HRM原理
HRM
●High resolution melting curve 高分辨率熔解曲线
●HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度、GC 含量以及
碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。
HRM技术优势
●高通量
一次可同时检测多个样本
●高灵敏度
HRM可以检测SNP
●重复性好
PCR产物无需后续处理，实现闭管操作，避免交叉污染
●操作简便
只需设计PCR引物，进行PCR反应，无需特异性探针和荧光标记，不受突变碱基位点与类型限制
HRM技术优势
●成本低
相比传统SNP/突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，降低了使用成本
●适用范围广
可用于各种领域和不同标本
●其它
只检测PCR样品中的荧光强度变化，不消耗任何PCR样品，无污染，PCR产物可以用于下游分析，非常适合于测序前的SNP预扫描筛查
HRM
HRM HRM
HRM
HRM应用
●基因的突变扫描
检测杂合子SNP
区段/碱基缺失
前后重复
杂合子缺失
●HLA基因组配型
器官移植HLA配型
同胞之间HLA基因型确定
HRM应用
●等位基因频率分析
SNP频率分析
●物种、品种鉴定
微生物品种
物种快速鉴定
动植物品种鉴定
●甲基化研究
甲基化位点筛查，甲基化程度分析
●法医学鉴定
法医学SNP、DIP鉴定
基因突变—HRM检测
●基因突变是指由于DNA碱基对的臵换、增添或缺失而引起
的基因结构的变化
●基因突变是普遍存在的，是生物变异的主要原因，是生物
进化的主要因素
●但大多数基因突变对生物体是有害的
如绝大多数人类遗传病（人的色盲、糖尿病、白化病等）都是突变性状，是由基因突变造成
基因突变－传统检测技术
●荧光共振能量传递为基础的检测方法
Taqman探针
分子信标（Molecular Beacon）
FRET(Hybprobe)
●分子杂交
寡核苷酸连接分析（OLA）
动态等位基因特异杂交（DASH）
●PCR技术与其它方法结合
变性—高效液相色谱（DHPLC）
测序
芯片
基因突变－HRM检测原理
●在一定温度范围内将PCR扩增产物进行变性并实时检测荧光
信号，荧光值随温度变化即熔解曲线
●每一段DNA都有其独特序列，因而也有其独特的熔解曲线形
状，如同DNA指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性和重复性
基因突变－HRM检测
KRAS基因（K－ras，p21）检测是目前医生了解大肠癌患者基因状况最直接、最有效的方法，通过检测不仅可以深
入了解癌基因的情况，更重要的是筛选出针对抗表皮生长
因子受体靶向药物治疗有效的大肠癌患者，帮助医生选择
对肿瘤病人最有效的治疗方法
基因突变－HRM检测
Emma Borras et al., BMC Cancer 2011,11 :406
基因突变－HRM检测
●MYH基因相关性息肉病（MAP）归属于家族性腺瘤性息肉
病（FAP），是一种与MYH基因突变有关的常染色体隐
性遗传病。MAP以多发性结直肠腺瘤性息肉和高危险性
的结直肠癌为主要临床特点，因此早期诊断和及早防治，
对于结直肠癌的早期发现及预防具有重要意义。
●确诊为MAP的患者可进行外科手术治疗、结肠镜下切除
息肉或药物治疗
基因突变－HRM检测
Isabel Lopez-Villar et al., BMC Cancer. 2010 ; 10 :408
基因突变-HRM检测
●CHEK2是一个重要的乳腺癌易感基因。同时，CHEK2基
因突变与乳腺癌患者的病理特征及预后有一定关系。
●对CHEK2基因突变的检测可能对乳腺癌的治疗具有一定
的指导作用。
基因突变-HRM检测
Ngugen-Dumont et al. BMC Medical Genomics 2011, 4:39
DNA甲基化-HRM检测
●DNA甲基化是表观遗传学的研究内容之一，它可以在转录
水平抑制基因的表达。具体的过程是在胞嘧啶-鸟嘌呤（CpG二核苷酸）的5位碳原子上添加了一个额外的甲基团，5-甲基胞嘧啶。CpG二核苷酸密度较高的区域在人体基因组中呈非随机分布，优先分布于基因的启动子区，并被称为CpG岛。
●启动子超甲基化可导致有关肿瘤演进的重要基因再次沉
默，例如那些有关DNA修复、细胞周期调控和凋亡的基因。因此，可以认为DNA甲基化与肿瘤的发生密切相关。
DNA甲基化-HRM检测原理
●重亚硫酸盐处理DNA模板可以使胞嘧啶转化为尿嘧啶，而
5-甲基胞嘧啶保持不变，随后通过PCR扩增。
●在饱和的DNA结合染料存在的情况下进行PCR反应，在
扩增后进行高分辨熔解曲线分析，HRM分析的特点为可以区分扩增产物中少至少个碱基变化的序列差异，从而通过尿嘧啶/胞嘧啶的差异判断扩增子来源于甲基化还是非甲基化的初始模板变异体。
DNA甲基化-HRM检测
DNA甲基化-HRM检测
Ida L.M. Candiloro, Thomas Mikeska, and Alexander Dobrovic, Epigenetics 6:4; 500-507; April 2011
SNP
●单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms,
SNPs），指单个核苷酸碱基的改变，包括臵换、颠换、缺失和插入，导致的核酸序列的多态性。
●在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，
绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，就是SNP。
●SNP在人类基因组中数量较多，发生频率较高，被认为
是继微卫星之后的新一代遗传学标记。
SNP
●SNPs作为第三代遗传标记（已知性、可遗传性、可检测
性），用于疾病基因的定位、克隆和鉴定
●SNP可直接影响个体间对疾病的易感性、外源物质的代
谢差异和药物不良反应表现因此对SNP的研究在个体化用药、个体化治疗中具有重要的指导作用
SNP-检测方法
●单链构象多态性（SSCP）分析
●变性梯度凝胶电泳法（DGGE）
●变性高效液相色谱分析（DHPLC）
●Taqman探针
●基因芯片
●DNA测序
SNP-检测
理想的检测SNPs的方法
——发现未知的SNPs，或检测已知的SNPs
⑴灵敏度和准确度的要求
⑵快速、简便、高通量
⑶费用相对来说低廉
SNP-HRM检测
●在一定温度范围内将PCR扩增产物进行变性并实时检测
荧光信号，荧光值随温度变化即熔解曲线
●每一段DNA都有其独特序列，因而也有其独特的熔解曲
线形状，如同DNA指纹图谱一样，具有很高的特异必、稳定性和重复性
●根据曲线可以准确区分野生型纯合子、杂合子和突变型纯
合子
●作为新一代的遗传扫描工具，HRM技术是一种低成本、
高通量、快速，且不受位点局限的检测方法，是SNP 筛查的最佳选择。
SNP-HRM检测
SNP-HRM检测
SNP-HRM检测
Maria Eralil, Karl V. V oelkerding, Carl T. Wittwer, Exp Mol Pathol. 2008 August; 85(1):50-58
基因诊断-HRM检测
●肥厚型心肌病（Hypertrophic cardiomyopathy, HCM）●常染色体显性遗传
●患病率1:500
●年轻群体猝死的常见病因之一
基因诊断-HRM检测
Centro de Metabolismo e Endocrinologia et al. Rev Port Cardiol 2011; 30(01):7-18
物种鉴定-HRM检测
Vezenegho, S.B., C. Bass, et al. （2009）.“Development of multiplex real-time PCR assays for identification of members of the Anopheles funestus species group.”Malar J 8: 282
HRM实验要求
●饱和染料：LC-Green, Eva-Green, Super-Green
●温度：升温和信号采集，温度均一性