(整理)革兰氏染色的机理和步骤

1.革兰氏染色的机理和步骤

机理：G+、G-主要由其CW化学成分的差异而引起对乙醇的通透性，抗脱色能力的差异。主要有肽聚糖的厚度和结构所决定。

G+的CW:肽聚糖层厚，脂质含量低。乙醇脱色时CW脱水，孔径减少，透性降低，不易脱色，呈初染得蓝紫色。

G-的CW：肽聚糖层薄，脂质含量高。乙醇脱色时，类脂被乙醇溶解，透性升高，细胞被复染显红色。

步骤：①涂片：在干净的载玻片上滴一滴水，用接种环挑取菌体均匀涂布于水中。

②固定：将玻片靠近酒精灯火焰，蒸干水分，但不要烤焦。

③初染：用碱性颜料结晶紫对菌液涂片进行初染。

④媒染: 以碘液媒染1min，水洗，吸干水分。(细胞内形成结晶紫与碘的复合物，增强相互作用）

⑤脱色(关键步骤）：以95%的乙醇脱色30s，应适当振荡均匀，是乙醇脱色完全。

⑥水洗，吸干。

⑦复染：??(第2张）复染30s，水洗吸干。

⑧干燥镜检。

2、用渗透皮层膨胀学说解说芽孢耐热机制。

芽孢的耐热性在于芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差，以及皮层的离子强度很高，这就使皮层产生了极高的渗透压去夺取芽孢核心中水分，其结果造成皮层的充分膨胀和核心的高度失水，正是这种

失水的核心才赋予芽孢极强的耐热性。

3、引起微生物培养过程中PH变化的几种可能反应，并说明如何能够维持微培PH稳定。

答：培养过程中，由于营养物质被分解利用，代谢产物的形成与积累，会导致PH变化。

（第2张中的图）

还与培养基的C/N比有关，C/N高，经培养基后PH显著下降，C/N 低，经培养基后PH明显上升。

PH调节：①加入缓冲剂--------常用:一氢二氢磷酸盐，K2HPO4 呈碱性，KH2PO4 酸性，只在一定的PH范围内调节（6.4--7.2）

②大量产酸的菌株，加CaCO3调节，CaCO3难溶于水，不会使培养液的PH过度增加，但可不断中和微生物产的酸。

③培养液中存在天然的缓冲系统，如AA，肽，Pr均属两性电解质，也起缓冲的作用。

④过酸：治标------加NaOH、Na2CO3中和，治本-----加适量氮源：NaNO3、Pr、NH3·H2O；增加通风量。

⑤过碱：治标-----H2SO4、HCl中和，治本----加适量碳源:G类，脂类;减小通风量。

3、抗生素法和菌丝过滤法为何能浓缩营养缺陷型突变株？

抗生素法（青霉素法）：适用于细菌。原理：青霉素抑制肽聚糖链间的交联，组织了合成完整的CW，野生型B处于正常生长繁殖，所以对青霉素敏感，可被抑制或杀死；营缺B在基本培养基上休眠状态

存活下来，从而达到浓缩营缺型目的。制霉菌素法适用于真菌，其可与cm上？（第1张）醇作用，引起cm损伤，因为它只能杀死生长繁殖着的真菌，所以......

菌丝过滤法:基本培上，野生型霉菌，？菌的孢子能萌发并长成菌丝，而缺型孢子一般不萌发，或不能长成菌丝，因此培养一段时间后，用灭菌脱脂棉或滤纸滤去菌丝，收集滤液，重复数遍后可除去大部分野生型，从而……

4、生产蛋白酶的枯草芽孢杆菌发生遗传变异，使得产量性状下降，你如何解决？写出具体实验方案。

答：将一定量的枯草芽孢杆菌培养液，做一定浓度的稀释，涂布在含有酪素蛋白质的基本培养基上，37°C培养一段时间后，取出培养基，观察单菌落形成的透明圈大小，取透明圈直径与菌落直径之比较大的菌落，挑取培养做进一步的鉴定，即可得到高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌。

5、以磺胺为例，说明化学治疗机的作用机制。

答：机理:磺胺是叶酸组成部分对氨基苯甲酸的结构类似物，（磺胺类药物取代对氨基苯甲酸，干扰叶酸的合成，抑制了转甲基反应，导致代谢紊乱，从而抑制B生长），磺胺的抑菌作用是因为许多细菌需要自己合成叶酸而生长，磺胺对人体细胞无毒性，因为人体缺乏从对氨基苯甲酸合成叶酸的相关酶-----二氢叶酸合成酶，不能用外界提供的对氨基苯甲酸自行合成叶酸，而必须直接利用叶酸为生长因子进行生长。（磺胺类----与正常代谢产物竞争酶的活性中心，干扰了酶的功能，

从而干扰代谢的正常进行）。

6、画出生长曲线。（第1张）

1、微生物的共性？哪个最基本?

答：①体积小，面积大（最基本）②吸收多，转化快③生长旺，繁殖快思适应性强，易变异⑤分布广，种类多。

2、比较G+，G- B在CW结构，组成，对溶菌酶，青霉素的敏感性4方面的异同点。

结构成分对溶菌酶青霉素

G+ 单层，组分

简单，厚肽聚糖（90%）磷

壁酸（10%）

敏感生长期的

G+对其敏感

G- 多层，组分

复杂，薄内壁层：肽聚糖外

膜：脂多糖，磷脂，

脂蛋白

敏感不敏感

3、表型延迟现象？如何克服？

答：表型延迟：表型的改变落后于？（第四张）改变的现象，分为①分离性延迟;突变的？经DNA复制和细胞分裂后变成纯合状态，表型才能表现出来。②生理性延迟;杂合状态→纯合状态，仍不能表现出来，（如营缺型）通过中间培养（CM，培养过夜），可使突变？稳定下来，克服表型延迟。

4、培养B常用的斜面培养基是什么？简述配制程序。

答：牛肉膏蛋白胨培养基

①称量;按配方依次准确称量②融化:取少量水于烧杯中，加1%的蛋白胨，加热溶解，加0.5%的牛肉膏，加热溶解，加0.5%的NaCl,热熔，加水补充到所需体积。③调PH至7.6左右。④加琼脂固体2%，热熔。

⑤分装入试管，加塞，包扎，高压灭菌⑥搁置斜面（斜面长度不超过试管一半）⑦无菌检查：将灭菌的培养基放入37°C的温室中培养24-28h，以检查灭菌是否彻底。

5、啤酒酵母在分批发酵中的生长曲线分哪几个时期？在菌种扩培时，哪个时期做种子？为什么？

答：延滞期，对数生长期，稳定期，衰退期。对数期做种子。利于缩短延滞期。

6、菌种衰退的根本原因？防治措施？

答：？的自发突变。

措施：①减少传代次数②创造良好的培养条件③采用不易衰退的菌种传代④采取良好的菌种保藏措施

4、菌种衰退的根本原因，防止措施。如何区分衰退和饰变？

答：根本原因：？的自发突变。（②传代次数的影响，是负突变株比例占优势，③培养条件）

防止措施见上题。

区分：衰退：指随着菌体的不断生长，负突变菌株的数量占整个菌体数量的比例增大，最终导致菌株的生产性能大幅下降的现象。

①原有形态性状不典型，②生长速率下降③代谢产物生产力下降④对

宿主侵袭力下降⑤抵抗力下降

饰变:遗传物质结构不发生变化，而只在转录与转译水平上的表型变化，可以同一条件继续培养，观察子代的情况。

饰变特点：暂时性，不可遗传性，表现为全部个体的行为。变异：遗传性，群体中极少数个体的行为。

5、gone？突变的特点？

答：①自发性②非对应性③稀有性（突变率10-6~10-9）④独立性⑤可诱发性（升高10~10^5倍）⑥稳定性⑦可逆性（原养型<=>突变型）6、v（第三张）的特点。

答：①形体微小，能通过细胞滤器（0.22um），电子显微镜下才能看见②不具有细胞机构，主要成分NA，Pr③V只含有一种核酸，DNA 或RNA④无核糖体，即无产能酶系，也无Pr,NA合成酶系，专性活细胞内寄生⑤无个体生长，也不进行二分裂，以NA,Pr等“元件”装配，实现大量繁殖。⑥离体下以无生命的生物大分子状态存在⑦对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感。

7、？月元病毒的致病机理。

答：月元病毒是一种Pr侵染颗粒，仅有Pr组成，称作PrP。

细胞型PrP----PrP^c对蛋白酶敏感，无凝聚能力，而致病型PrP---PrP^sc对蛋白酶有一定抗性，可凝集成纤维状组织，PrP^sc进入细胞后，与PrP^c结合，形成PrP^sc---PrP^c复合体，PrP^c构型发生改变，转化成PrP^sc，PrP^sc数量呈指数增加，其潜伏期长，对中枢神经损害严重。

估菌计数法及其特点（笔记P31）

乳糖操纵子（P30）

1、

营养价值融化温度（℃）凝固温度（℃）常用C(%)

琼脂无96 40 1.5~2.0

明胶氮源35 20 5~12

2、伴孢晶体？它在何种B中产生？

答：伴孢晶体：苏云金芽孢杆菌等少数芽孢杆菌在其形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体（δ肉毒素）称为伴孢晶体。

对约200种昆虫无为鳞翅目幼虫有毒杀作用，可制成B杀虫剂。

3、霉菌菌落的特征？

答：①质地疏松，呈絮状，网状，绒毛状，地毯状。②形态大，分为局限性生长（青、曲）和蔓延性生长（根毛）③菌落干燥（孢子）

④颜色丰富，正反颜色常不一致，中心与边缘常不一致。⑤各种霉菌，在一定培养基上，形成的菌落大小，形状，颜色相对稳定，为分类依据之一。

4、利用磷酸盐或碳酸钙如何维持PH稳定性？

答：①磷酸氢二钾略呈碱性，磷酸氢二钾略呈酸性，两物质以等摩尔浓度溶液PH为6.8，其缓冲能力一般在6.4~7.2范围内有效。

磷酸氢二钾+H阳离子---->磷酸氢二钾+K阳离子

磷酸二氢钾+K阳离子+OH- →磷酸氢二钾+H2O

②大量产酸的菌株，加入碳酸钙调节，碳酸钙难溶于水，不会使培养基PH过度升高，但可不断中和微生物产的酸，同时放出二氧化碳，而降培养基PH控制在一定范围。

5、单倍体酵母细胞经??（第5张）诱变后，得到一系列的突变株，欲从中分离筛选出一株（Leu-),请设计合理的试验程序。

答：淘汰型野生型→（制霉菌素法）→检出→鉴定（滤纸片法）

将单倍体酵母细胞突变株，制成菌悬液，均匀涂布于完全培养基上，长成单个菌落之后，以逐个检出的方式接种于完全培养基上，并影印到基本培养基上，在适宜条件下培养一段时间，在完全培养基上生长，而在基本培养基上不生长的，即为营养缺陷型菌株。将此菌株检出离心，水洗之后制成适当浓度的菌悬液，与基本培养基均匀混合后，倾注于平板中，干燥凝固之后，在板上划分几个区，在区中加入蘸有色AA的滤纸片，经培养后，在纸片周围有浑浊的生长圈的，说明为色AA营养缺陷株。

6、MR,V.P.实验的原理。

答：MR：用来检测由G产生的有机酸，如甲酸，乙酸，乳酸等，细菌代谢糖产酸，PH降低，甲基红指示剂由橙色（PH=6.3）变成红色（PH=4.2）

大肠杆菌---阳性：利用乳糖产生乳酸，培养后PH<4.5

大肠杆菌---阴性：早起产有机酸，后转化有机酸→乙醇，丙酮酸。

②V.P. 用来测定细菌利用G产生非酸性或中性末端产物的能力，如

丙酮酸。丙酮酸经缩合→乙酰甲基甲醇（经碱性、氧化）→二乙酰。二乙酰与蛋白胨中精AA中胍基作用，生成红色化合物，产气肠杆菌---阳性，大肠杆菌---阴性。

7、什么叫生长曲线？单细胞微生物的典型生长曲线分几期？划分依据？

答：生长曲线：将少量纯种单细胞微生物接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横坐标，以菌数的对数为纵坐标作图，得到一条反应在整个培养期间菌数变化规律的曲线。

分为延滞期，对数期，稳定期，衰亡期。

根据生长速率常数划分，即单位时间内分裂次数的不同。

8、为什么诱变时，要制成充分分散的单细胞或单孢子悬液？对放线菌进行诱变育种时，宜处理其孢子还是菌丝细胞？为什么？

答：使每个细胞均匀接触诱变剂，减少表型延迟现象，并避免长出不纯菌落。多使用单核无性孢子，由于孢子生理上处于休眠状态，单核区基中了大部分的DNA，减少分离表型延迟，提高突变效果。

培养基原则：①目的明确②适宜的营养物质③浓度及配比合适④控制PH条件⑤控制氧化还原电位⑥原料来源经济节约⑦灭菌处理

1、青霉素的作用机制？

答：原理：β-内酰胺环的结构与肽聚糖单体五肽尾末端的D-Ala-D-Ala二肽结构相近，因而可竞争性的抑制转肽酶的活性，抑

制单体间交联，形成缺损的CW。青霉素对生长旺盛的G+有明显的抑制作用，对休眠期的无抑制，对G+的作用比G-强得多。

2、筛选抗代谢结构类似物突变株的意义是什么？

答：在含有较高浓度终代谢结构类似物的培养基中，野生型细胞不能生长，而遗传性的解除了反馈抑制或反馈阻遇的抗代谢结构类似物突变株则能生长，突变株在终产物累积的情况下仍然可以不断合成这一产物，所以采取一定的方法，筛选到抗代谢结构类似物突变株，即可获得终产物的高产菌株。

3、酿酒酵母生活史。（同P15)

4、烈性噬菌体？生活史包括几个过程？

答：感染宿主细胞后能在细胞内正常复制并引起宿主细胞迅速裂解的噬菌体。

吸附→侵入→增殖（NA复制，Pr的生物合成）→装配（成熟）→裂解（释放）

5、缩短延滞期的措施

答：①利用遗传学方法改变种的遗传特性，使延滞期缩短，②利用对数生长期的细胞做种子，③尽量使接种前后使用的培养基组成不要相差太大④适当扩大接种量

6、计算代时(G），繁殖代数（n），生长速率常数（R）

答：见第七张

7、诱变育种？举例①非电离辐射诱变剂②电离辐射诱变剂③烷化剂

④插入诱变剂⑤间接引起碱基置换的诱变剂

答：诱变育种：指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变率显著提高，然后从中选取少数符合育种目的的突变株的方法。

①紫外线②x射线，γ射线③EMS，NTG④吖啶类颜料，ICR类⑤碱基类似物(5-BU等)

（直接引起：①亚硝酸G:C<--->A:T,②羟胺:只引起G:C<--->A:T③烷化剂G:C<--->A:T）

8、什么是鉴别培养基？利用EMB培养正常大肠杆菌和沙门氏菌时，菌落现象？为什么？

答;鉴别培养基：用于鉴别不同类型微生物的培养基，在培养集中加入能与目的菌的无色代谢产物发生颜色反应的指示剂，从而用肉眼就能将该种微生物的菌落与外形相似的其他微生物菌落相区分的培养基。

伊红和美蓝在低酸度时结合形成沉淀，起产酸指示剂作用，大肠杆菌强烈分解乳糖而产生大量混合酸，菌落被染成深紫色，还可看到绿色金属闪光。沙门氏菌不能利用乳糖，菌落无色通明。

1、微生物的产能方式有？与食品发酵工业密切相关的微生物的代谢方式有哪几种？

答：微生物产能方式分为：发酵，有氧呼吸，无氧呼吸。

与食品发酵工业密切相关的发酵，实质是底物水平磷酸化，，底物氧化不彻底，产能水平低，为厌氧条件，兼性厌氧菌在有氧的条件下，

从发酵→呼吸作用，对发酵作用抑制（巴氏效应）

2、高压蒸汽灭菌法的操作步骤和注意事项？

答：步骤：①取出内层锅，外层锅加水至与三角搁架相平②放回内层锅，放入带灭菌物品，加盖并将盖上排气软管插入内层锅③打开加热开关，并同时打开排气阀3-5Min④关上排气阀，温度升至121℃计时，控制热源119-123℃15-20min⑤关上开关，断电后压力降0开盖取物⑥无菌检查

注意；①切勿忘记加水，水量不可过少②三角瓶，试管口不要与桶壁接触③切勿忘记打开排气阀排锅内空气④压力降为0才能打开排气阀，开盖

3、培养基应包括哪几种营养物质？如何控制PH？

答；碳源，氮源，能源，生长因子，无机盐，水

治标过酸----NaOH、NH3·H2O,过碱----H2SO4、HCl

治本酸---加氮源，增大通风量，碱----加碱？（第8张）源，减小通风量

加缓冲剂：加碳酸钙

4、如何延长对数生长期？

答;补充营养物质，调整PH，取走代谢产物，改善物化条件，调整营养配比，C/N比4/1时，菌体大量繁殖。

5、

6、简述烈性噬菌体一步生长曲线制作过程，并绘制曲线图。

答:适量噬菌体接种于培养好的高浓度敏感细胞中，②经数min吸附后，将培养物高倍稀释，或加入抗V抗血清，中和给定时间内未吸附的噬菌体，从而使因吸附噬菌体建立同步感染③适温下继续培养，定时取样，测样品中V的效价。感染T横坐标，V效价纵坐标，绘制定量描述烈性噬菌体生长规律的试验曲线。（曲线见第9张）

7、

8、利用物理化学诱变剂对微生物进行诱变的目的有哪些？中间培养的目的？用简图表示利用EMS对微生物进行诱变育种的过程？

答：诱变育种目的：①获得高产菌株②抗性突变种③营养缺陷型突变株（检致癌物，高产次代产物）

中间培养为了克服表型延迟现象。

EMS（甲基磺酸乙酯）----烷化剂----直接引起碱基置换

（烷化后的碱基引起碱基配对错误，也能使嘌呤整体直接从DNA链上脱下来，产生一个缺口，在与缺口相对应的位点上，就能配上任何碱基，从而引起转换或颠换）

选择出发菌株→前培养，制作菌悬液→EMS合适剂量诱变处理→中间培养→初筛培养基涂布→划线分离→菌种鉴定

9、简图表示两亲株细胞（A+B-、A-B+）进行原生质体融合的操作示意图，并对主要步骤作简要说明。

答：见第9张

常用培养基：细菌---牛肉膏蛋白胨培养基（PH7-7.5）

放线菌---高氏1号培养基（PH7-7.5）

酵母菌---麦芽汁培养基（PH4.5-5,5）

霉菌---查氏合成培养基（PH4.5-5,5）

1、放线菌的培养：28℃，3-5d，PH=7~7.5 染色：碳酸复红染1min 观察：（链霉菌）菌落干燥紧密，正反颜色不一致，边缘有辐射状皱褶，小不蔓延，不易挑起。

2、酵母菌培养：25~28℃，24h，PH=4.5~5.5，染色：美蓝--活体染色观察：（酿酒酵母）菌落较B的大且厚，多为乳白色，表面湿润，粘稠，边缘整齐，易被挑起。

3、霉菌培养：28℃，5~7天，PH=4.5~5.5，染色：乳酸碳酸棉签染液。观察：见第10张

4、酵母菌①大小测定：测微尺，酵母培养物制成水漫片，高倍镜测出宽长与目镜测微尺的格数，再乘以目镜微尺每格代表长度。

②计数：血球计数板：死菌+活菌总数，1ml总菌数=5中方格总数/5*中方格数*10^4*稀释倍数

平板菌落计数法：只活菌

5、革兰氏染色:机理+步骤(04真题①）

6、MR，V.P.试验（02真题⑥）

吲哚试验---检验水解色AA，水解色AA（经水解）→丙酮酸+吲哚大肠杆菌---阳性，产气肠杆菌---阴性

柠檬酸盐试验----检测柠檬酸盐是否被利用

大肠杆菌---阴性（绿色)，产气肠杆菌---阳性（蓝色）

硫化氢试验---是否分解含硫有机物

大肠杆菌----阴性，产气肠杆菌----阳性（黑色沉淀）

1、大肠杆菌Escherichia coli 食品卫生重要指示菌，合成V B，大肠菌素

2、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 淀粉酶，蛋白酶

3、苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis δ-肉毒素，生物农药

4、酿酒酵母（真）Sacharomyces cerevisiae 酒类酿造

5、灰色链霉菌（放）Streptomyces griseus 链霉素

6、产黄青霉Penicillum chrysogenum 青霉素

7、米曲霉Aspergillus oryzae 酱，酱油

8、黑曲霉A.niger 淀粉酶，柠檬酸

9、黄曲霉A.flavus 蛋白酶

10、米根霉Rhizopus oryzae 制曲酿酒，乳酸

11、总状毛霉Mucor racemosus 腐乳，豆豉（强蛋白质分解能力）属名：首字母大写，斜体种名：小写

革兰氏染色的实验原理

革兰氏染色的实验原理 ●G＋细胞壁的网状结构致密，交联度高，用乙醇处理后，发生脱水作用，肽聚糖层孔径缩小，透性降低，故细菌仍保留初染时的紫色。 ●G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多类脂质，故用乙醇处理后，类脂质被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，细胞被脱色，经沙黄复染呈红色。 涂片固定→结晶紫初染（碱性）→碘液媒染→乙醇（丙酮）脱色→番红复染（碱性）

◆◆◆原理： 当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂的兰紫色，碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要有舦聚糖形成的网状结构组成，壁厚，类脂含量低，用酒精脱色时细胞壁脱水，使舦聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的兰紫色。革兰氏阴性细菌则不同，由于其细胞壁舦聚糖层较薄，类脂含量较高，，所以当脱色处理时，类脂质被酒精溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 ◆◆实验步骤： 1、制片 涂片——干燥——固定 2、初染 滴加结晶紫染色1——2分钟，水洗； 3、媒染 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖1分钟； 4、脱色 滴加95%酒精脱色，25-30秒，立即水洗； 5、复染 用番红液复染约2分钟，水洗； 6、镜检 干燥后，用油镜观察。 细菌：细菌是一种具有细胞壁的单细胞微生物，在适宜条件下，能进行无性二分裂繁殖，其形态和结构相对稳定。一般体积微小，通常需要借助光学显微镜才能看到，其测量单位用微米表示。

革兰氏染色的机理和步骤.

1. 革兰氏染色的机理和步骤 机理：G+、G-主要由其CW化学成分的差异而引起对乙醇的通透性，抗脱色能力的差异。主要有肽聚糖的厚度和结构所决定。 G+的CW:肽聚糖层厚，脂质含量低。乙醇脱色时CW脱水，孔径减少，透性降低，不易脱色，呈初染得蓝紫色。 G-的CW：肽聚糖层薄，脂质含量高。乙醇脱色时，类脂被乙醇溶解，透性升高，细胞被复染显红色。 步骤：①涂片：在干净的载玻片上滴一滴水，用接种环挑取菌体均匀涂布于水中。 ②固定：将玻片靠近酒精灯火焰，蒸干水分，但不要烤焦。 ③初染：用碱性颜料结晶紫对菌液涂片进行初染。 ④媒染: 以碘液媒染1min，水洗，吸干水分。(细胞内形成结晶紫与碘的复合物，增强相互作用） ⑤脱色(关键步骤）：以95%的乙醇脱色30s，应适当振荡均匀，是乙醇脱色完全。 ⑥水洗，吸干。 ⑦复染：??(第2张）复染30s，水洗吸干。 ⑧干燥镜检。 2、用渗透皮层膨胀学说解说芽孢耐热机制。 芽孢的耐热性在于芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差，以及皮层的离子强度很高，这就使皮层产生了极高的渗透压去夺取芽孢核心中水分，其结果造成皮层的充分膨胀和核心的高度失水，正是这种

失水的核心才赋予芽孢极强的耐热性。 3、引起微生物培养过程中PH变化的几种可能反应，并说明如何能够维持微培PH稳定。 答：培养过程中，由于营养物质被分解利用，代谢产物的形成与积累，会导致PH变化。 （第2张中的图） 还与培养基的C/N比有关，C/N高，经培养基后PH显著下降，C/N 低，经培养基后PH明显上升。 PH调节：①加入缓冲剂--------常用:一氢二氢磷酸盐，K2HPO4 呈碱性，KH2PO4 酸性，只在一定的PH范围内调节（6.4--7.2） ②大量产酸的菌株，加CaCO3调节，CaCO3难溶于水，不会使培养液的PH过度增加，但可不断中和微生物产的酸。 ③培养液中存在天然的缓冲系统，如AA，肽，Pr均属两性电解质，也起缓冲的作用。 ④过酸：治标------加NaOH、Na2CO3中和，治本-----加适量氮源：NaNO3、Pr、NH3·H2O；增加通风量。 ⑤过碱：治标-----H2SO4、HCl中和，治本----加适量碳源:G类，脂类;减小通风量。 3、抗生素法和菌丝过滤法为何能浓缩营养缺陷型突变株？ 抗生素法（青霉素法）：适用于细菌。原理：青霉素抑制肽聚糖链间的交联，组织了合成完整的CW，野生型B处于正常生长繁殖，所以对青霉素敏感，可被抑制或杀死；营缺B在基本培养基上休眠状态

革兰氏染色法的步骤

革兰氏染色法的步骤 详细阐叙革兰氏染色法的步骤 浏览次数:174次悬赏分:0 |解决时间:2011-5-25 17:44 |提问者:肖箫 2011shaw 最佳答案 革兰氏染色 一、目的:在细胞发放之前,利用标准的革兰氏染色法对即将发放的细胞悬液进行检测,判断细胞悬液中是否含有革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。 二、原理: 通过结晶紫初染和碘液媒染后,在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物,革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密,故遇乙醇脱色处理时,因失水反而使网孔缩小,再加上它不含类脂,故乙醇处理不会出现缝隙,因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内,使其仍呈紫色;而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差,在遇脱色剂后,以类脂为主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出,因此通过乙醇脱色后仍呈无色,再经沙黄等红色染料复染,就使革兰氏阴性菌呈红色。 三、实验用品准备: 灭菌玻片、10-100ul移液器、10-100ul灭菌移液吸头、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、接种环、酒精灯、打火机、革兰氏染色液、吸水纸、显微镜、香柏油、擦镜纸、计时器 四、操作: 1 涂片:取灭过菌的载玻片于实验台上,用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央,用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层,涂布面不宜过大。 2 干燥:将标本面向上,手持载玻片一端的两侧,小心地在酒精灯上高处微微加热,使水分蒸发,但切勿紧靠火焰或加热时间过长,以防标本烤枯而变形。 3 固定:固定常常利用高温,手持载玻片的一端,标本向上,在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次,共约2-3秒种,并不时以载玻片背面加热触及皮肤,不觉过烫为宜(不超过60℃),放置待冷后,进行染色。 4 初染:在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴,使染色液覆盖涂片,染色约 1min。 5 水洗:斜置载玻片,在自来水龙头下用小股水流冲洗,直至洗下的水呈无色为止。 6 媒染:用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上,使染色液覆盖涂片,染色约1min。

(推荐)革兰氏染色法的过程及原理

革兰氏染色法的过程及原理 一，过程 1 ．涂片 将培养的不同菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰l 一2 次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 2 ．染色 ( 1 ）初染加草酸铰结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 ( 2 ）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。 ( 3 ）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95 ％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20 一30 秒钟，立即用水冲净酒精。 ( 4 ）复染用番红液染1 一2 分钟，水洗。 ( 5 ）镜检干燥后，置油镜观察．革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。( 6 ) 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。 二，原理 革兰氏染色法（Gram stain ）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G＋表示：染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G 一表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肤聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫一碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肤聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫一碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌：而脱色，不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 青霉素作用机制 干扰细菌细胞壁的合成。青霉素你的结果与细胞壁的成分粘肽结构中德D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可与后者竞争转肽酶，阻碍你粘肽的形成，造成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。 溶菌酶与青霉素对细菌细胞壁的作用 溶菌酶作用机制：是一种能水解致病菌种黏

微生实验报告 2012.10.10 实验一 细菌的简单染色和革兰氏染色

微生实验报告 姓名： xx 专业年级：2011级生物技术 学号：1032 实验二细菌的简单染色和革兰氏染色 一、实验目的 学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法的实验原理和实验操作。 二、实验原理 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电何，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红、或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法之所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多的易被乙醇溶解的类脂质，增加了细胞壁的通透性，使处染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔

径缩小，通透性降低，草酸铵结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细菌仍保留处染时的紫色。 三、实验器材 1、菌种： 金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。 2、染色剂和试剂： 草酸铵结晶紫染液，卢哥氏碘液，95%酒精，番红复染液，复红染液，吕氏美蓝染液，显微镜擦拭液（乙醚： 乙醇=7:3），xx柏油。 3、器材： 废液缸，洗瓶，载玻片，接种环，酒精灯，擦镜纸，双层瓶，显微镜。 四、实验方法 （一）简单染色 1．涂片： 取干净载玻片一片，在载玻片的左右各加一滴生理盐水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块将刚制成的金黄色葡萄球菌浓菌悬液挑1~2环涂在左边制成薄的涂片，将大肠杆菌的浓菌悬液取1~2环涂在右边制成薄涂片。亦可直接在载玻片上制薄的涂片，注意取菌不要太多。 2．晾干： 让涂片自然晾干。 3．固定：

微生物的革兰氏染色实验报告

微生物的革兰氏染色 一、实验目的： 1、学习并初步掌握革兰氏染色法； 2、了解革兰氏染色的原理； 3、巩固显微镜的使用。 二、实验原理： 革兰氏染色是细菌学中最重要的鉴别染色法。染色步骤分为四个部分： 1、初染：加入碱性染料结晶紫固定细菌图片； 2、媒染：加入碘液，碘与结晶紫形成一种不溶于水的复合物； 3、脱色：利用有机溶剂乙醇或丙酮进行脱色； 4、复染：复红配成碳酸复红作为复染剂。 成分占细胞壁干重的% 革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌肽聚糖含量很高（50~90）含量很低（~10） 磷壁酸含量较高（<50）无 类脂质一般无（<2）含量较高（~20） 蛋白质无含量较高G-和G+细胞壁的比较： 1、阳性（G+）菌细胞壁特点：细胞壁厚，只有一层，主要由肽聚糖构成，肽聚糖含量高，结构紧密，脂类含量低。当乙醇脱色时，细胞壁肽聚糖层孔径变小，通透性降低，结晶紫和碘的复合物被保留在细胞壁内，复染后仍显紫色（如芽孢杆菌）。 2、阴性（G-）菌细胞壁特点：细胞壁薄，由两层构成，内壁层和外壁层，细胞壁中脂类中脂类物质含量较高，肽聚糖含量较低，网状结构交联程度低，乙醇脱色时溶解了脂类物质，通透性增强，结晶紫与碘的复合物易被乙醇抽提出来，因此，革兰氏阴性菌细胞被脱色，当复染时，脱掉紫色的细胞的细胞壁又着上红色（例如大肠杆菌）。 三、实验步骤： 1、取一个载玻片，将其洗净并沿一个方向擦拭干净，直至液体不再其上收缩为止；将接种环整平，用灼烧过的接种环在混匀的菌种中取菌，按常规方法图片，应涂大，不宜过厚。 2、将涂片用火焰固定，不宜烤得太狠，否则菌种呈假阳性。 3、滴加1滴结晶紫染液，染色1min，水洗。 4、滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗 5、滴加脱色乙醇，脱色30~40s，不宜脱色太狠，否则菌种呈假阴性。 6、水洗，滴加番红复染液，复染1min，水洗，晾干 7、镜检并拍照。 四、注意事项： 1、选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。 2、涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。 3、脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。实验结果与讨论： 1、结果： 高倍镜下观察的菌体图像：

革兰氏染色的机理和步骤

1.革兰氏染色的机理和步骤 机理：G+、G-主要由其CW化学成分的差异而引起对乙醇的通透性，抗脱色能力的差异。主要有肽聚糖的厚度和结构所决定。 G+的CW:肽聚糖层厚，脂质含量低。乙醇脱色时CW脱水，孔径减少，透性降低，不易脱色，呈初染得蓝紫色。 G-的CW：肽聚糖层薄，脂质含量高。乙醇脱色时，类脂被乙醇溶解，透性升高，细胞被复染显红色。 步骤：①涂片：在干净的载玻片上滴一滴水，用接种环挑取菌体均匀涂布于水中。 ②固定：将玻片靠近酒精灯火焰，蒸干水分，但不要烤焦。 ③初染：用碱性颜料结晶紫对菌液涂片进行初染。 ④媒染: 以碘液媒染1min，水洗，吸干水分。(细胞内形成结晶紫与碘的复合物，增强相互作用） ⑤脱色(关键步骤）：以95%的乙醇脱色30s，应适当振荡均匀，是乙醇脱色完全。 ⑥水洗，吸干。 ⑦复染：??(第2张）复染30s，水洗吸干。 ⑧干燥镜检。 2、用渗透皮层膨胀学说解说芽孢耐热机制。 芽孢的耐热性在于芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差，以及皮层的离子强度很高，这就使皮层产生了极高的渗透压去夺取芽孢核心中水分，其结果造成皮层的充分膨胀和核心的高度失水，正是这种

失水的核心才赋予芽孢极强的耐热性。 3、引起微生物培养过程中PH变化的几种可能反应，并说明如何能够维持微培PH稳定。 答：培养过程中，由于营养物质被分解利用，代谢产物的形成与积累，会导致PH变化。 （第2张中的图） 还与培养基的C/N比有关，C/N高，经培养基后PH显著下降，C/N 低，经培养基后PH明显上升。 PH调节：①加入缓冲剂--------常用:一氢二氢磷酸盐，K2HPO4 呈碱性，KH2PO4 酸性，只在一定的PH范围内调节（6.4--7.2） ②大量产酸的菌株，加CaCO3调节，CaCO3难溶于水，不会使培养液的PH过度增加，但可不断中和微生物产的酸。 ③培养液中存在天然的缓冲系统，如AA，肽，Pr均属两性电解质，也起缓冲的作用。 ④过酸：治标------加NaOH、Na2CO3中和，治本-----加适量氮源：NaNO3、Pr、NH3·H2O；增加通风量。 ⑤过碱：治标-----H2SO4、HCl中和，治本----加适量碳源:G类，脂类;减小通风量。 3、抗生素法和菌丝过滤法为何能浓缩营养缺陷型突变株？ 抗生素法（青霉素法）：适用于细菌。原理：青霉素抑制肽聚糖链间的交联，组织了合成完整的CW，野生型B处于正常生长繁殖，所以对青霉素敏感，可被抑制或杀死；营缺B在基本培养基上休眠状态

革兰氏染色实验

革兰氏染色实验 革兰氏染色（Gram Staining）是用来鉴别细菌的一种方法：这种染色法利用细菌细胞壁上的生物化学性质不同，可将细菌分成两类，即革兰氏阳性（Gram Positive）与革兰氏阴性（Gram Negative）。(这种染色法是由一位丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰于1884年所发明)。 未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。 阳性紫色，阴性红色 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌： 革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）、链球菌属（肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等）、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽孢杆菌等，其中，金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要的病原菌。

革兰氏阴性菌：埃希氏菌属、枸橼酸菌属、假单胞菌属（绿脓杆 菌等）、莫拉菌属（卡他莫拉菌等）、奈瑟菌属（淋球菌、脑膜炎 双球菌等）、不动杆菌属（鲍曼不动杆菌、罗菲不动杆菌等）、克 雷伯菌属（主要是肺炎克雷伯杆菌）、沙门氏菌属、志贺氏菌属（痢 疾杆菌等）、黄杆菌属、变形杆菌属、军团菌属、耶尔森菌属、嗜 血杆菌属（杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等）、产气杆菌属、霍 乱弧菌、阴沟肠杆菌等。革兰氏阴性菌在院内感染中的细菌感染中 占了大约65%，且大多菌株容易对抗菌药物耐药，产生“新德里金 属酶”（NDM-1）的绝大多数细菌都是革兰氏阴性菌（主要是大肠 杆菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯杆菌）。 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌是利用革兰氏染色法来鉴别的两大类细菌。大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。 细胞形态和结构 细胞的基本结构包括细胞壁和原生质体两部分。原生质体位于细胞壁内，包括细胞膜（细胞质膜）、细胞质、核质和内含物。另外细胞还含有有些特殊结构，主要有荚膜、芽孢、鞭毛和菌毛等4种。 1.细胞壁

2021年革兰氏染色实验步骤

革兰氏染色 欧阳光明（2021.03.07） 一．实验流程： 1、取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。 2、涂片： 液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。 固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。 3、晾干：让涂片在空气中自然干燥。 4、固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。 5、染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。 6、水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。 7、媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。 8、脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液

无紫色，立即水洗。 9、复染：滴加蕃红复染3-5min，水洗。至此，革兰氏染色结束。 二．染色结果：革兰氏阳性菌都呈紫色，革兰氏阴性菌都呈红色。 备注： 1.革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）、链球菌属（肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等）、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽孢杆菌等，其中，金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要等病原菌。 2.革兰氏阴性菌：埃希氏菌属、枸橼酸菌属、假单胞菌属（绿脓杆菌等）、莫拉菌属（卡他莫拉菌等）、奈瑟菌属（淋球菌、脑膜炎双球菌等）、不动杆菌属（鲍曼不动杆菌、罗菲不动杆菌等）、克雷伯菌属（主要是肺炎克雷伯杆菌）、沙门氏菌属、志贺氏菌属（痢疾杆菌等）、黄杆菌属、变形杆菌属、军团菌属、耶尔森菌属、嗜血杆菌属（杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等）、产气杆菌属、霍乱弧菌、阴沟肠杆菌等。

实验二 革兰氏染色法

实验二革兰氏染色法 【实验目的】 1.学习并初步掌握革兰氏染色法。 2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 3.巩固显微镜油镜的使用方法。 【实验仪器、材料】 1.菌种：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌菌液。 2.染色剂：革兰氏染色试剂盒（结晶紫染色液、碘液、脱色液（95%乙醇）、复红染液）。 3.仪器及其他物品： 显微镜、香柏油、无水乙醇、载玻片、擦镜纸、滤纸、酒精灯、试管架、废液缸、记号笔、接种环、镊子、打火机等。 【实验内容】 革兰氏染色法 一、染色标本制备 1.涂片取一张洁净的载玻片，滴加少许生理盐水，用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，与生理盐水研磨均匀，做一薄而均匀、直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。（事先在载玻片的反面滴加菌液的相应位置做好标记） 2.干燥于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥。(温度不宜过高) 3.固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常

用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。 二、染色 l.初染滴加结晶紫覆盖菌膜，染lmin，自来水缓缓冲洗，甩去积水。 2.媒染滴加卢氏碘液，染lmin，水洗，甩去积水。 3.脱色滴加95%乙醇数滴，20s~30s，见紫色脱下立即用水冲洗，甩去积水。 4.复染滴加石炭酸复红液，染lmin，水洗，甩去积水，标本片用滤纸吸干。 三、镜检 待染色片充分干燥后，用油镜观察。 【实验结果】 葡萄球菌呈葡萄状排列，呈紫色，为革兰氏阳性菌； 大肠杆菌为散在的短小杆菌，呈红色，为革兰氏阴性菌。 注：绘图展示染色结果 【结果分析、讨论（结论与评价）】 注：分析你的染色结果是否正确？如果不正确，请分析原因。

革兰氏染色法的过程及原理

革兰氏染色法的过程及原理一，过程 1 ．涂片将培养的不同菌分别作涂片(注意涂片切不可过于浓厚)，干燥、固定。固定时通过火焰l 一 2 次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 2 ．染色 ( 1 )初染加草酸铰结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 ( 2 )媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。 ( 3 )脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95 ％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20 一30 秒钟，立即用水冲净酒精。 ( 4 )复染用番红液染1 一2 分钟，水洗。 ( 5 )镜检干燥后，置油镜观察．革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 ( 6 ) 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。二，原理 革兰氏染色法( Gram stain )不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示：染色反应呈红色(复染颜色) 的称为革兰氏阴性细菌，用G 一表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肤聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫一碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肤聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫一碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液 (番红)的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌：而脱色，不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 青霉素作用机制 干扰细菌细胞壁的合成。青霉素你的结果与细胞壁的成分粘肽结构中德D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可与后者竞争转肽酶，阻碍你粘肽的形成，造成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。 溶菌酶与青霉素对细菌细胞壁的作用 溶菌酶作用机制：是一种能水解致病菌种黏 多糖的碱性酶，只要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的B-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物流出而使细菌溶解，溶菌酶还可以和带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA RNA脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活，因此该酶具有抗菌消炎，抗病毒等作用 判断细菌有无鞭毛的方法 电镜观察，鞭毛染色，半固体穿刺培养，菌落形态观察 描述细菌与古细菌在细胞膜上的主要化学区别 在革兰氏阴性菌的表层，有由肽葡聚糖形成的细胞壁，在壁的外面，又有由蛋白质、磷脂质、脂多糖形成的膜层，与里面的细胞质膜相对应，特称此层为细菌外膜。夕卜膜比细胞质膜的磷脂质含量低，但脂多糖的含量则比较高。夕卜膜的蛋白质与细胞质膜不同，主要部分为数种蛋白质所构成。其主要蛋白质的部分与特异的内面的肽葡聚糖以共价键结合。脂多糖存在于外膜的最外层。在

实验四 细菌的革兰氏染色与芽孢染色

实验四细菌的革兰氏染色与芽孢染色 一、目的要求 1.学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。 2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 二、实验材料 1.菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）大肠杆菌（E.coli） 2.试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液 3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。 三、实验原理 革染氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的。通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。 革染氏染色的基本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%乙醇脱色、最后用蕃红复染。经过此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革染氏阳性菌；如果细胞染上复染的红色的细菌为革染氏阴性菌。大肠杆菌是标准的革染氏阴性菌，金黄色葡萄球菌是标准的革染氏阳性菌。 革染氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。经结晶紫初染以后，所用的细菌都被染成蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革染氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内；革染氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。用蕃红复染时染上红色。 四、操作步骤 1.细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养约24h。 2.制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。 3.初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色1min后，用水洗去剩余染料。 4.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。 5.脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直接用95%乙醇从载 玻片上端冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫色时，立即水洗。酒精的浓度、用量及涂片厚度都会影响脱色速度。脱色是革兰氏染色中最关键的一步。 6.复染：滴加番红液，染色2min，水洗。 7.用滤纸吸干，油镜镜检。 五、注意事项 为了保证革染氏染色结果的正确性，制片过程中要注意：要选用活跃生长的幼培养物作革染氏染色，涂片不宜过厚，火焰固定不已过热，脱色时间的控制。另外，可选用标准的革染氏阳性菌和革染氏阴性菌和未知菌一起混合涂片和染色。 六、实验内容 1.分别对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行革兰氏染色 2.对上述两种菌进行混合涂片，再进行革兰氏染色。 七、实验报告

实验三-普通光学显微镜的使用方法及细菌的革兰氏染色法

实验三-普通光学显微镜的使用方法及细菌的革兰氏染色法

实验三普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色、革兰氏染色法 生科15.2 周罡201500181104 【实验目的】 1.复习光学显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。 2.学习并掌握油镜的原理和使用方法。 3.掌握利用显微镜观察不同微生物的基本技能，了解球菌、杆菌、放线菌、酵母、真菌在光学显微镜下的基本形态特征。 4.学习并掌握微生物的制片及简单染色的基本要求。 5.学习并掌握革兰氏染色法。 6.了解革兰氏染色原理。 7.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。【实验原理】 （一）普通显微镜的基本原理 1.基本原理 现代普通光学显 微镜利用目镜和物镜 两组透镜系统来昂达 成像，故又称为复式显 微镜。它们包括机械部

分和光学部分两部分。机械部分包括镜座、镜臂、镜筒、载物台、物镜转换器、粗调节螺旋、细调节螺旋、标本夹等。光学部分包括接目镜、接物镜、反光镜、光圈（虹采）、聚光镜（集光器）等。 显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的 乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。 2.油镜微生物学使用的显微镜的物镜通 常有低倍镜（10×）、高倍镜（40×）和油镜（100×），油镜是三者中放大倍数最大的，油镜的焦距和工作距离最短，油镜与其他物镜不同的是载玻片与

实验七革兰氏染色法doc资料

实验七革兰氏染色法

实验四革兰氏染色法 一、目的要求 了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。 二、基本原理 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。 三、器材 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌； 革兰氏染色液，载玻片，显微镜等。 四、操作步骤

革兰氏染色液使用说明

革兰氏染色液使用说明 货号：G1060 规格：10ml/100ml 保存：阴凉处保存，保质期1年。 产品内容: 结晶紫；碘液；95%酒精；蕃红。 产品简介： 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌细胞壁较厚，肽聚糖网层次较多且交联致密，乙醇脱色时，肽聚糖脱水使孔径缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上，呈紫色。革兰氏阴性菌细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，脱色后类脂外膜迅速溶解，缝隙加大，结晶紫与碘复合物溶出，因此乙醇脱色后再经番红复染，呈红色。 操作步骤： 1.涂片固定 菌液涂片时不可过于浓厚，干燥、固定。固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 2.染色 一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：

（1）加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。 （2）加上碘液后染色1分钟，水洗。 （3）加上95%酒精,摇动玻片,根据涂片厚度,脱色约20-60秒，水洗，吸去水分。 （4）加上蕃红后，染色1分钟，水洗。 （5）吸干或在空气中凉干后，油镜镜检。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌 可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄 也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌体自行溶解， 都常呈阴性反应。 3.结果观察：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以均匀分散 开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈现假阳性。 注意事项： 1．标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。若涂片较厚，应延长脱色 时间，直至不再出现紫色为止。 2．玻片通过火焰温度不能太高。 3．碘液变透明，则不能使用。 4．水洗时动作要轻柔,沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗,以免把菌体冲掉。

革兰氏染色法

实验三细菌的革兰氏染色法 一、目的要求 了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。 二、基本原理 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。 三、器材 大肠杆菌，金黄色葡萄球菌； 草酸铵结晶紫，番红水溶液，碘液，95%乙醇，载玻片，显微镜等。 四、操作步骤 1．涂片将培养24小时的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1～2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 2．染色 （1）初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 （2）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。 （3）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20～30秒钟，立即用水冲净酒精。 （4）复染用番红液染1～2分钟，水洗。 （5）镜检干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 （6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合制片，作革兰氏染色对比。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 五、实验报告 1．结果 在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各染成何色？它们是革兰

实验6 细菌的革兰氏染色

实验6 细菌的革兰氏染色 一、实验目的和内容 目的：初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法步骤。 内容：1．制作细菌染色装片。 2．进行革兰氏染色法操作。 二、实验材料和用具 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌菌液，待测菌菌液1～2种。 革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等)、香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。 三、操作步骤 (一)制片 1．涂菌用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约lcm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。 2．干燥于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。 3．固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。 (二)染色 l．初染于制片上滴加结晶紫染液，染lmin后，用水洗去剩余染料。 2．媒染滴加卢戈氏碘液，lmin后水洗。 3．脱色滴加95%乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至lmin)，水洗。 4．复染滴加石炭酸复红液复染lmin，水洗。 5．滤纸吸干，油镜镜检。 (三)结果 革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。 (四)检测未知菌 用以上方法对未知菌进行革兰氏染色，并绘图、记录染色结果。 四、注意事项 1. 涂片务求均匀，切忌过厚。 2．在染色过程中，不可使染液干涸。 3．脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌；脱色不够，则会使阴性菌被染成阳性菌。 4．老龄菌因体内核酸减少，会便阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。 五、实验报告 (一)绘图 1．大肠杆菌革兰氏染色视野图。 2．金黄色葡萄球菌或苏云金杆菌革兰氏染色视野图。 (二)记录革兰氏染色法法步骤，并进行结果分析。 (三)未知菌的检测结果。 六、问题和思考 1．涂片后为什么要进行固定?固定时应注意什么? 2．什么是革兰氏染色法?染色过程应注意什么? 3．试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。

革兰氏染色标准操作程序

革兰氏染色标准操作规程 1 目的 确保革兰氏染色的正确操作，使革兰氏染色的操作得到有效控制，以提供稳定的实验结果。 2 适用范围 适用于本公司微生物实验室革兰氏染色实验。 3 职责 实验室技术人员应遵循此程序，确保按标准操作规程进行革兰氏染色。 4 程序 4.1革兰氏染色原理 通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层较多且交联致密，故遇丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故丙酮处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过丙酮脱色后仍呈无色，再经番红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。 4.2实验物品 灭菌玻片、接种环、移液器、酒精灯、计时器、显微镜、香柏油、革兰氏染色液等。 4.3实验步骤 4.3.1涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液器吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央，用移液器分别吸取10ul金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌位于待检品的两侧（中间要有足够的空间），分别作为阴阳性对照。用无菌接种环将液滴涂布成均匀的薄层，涂布面不宜过大。

4.3.2干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯火焰高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。 4.3.3固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉得烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。 4.3.4初染：在涂片薄膜上滴加革兰氏结晶紫试剂1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 4.3.5水洗：斜置载玻片，用洗瓶小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 4.3.6媒染：取1-2滴革兰氏碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 4.3.7水洗：斜置载玻片，用洗瓶小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 4.3.8脱色：斜置载玻片，滴加革兰氏脱色剂脱色，至流出的脱色剂不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗。 4.3.9复染：在涂片薄膜上滴加革兰氏番红精复染剂1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 4.3.10水洗：斜置载玻片，用洗瓶小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 4.3.11干燥：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下观察。 4.3.12观察：待标本片干后置显微镜下观察，用低倍镜观察，发现目标物后滴一滴香柏油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色。 4.4结果判定 显微镜观察由金黄色葡萄球菌制成的标本显示葡萄球状蓝紫色，大肠埃希菌制成的标本显示杆状红色，则实验过程有效。一方不成立则实验结果无效。 此时，如果样品在显微镜下呈蓝紫色，则判定样品菌株为革兰氏阳性菌；如果样品在显微镜下呈红色，则判定样品菌株为革兰氏阴性菌。 4.5实验结束 4.5.1实验结束后，按显微镜使用、维护和保养规程的要求，关闭和清洁显微镜。 4.5.2实验过程中用到的带菌工具，根据工具的不同选择不同的灭菌方式，确保物品丢弃前均已灭菌。

实验三细菌革兰氏染色法

实验三细菌革兰氏染色法 【目的要求】了解革兰氏染色原理；掌握革兰氏染色的方法。 【基本原理】 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884 年由丹麦医师Gram 创立。未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-） 两种类型，细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。 革兰氏染色的主要步骤包括初染、媒染、脱色和复染。首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色。而在最后用复染步骤（染色剂为番红），染色后变为复染剂颜色（红）。 【实验器材】 1.革兰氏染色液： ①草酸铵结晶紫 甲液：结晶紫（2 g）、乙醇（95%）（20 mL）; 乙液：草酸铵（0.8 g）、蒸馏水（0.8 mL）; 将甲、乙两液混合，静置48h 后使用，该染液稳定，在不透气的棕色瓶中可存储数月。 ②卢戈氏碘液 碘（1 g）；碘化钾（2 g）；蒸馏水（300 mL） 先将KI溶于少量（3-5 mL）蒸馏水中，再放入碘，待碘全溶后，加水至300 mL。 此液稳定，可在不透气的棕色瓶中保存数月。 ③脱色液：95%乙醇 ④复染液：即2.5%蕃红（沙黄）水溶液。 沙黄（2.5 g）; 95%的酒精（10 mL）；蒸馏水（90 mL） 将沙黄溶于乙醇中，再用蒸馏水稀释。 2.显微镜、灭菌玻片、灭菌牙签、酒精灯、擦镜纸、计时器。