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RNA提取方法

RNA提取方法
RNA提取方法

RNA提取(LiCl)

DEPC处理:试剂,如CTAB提取液、LiCl(10mM)、NaAc、双蒸水(处理后,即为冻存管装着的DEPC水)

1‰DEPC水处理:各类枪头、1.5mL和2mL的离心管、冻存管(装DEPC水的和装70%的乙醇)、研钵和研棒

不用处理:β-巯基乙醇、氯仿:异戊醇(24:1)-(通风橱没有的话,自己配)、无水乙醇

1.实验前准备:各类枪头、1.5mL和2mL的离心管、冻存管、研钵和研棒等需用

1‰DEPC水处理8h以上,然后高温高压灭菌,烘干(至少烘大半天)备用;

2.磨样前:将装有研钵和研棒的烧杯、2mL的离心管(写上编号)置于-20℃冰

箱预冷,准备好蓝枪头和黄枪头、1mL和100μL的枪、RNA提取液、β-巯基乙醇,取出预冷的研钵并加入液氮进一步预冷;

3.称取0.3-0.5g样品于研钵(估摸着),在液氮中研磨样品,液氮将完时快速

研磨成粉末状(干了就不要再研磨了,以防造成机械降解,加液氮后继续研磨),注意适时添加适量液氮(次数不宜多,以免解冻耗时太长),加入20-50μL β-巯基乙醇,再加入1mL CTAB提取液,室温解冻,转入到2mL离心管中,最后用CTAB提取液配平;

4.置于浮板中,60-65℃水浴15-30min,每6min颠倒摇匀一次,4℃、12000rmp

离心10min;

5.转移上清液至新的预冷的2mL的离心管(可直接倒),用CTAB提取液补平;

6.通风橱中,加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),剧烈震荡5min;

7.4℃、12000g离心10min;

8.转移上清液至另一新的预冷的2mL离心管中;

9.通风橱中,加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),剧烈震荡5min;

10.4℃、12000g离心10min;

11.转移上清液至新的预冷的1.5mL离心管中;

12.加入2/3体积的LiCl,颠倒混匀即可;

13.-20℃过夜(8h以上,也不要时间过长);

14.4℃、15000g离心30min,去上清;

15.加1mL 70%乙醇(可根据洗2次沉淀的用量来现配,如14mL无水乙醇+6mL

DEPC水,用前-20℃预冷,冻存管是1‰DEPC水处理过的)洗沉淀,充分混匀洗涤(约1min),4℃、12000g离心1min,去上清;

16.重复洗涤一次,去上清;

17.4℃、12000g空管离心1min,用枪将液体吸出;

18.打开离心管的盖子,超净工作台上吹1min无菌风;

19.加20uLDEPC水溶解(可离心溶解,4℃、12000g离心1min),4℃放置几

分钟(此时可做胶),取1uL 点样,琼脂糖凝胶电泳检测;

20.在板上点溴酚蓝,约5uL/点,加RNA样液1uL(用DEPC水处理过的白枪

头),电泳检测。

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