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柱色谱,薄层色谱

实验七柱色谱

计划学时: 3 学时

实验目的:学习柱色谱的操作方法。

实验原理:(同实验六)

柱色谱(柱上层析)常用的有吸附色谱和分配色谱两类。吸附色谱常用氧化铝和硅胶作固定相;而分配色谱中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂,以吸收较大量的液体作固定相,而支持剂本身不起分离作用。

吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂。当待分离的混合物溶液流过吸附柱时,各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时,由于不同化合物吸附能力不同,往下洗脱的速度也不同,于是形成了不同层次,即溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带,再用溶剂洗脱时,已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集;或将柱吸干,挤出后按色带分割开,再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来。

实验装置及样品:

1 、装置图:(略)

( 1 )吸附剂

常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。吸附剂一般要经过纯化和活性处理,颗粒大小应当均匀。对于吸附剂而言,粒度愈小表面积愈大,吸附能力就愈高,但颗粒愈小时,溶剂的流速就太慢,因此应根据实际分离需要而定。供柱色谱使用的氧化铝有酸性、中性、碱性三种:

酸性氧化铝用 1% 盐酸浸泡后,用蒸馏水洗至氧化铝的悬浮液 pH 为 4 ,用于分离酸性物质。

中性氧化铝其悬浮液的 pH 为 7.5 ,用于分离中性物质。

碱性氧化铝其悬浮液的 pH 为 10 ,用于胺或其它碱性物质的分离。

大多数吸附剂都能强烈地吸水,而且水分易被其它化合物置换,因此吸附剂的活性降低,通常有加热方法使吸附剂活化。氧化铝随着表面含水量的不同,而分成各种活性等级。

活性等级的测定一般采用勃劳克曼( Brockmann )标准测定法.

( 2 )溶质的结构与吸附能力的关系

化合物的吸附性与它们的极性成正比,化合物分子中含有极性较大的基团时,吸附性也较强,各种化合物对氧化铝的吸附性按以下次序递减:

酸和碱 > 醇、胺、硫醇 > 酯、醛、酮 > 芳香族化合物 > 卤代物、醚 > 烯 > 饱和烃

在本实验中,乙酰二茂铁极性大于二茂铁,因此,二茂铁首先被洗脱下来。

( 3 )溶剂

溶剂的选择是重要的一环,通常根据被分离物中各化合物的极性、溶解度和吸附剂的活性等来考虑。

先将要分离的样品溶于一定体积的溶剂中,选用的溶剂极性要低,体积要小。如有的样品在极性低的溶剂中溶解度很小,则可加入少量极性较大的溶剂,使溶液体积不致太大。

色层的展开首先使用极性较小的溶剂,使最容易脱附的组分分离。然后加入不同比例的极性溶剂配成的洗脱剂,将极性较大的化合物自色谱柱中洗脱下来。常用洗脱剂的极性按如下次序递增:

己烷和石油醚 < 环己烷 < 四氯化碳 < 三氯乙烯 < 二硫化碳 < 甲苯 < 苯 < 二氯甲烷 < 氯仿 < 乙醚< 乙酸乙酯 < 丙酮 < 丙醇 < 乙醇 < 甲醇 < 水 < 吡啶 < 乙酸

所用溶剂必须纯粹和干燥,否则会影响吸附剂的活性和分离效果。

本实验所用溶剂为石油醚:乙醚= 3 : 1 的混合溶剂(学生自己配制)。

吸附剂色谱的分离效果不仅依赖于吸附剂和洗脱剂的选择,而且与制成的色谱柱有关:

( 1 )柱中的吸附剂用量为被分离样品量的 30 — 40 倍,若需要可增至 100 倍;

( 2 )柱高和直径之比一般是 75 : 1 ;

( 3 )装柱有湿法和干法两种,本实验采用湿法装柱,无论采用哪种方法装柱,都不用使吸附剂有裂缝或气泡。

2 、样品:粗制的乙酰二茂铁乙醚溶液

实验操作步骤:

1 、装柱(湿法)

用镊子取少许脱脂棉放于干净的色谱柱底部,轻轻塞紧;再在脱脂棉上盖上一层厚 0.5cm 的石英砂,关闭活塞;向柱中倒入 3 : 1 石油醚 / 乙醚混合溶剂至约为柱高的 3/4 处,打开活塞,控制流出速度为滴/s ;通过一干燥的玻璃漏斗慢慢加入色谱柱用中性氧化铝,并用橡皮塞轻轻敲打色谱柱下部,使填装紧密(见【注释】),当装柱至 3/4 时,再在上面加一层厚 0.5cm 的石英砂(见【注释】)。操作时一直保持上述流速注意不能使液面低于砂子的上层(见【注释】)。

2 、加样品( 1ml 粗制的乙酰二茂铁乙醚溶液)

当溶剂液面刚好流至石英砂面时,立即沿柱壁加入 1ml 粗制的乙酰二茂铁乙醚溶液,当此溶液流至接近石英砂面时,立即用 0.5ml 乙醚洗下管壁的有色物质,如此连续 2 — 3 次,直至洗净为止。

3 、洗脱

用 3 : 1 石油醚 / 乙醚混合溶剂(学生自己配制)洗脱,控制流出速度如前。整个过程都应有洗脱剂覆盖吸附剂。

二茂铁因极性小首先向下移动,极性较大的乙酰二茂铁则留在柱的上端,形成不同的色带。当最先下行的色带快流出时,更换另一接受瓶,继续洗脱,至滴出液近无色为止,再换一接受瓶。

4 、回收洗脱液

将先洗脱的洗脱液倒入二茂铁溶液回收瓶中,而将后洗脱的洗脱液倒入乙酰二茂铁溶液回收瓶中。

实验关键步骤:

?装柱要紧密,要求无断层、无缝隙。

?在装柱、洗脱过程中,始终保持有溶剂覆盖吸附剂。

一个色带与另一色带的洗脱液的接受不要交叉。

柱色谱,薄层色谱

一、邻硝基苯胺和对硝基苯胺的分离

邻硝基苯胺由于形成分子内氢键,极性小于对硝基苯胺,对硝基苯胺可与吸附剂形成氢键,利用柱色谱可将二者分离。

1.试剂

中性氧化铝,3 mL邻硝基苯胺和对硝基苯胺的苯溶液(此溶液由0.55 g对硝基苯胺和0.7 g邻硝基苯胺溶于100 mL苯中配成)

2.操作

用中性氧化铝和适量的无水苯按照上述方法制备色谱柱。

当苯的液面恰好降至氧化铝上端的表面上时,立即用滴管沿柱壁加入3 mL邻硝基苯胺和对硝基苯胺混合液。当溶液液面降至氧化铝上端表面时,用滴管滴入苯洗去沾附在柱壁上的混合物。然后在色谱柱上装置滴液漏斗,用苯淋洗,控制滴加速度如前,直至观察到色层带的形成和分离。当黄色邻硝基苯胺色层带到达柱底时,立即更换另一接受器,收集全部此

色层带。然后改用苯-乙醚(体积比1:1)为洗脱剂,并收集淡黄色对硝基苯胺色层带。

将收集的邻硝基苯胺的苯溶液和对硝基苯胺的苯-乙醚溶解分别用水泵减压蒸去溶剂,冷却结晶,干燥后测定熔点。邻硝基苯胺和对硝基苯胺的熔点分别为71~71.5℃,147~148 ℃。

本实验约需5 h

薄层色谱

二、 镇痛药片APC 组分的鉴定

普通的镇痛药如APC 通常是几种药物的混合物,大多含阿斯匹灵、咖啡因和其它成分,由于组分本身无色,需要通过紫外灯显色或碘熏显色,并与纯组分的R f 值比较来加以鉴定。

1. 试剂

APC 镇痈药片,2%阿斯匹灵的95%乙醇溶液,2%咖啡因的95%乙醇溶液,95%乙醇,12:1的1,2-二氯乙烷-乙酸溶液

2. 操作

(1) 样品液的制备

取1片镇痛药APC 研成粉状。用棉球塞住1支滴管的细口,将粉状APC 转入其中堆成柱状,用滴管从上口加入5 mL 95%乙醇通过柱状的镇痛药粉,萃取液收集于小试管中。

(2) 点样

取2块制备好的薄层板,分别在距一端1 cm 处用铅笔轻轻划一横线为起始线。用毛细管在一块板的起始线上点萃取液和2%的阿斯匹灵乙醇溶液两个样点,在第二块板的起始线上点萃取液和2%的咖啡因乙醇溶液两个样点。样点间距1~1.5 cm ,样点直径在2 mm 内。

(3) 展开

待样点干燥后,小心放入已加入展开剂(12:1的1,2-二氯乙烷-乙酸溶液)的250 mL 广口瓶中进行展开。瓶的内壁贴一张高5 cm 环绕周长约4/5的滤纸,下面浸入展开剂中0.5 cm ,盖好瓶塞,展开剂前沿上升至离板上端1 cm 处取出,尽快用铅笔在展开剂前沿划一记号。

(4) 鉴定

将烘干的薄层板放入254 nm 紫外分析仪中照射显色,可清晰地看到粉红色亮点,说明APC 药片中3种主要成分都是荧光物质。用铅笔绕亮点作出记号,计算每个点的R f 值。并与标准样品比较,如测定值和参考值误差在20%以下,即可肯定为同一化合物。如误差超过20%,则需重新点样并适当增加展开剂中醋酸的比例。

再将层析板置于放有几粒碘结晶的广口瓶内,盖上瓶盖,直至暗棕色的斑点明显时取出,并与先前在紫外分析仪中用铅笔作出的记号进行比较。

水杨酰胺 阿斯匹灵 菲那西汀

(R f = 0.46) (R f = 0.36) (R f = 0.25) 咖啡因 扑热息痛(R f = 0.27) (R f = 0.06)N N N O CH 3O

CH 3H 3C NHCOCH 3OH NHCOCH 3

OCH 2CH 3CONH 2

OH COOH OCOCH 3

展开剂如果过多,会有何后果?(可能会淹没所画出来的细线,从而溶解所点的样) 如果斑点出现拖尾现象,这可能是身原因?(所点的试样的样点的圈太大)

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