［4］应用酶联免疫吸附实验（elisa）的方法，对180种中草药的水提取物进行抑制乙型肝炎病毒e抗原（hbeag）的实验研究，根据药物的综合药效指数（sei）评价药效，经筛选得抗hbeag的有效药7种：茴香油、羊蹄、女贞子、蛇莓、益母草、香薷、黄连，其中高效药2种，即茴香油（sei=1.90）、羊蹄（sei = 2.05）。徐舒等［5］采用pcr筛选技术研究白背叶根抗鸭乙型肝炎病毒的作用。实验结果显示，白背叶根有抑制体内d- hbv复制作用，其作用大小与剂量及用药时间相关；其治疗作用较拉米夫定弱，但作用维持时间长，且用药较为安全。谢志春等［6］采用反向间接血凝体外试验及乙型肝炎树鼩感染模型动物实验，从200种常用中草药中筛选出5种具有较高抑制hbsag活性的中草药，即珍珠草、丹参、五倍子、桑椹子、仙茅，这5种药物可使hbsag滴度从1: 32768降至1:16。进一步在树鼩体内进行抗乙肝病毒抑制实验，结果显示珍珠草及五倍子有较强抗hbsag作用。张晓双等［7］采用重庆麻鸭乙型肝炎动物模型，观察肝康乐颗粒（含柴胡、丹参、灵芝、五味子、茵陈等）在体内抗鸭乙型肝炎病毒（dhbv）的作用。结果显示肝康乐颗粒在鸭体内有一定抑制鸭乙型肝炎病毒dna的作用，且抗病毒作用与用药剂量有关，停药后dhbv-dna有反跳现象。范慧敏等［8］用肝舒胶囊（由太子参、茯苓、黄芪、白花蛇舌草、川萆薢、甘草等组成），灌胃给药10 d，发现第5天对dhbv-dna抑制率可达20%～30%，第10天抑制率可达50%，表明肝舒胶囊对鸭体内的dhbv-dna有很好的抑制作用。刘中景等［9，10］用小柴胡汤进行抗hbv体内外实验和组方机理分析。体内抗dhbv实验中，全方组、半方组（柴胡、黄芩、半夏、生姜）和单味柴胡组对dhbv均有抑制作用，以全方组作用最优，且抗dhbv作用比较持久，停药后无反跳现象；体外抗hbv实验，各剂量组对2215细胞hbsag和hbeag分泌均有抑制作用，也以全方组的抑制率最高，半方组次之，单方组抑制作用不明显。倪勤等［11］发现小柴胡片有体外直接抗hbv活性作用。陈压西等［12］则发现小柴胡汤胶囊在鸭体内也有一定的抗dhbv作用。有关临床研究还表明［13，14］，联合用药比单味药物的抗病毒作用更强。应用疏肝健脾益气药物，如柴胡、木香、炒枳壳、青皮、香附、鸡矢藤、沉香、佛手等；应用活血化痰药物如：昆布、海藻、瓜蒌、法夏、藿香、莱菔子、山楂、陈皮、枳壳、佛手等；应用调补肝肾药物，如淫羊藿、冬虫夏草、枸杞
乙肝病毒感染的标志
乙肝病毒进入人体后，迅速进入肝细胞内，并在肝细胞内复制产生新的病毒。新的病毒又进入其他肝细胞。使其受到感染，这样周而复始，使大量肝细胞受到感染。 乙肝病毒复制过程中会产生许多病毒蛋白抗原，包括表面抗原(HBsAg)、e 抗原(HBeAg)、核心抗原(HBcAg)等，这些抗原刺激人体免疫系统产生相对应抗体即表面体(抗一HBs)、e抗体(抗一HBe)。核心抗体(抗一HBc)等。其中HBsAg，HBeAg，抗一HBc同时阳性称之为“大三阳”。HBsAg，抗一HBe，抗一HBc阳性称之为“小三阳”。它们都是乙肝病毒感染的标志。 一般来讲，“大三阳”者体内病毒要多一些，传染性要强一些。肝内可能有活动性炎症;“小三阳”者体内病毒要少一些，传染性小一些，肝内炎症要轻一些。但肝硬化、肝癌患者乙肝病毒指标常常为“小三阳”，因此，“小三阳”不都意味着病情一定就轻一些。“大、小三阳”者可能是肝炎、肝硬化患者，也可能是病毒携带者。肝炎、肝硬化患者必须接受抗病毒等治疗，以阻止病情向前发展。 那么，乙肝病毒携带者需不需要治疗呢?根据肝脏穿刺组织学观察发现，大部分乙肝病毒携带者肝脏有不同程度损伤，只有15%左右乙肝病毒携带者肝脏组织学检查是正常的，有50%左右携带者已经发展为慢性肝炎、肝硬化。 对乙肝病毒感染者长期随访观察发现，血液中乙肝病毒量越大，携带时间越长，发展成肝硬化、肝癌的机会越大。因此，尽早清除乙肝病毒或者控制血液乙肝病毒量，十分必要。
1 乙肝病毒感染2+，4+，5+是什么意思，以后会有什么影响，能恢复正常吗？ 是不是乙肝病毒携带者，以后还能陪感染吗？如果要孩子，会不会对孩子有影响 4，5项恢复后会转成阴性吗？以上几项想知道详细点的解答？ 答：从概率上讲，90%到95%都没事，不用担心，如果要100%排除，就去做个肝功检查和乙肝DNA检查。 不是乙肝病毒携带者。 第4项比较容易转阴，第5项不好说，有的人很快就转阴，有的人终身也是阳，有点难，但什么也不影响，第5项你可以理解为是标记着乙肝病毒的尸体，虽然曾经的乙肝病毒已经被你的身体免疫系统清楚了，但留下了尸体你还可以看到。可以也要孩子，不会对孩子产生影响。 .
乙型肝炎病毒
乙型肝炎病毒简称乙肝病毒。是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科（hepa DNA vividae）。根形态与结构 HBV病毒颗粒图示 1．大球形颗粒：亦称Dane颗粒，它是一种由一个囊膜和一个含有DNA分子的核衣壳组成的病毒颗粒，直径约42nm.核衣壳为20面体对称结构。游离的核衣壳只能在肝细胞核内观察到。血中Dane颗粒浓度以急性肝炎潜伏期后期为最高，在疾病起始后则迅速下降。Dane颗粒表面含有HBsAg，核心中还含有双股有缺口的DNA链和依赖DNA的DNA多聚酶。目前认为Dane颗粒即完整的HBV。 HBV DNA的两链长短不一，长链（L）完整，为负链，长度恒定，约3200个核苷酸。短链（S）为正链，长度可变，约为长链长度的50～100%，链的增生按5′-3′顺序进行。在不同分子中短链3′端的位置是可变的，而短链和长链的5′端位置固定点为粘性末端，通过250～300个核苷酸碱基配对，以维持DNA分子的环状结构。在粘性末端两侧，两链5′端各有一个由11个bp组成的直接重复序列（Direct repeat DR）-5′TTCACCTCTCC，该DR位于第1824个核苷酸者称DR1，位于第1590个核苷酸者称DR2，在病毒复制中起作用。 2．小球形颗粒：直径约22nm的小球形颗粒是HBV感染后血液中最多见的一种。它由HBsAg，即病毒的囊膜组成。化学组成为脂蛋白，可按其特有的密度与正常血清蛋白部分分离。在此颗粒中未检出达DNA多聚酶活性。目前认为HBV的小颗粒不是HBV，可能是它感染肝细胞时合成过剩的囊膜而游离于血循环中。
3.管形颗粒：直径约22nm，长度可在100～700nm之间。实际上它是一串聚合起来的小颗粒，但同样具有HBsAg的抗原性。 基因结构 目前，已可从感染HBV病人的血清中及感染肝脏提纯的病毒核心中分离出环状双股DNA，从而确定HBV属DNA病毒。 研究Dane颗粒DNA结构发现，DNA分子含有约3，200个核苷酸。它包括两个链；一个长度固定的负链和另一长度不定的正链。由于DNA生物合成是在多聚酶作用DNA引物生长末端3′－OH 与加入的脱氧核苷酸的5'-磷酸基形成磷酸二脂键完成的，因此，链的增生按5'-3'顺序进行，而且加到链上的每种脱氧核苷酸是按模板DNA的碱基配对互补规律进行，长链在1，800或1，818核苷酸附近有一个制品。短链的5'-末端通过长达250-300个核苷酸的碱基配对而维持分子的环状结构。DNA多聚酶作用不断延长短链3′端以修补缺口。缺口可能与HBV的DNA在感染细胞内的整合有关。 目前，由于克隆化DNA完整核苷酸已经确定，现已证实HBsAg和HBcAg都是由Dane颗粒的DNA 所编码，并且二类基因存在同一DNA分子上。有人比较病毒基因编码能力和病毒多少，发现HBV DNA负链能编码全部已知的HBV蛋白质，而其正链开放读码区，不能编码病毒蛋白。 HBV DNA负链有四个开放区，分别称为S、C、P及X（图26-2），能编码全部已知的HBV蛋白质。S区可分为二部分，S基因和前S基因。S基因（核苷酸155～833）能编码主要表面蛋白。S基因之前是一个能编码163个氨基酸（2，848-154）的前S基因，编码Pre S1和Pre S2蛋白。C 区基因包括前C基因和C基因，分别编码HBeAg和HBcAg.P区最长，约占基因组75%以上，编码病毒体DNA多聚酶。X区（核苷酸1，374～1，835）可能编码有154个氨基酸的碱性多肽，长链的裂口位于此区。 HBV的抗原组成 1.HBsAg：HBsAg是由HBV的基因组所特定的，为上述三种形态的颗粒所共有。 HBsAg抗原活性属于高浮力密度范围内的脂蛋白类。用CsCl密度梯度离心，表面抗原（小颗粒和管状颗粒）平均密度为1.20g/cm2.Dane颗粒的密度略高，为1.25g/cm2。纯化的22nm颗粒的平均沉降系数为33-54S，分子量约为24-2.5×106。 纯化的HBsAg含有类脂质、糖类、脂质、蛋白质及糖蛋白。它由8种多肽组成，定名为P1至P8.其中至少有二种或三种多肽过碘酸Schiff试验阳性，提示存在糖类结构。用紫外分光光度计检查提取的HBsAg，显示有典型的蛋白吸收光谱。蛋白占总量的70～90%以上，广义的HBsAg由三种蛋白组成：（1）主要表面蛋白（S蛋白，小分子HBsAg），由S基因编码的226个氨基酸组成。（2）中分子蛋白（中分子HBsAg），由前S2、S基因编码，在S蛋白226个氨基酸的N端附加一个含55个氨基酸的Pre S2蛋白组成，共281个氨基酸。（3）大分子蛋白（大分子HBsAg），由S，前S1和前S2基因编码，在中分子蛋白281个氨基酸的N端附加一个含119个氨基酸的Pre S1蛋白组成，共400个氨基酸。 S蛋白即狭义HBsAg，是HBV囊膜的主要表面抗原的主要成份，包括糖基化的GP27和非糖基化的P24两种形式，以二硫键相连形成二聚体，代表HBsAg的结构单位，具备完整的抗原性。如二聚体解离，则HBsAg抗原性将会明显下降。
hbv复制过程
HBV复制过程：HBV基因组虽为双链环形DNA，但其复制过程有RNA逆转录病毒的特性，需要逆转录酶活性产生RNA/DNA中间体，再继续进行复制。其过程为：①在由病毒和/或细胞来源的DNA-p作用下，正链首先延伸形成共价闭合环状DNA（Covalently Closed Circular DNA）。②以此为模板，通过宿主肝细胞酶的作用转录成复制中间体。③再以此为模板，通过逆转录酶的作用，形成第一代和第二代DNA。此双链DNA部分环化，即完成HBV-DNA的复制。HBV突变株研究由于HBV复制方式有其特殊性，即mRNA中间体进行逆转录过程中，由于缺乏校对酶（Proofreading Engymes）易发生HBV-DNA序列内变异。①S区基因突变导致HBsAg亚型改变及血清HBsAg阴性、HBV-DNA阳性乙型肝炎，使临床诊断困难。一些人接种乙型疫苗后产生抗-HBs，但仍可被HBV的S区基因突变株感染，而逃避宿主的免疫反应。②前C基因区突变与HBV感染后免疫及重型肝炎发病有关。一般认为乙型肝炎患者HBeAg转阴，抗-HBe转阳，表示HBV复制活跃程度减弱，临床症状好转。然而，一些患者当HBeAg转阴后，仍有病毒复制及病情进行性发展，其血清中除检出HBsAg和抗-HBe外，还可检出HBV-DNA、抗-HBcIgM，肝内HBcAg阳性，排除其他致肝损害的原因，提示病情变化与HBV有关。其特点为不易自然缓解，常发展为肝硬化，抗病毒治疗反应差。经研究表明，此类患者系感染了前C基因突变HBV突变株。③P区基因突变可致HBV复制减弱或停止。④X区基因突变可使HBxAg合成障碍。近年发现一些HBV感染者抗-HBc始终测不出；有些恢复期患者也测不出抗-HBs，甚至有些患者HBV 标志均阴性，但能检出HBV-DNA，在肝细胞内和肝细胞膜上存有HBcAg和HBsAg。将这类患者血清感染黑猩猩可引起典型的肝炎表现。曾有学者称之为HBV2。近年研究表明，这些患者的血清中HBV-DNA序列分析，发现S区、C区、X区有多个点突变，提示HBV2为HBV的突变株。 ====================================================================== 由于HBV在复制过程中有一个逆转录的中间环节，其中的逆转录酶并不具 有校正修复的功能，因此HBV病毒与其它DNA病毒比较，变异的发生率可高 达l0倍以上，关于HBV变异的研究在近年已有较大的突破，对部分变异位点 的研究结果和解释基本一致，但仍有一些尚未明确的机理性问题需要进一步的 探讨。
病毒的复制增殖过程
病毒的复制增殖过程 病毒不具有能独立进行代谢的酶系统，因此只有进入活的易感宿主细胞内，由宿主细胞提供合成病毒核酸与蛋白质的原料，如低分子量前体成分、能量、必要的酶等，病毒才能增殖。病毒增殖的方式不是二分裂，而是自我复制。即以病毒核酸为模板，在DNA多聚酶或RNA多聚酶及其他必要因素作用下，合成子代病毒的核酸和蛋白质，装配成完整病毒颗粒并释放至细胞外。病毒复制（replication）一般可分为吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配与释放5个阶段，称为复制周期（replication c ycle）。病毒经过复制产生大量的子代病毒，而此时，宿主细胞的生物合成则受到不同程度的抑制和破坏。 一、病毒复制周期 吸附（adsorption）吸附于宿主细胞表面是病毒感染的第一步。吸附主要是通过病毒体表面的配体蛋白与易感细胞表面特异性受体相结合。不同细胞表面有不同受体，它决定了病毒的不同嗜组织性和感染宿主的范围，如小RNA病毒衣壳蛋白特定序列能与人及灵长类动物细胞表面脂蛋白受体结合，而腺病毒衣壳触须样纤维能与细胞表面特异性蛋白相结合。有包膜病毒多通过表面糖蛋白结构与细胞受体结合，如流感病毒HA糖蛋白与细胞表面受体唾液酸结合发生吸附；人类免疫缺陷病病毒（HIV）包膜糖蛋白gp120的受体是人Th细胞表面CD4分子；EB病毒则能与B细胞CD21受体结合。无受体细胞不能吸附病毒，也不能发生
感染。细胞含受体数不尽相同，最敏感细胞可含10万个受体。吸附过程可在几分钟到几十分钟内完成。 穿入（penetration）病毒与细胞表面结合后，可通过胞饮、融合、直接穿入等方式进入细胞。胞饮类似吞噬泡，细胞内陷将病毒包进细胞浆内，无包膜病毒多以胞饮形式进入易感染动物细胞内。融合是指病毒包膜与细胞膜融合，包括病毒融合蛋白与细胞第二受体的作用，如HIV 与CCR5的结合。融合后再将病毒的核衣壳释放至细胞浆内。还有少数无包膜病毒在吸附时某些蛋白衣壳的多肽成分发生改变，从而可直接穿过细胞膜。 脱壳（uncoating）病毒脱去蛋白衣壳后，核酸才能发挥作用。多数病毒穿入细胞后，在细胞溶酶体酶的作用下，脱去衣壳蛋白释放病毒核酸。痘病毒脱壳过程复杂，分为两步。先由溶酶体酶作用脱去外壳蛋白，再经病毒编码产生的脱壳酶脱去内层衣壳，方能使核酸完全释放出来。 生物合成（biosynthesis）病毒脱壳后，进入生物合成阶段，即病毒利用宿主细胞提供的环境和物质合成大量病毒核酸和结构蛋白。病毒核酸在细胞内复制的部位因核酸类型不同而不同。除痘病毒外，DNA病毒都在细胞核内复制；除正粘病毒和逆转录病毒外，RNA病毒均在细胞浆内复制。 生物合成一般分早期和晚期两个阶段。早期蛋白合成阶段是病毒早期基因组在细胞内进行转录、翻译而产生病毒生物合成中必需的酶类及某些