RNA提取(LiCl)
DEPC处理:试剂,如CTAB提取液、LiCl(10mM)、NaAc、双蒸水(处理后,即为冻存管装着的DEPC水)
1‰DEPC水处理:各类枪头、1.5mL和2mL的离心管、冻存管(装DEPC水的和装70%的乙醇)、研钵和研棒
不用处理:β-巯基乙醇、氯仿:异戊醇(24:1)-(通风橱没有的话,自己配)、无水乙醇
1.实验前准备:各类枪头、1.5mL和2mL的离心管、冻存管、研钵和研棒等需用
1‰DEPC水处理8h以上,然后高温高压灭菌,烘干(至少烘大半天)备用;
2.磨样前:将装有研钵和研棒的烧杯、2mL的离心管(写上编号)置于-20℃冰
箱预冷,准备好蓝枪头和黄枪头、1mL和100μL的枪、RNA提取液、β-巯基乙醇,取出预冷的研钵并加入液氮进一步预冷;
3.称取0.3-0.5g样品于研钵(估摸着),在液氮中研磨样品,液氮将完时快速
研磨成粉末状(干了就不要再研磨了,以防造成机械降解,加液氮后继续研磨),注意适时添加适量液氮(次数不宜多,以免解冻耗时太长),加入20-50μL β-巯基乙醇,再加入1mL CTAB提取液,室温解冻,转入到2mL离心管中,最后用CTAB提取液配平;
4.置于浮板中,60-65℃水浴15-30min,每6min颠倒摇匀一次,4℃、12000rmp
离心10min;
5.转移上清液至新的预冷的2mL的离心管(可直接倒),用CTAB提取液补平;
6.通风橱中,加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),剧烈震荡5min;
7.4℃、12000g离心10min;
8.转移上清液至另一新的预冷的2mL离心管中;
9.通风橱中,加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),剧烈震荡5min;
10.4℃、12000g离心10min;
11.转移上清液至新的预冷的1.5mL离心管中;
12.加入2/3体积的LiCl,颠倒混匀即可;
13.-20℃过夜(8h以上,也不要时间过长);
14.4℃、15000g离心30min,去上清;
15.加1mL 70%乙醇(可根据洗2次沉淀的用量来现配,如14mL无水乙醇+6mL
DEPC水,用前-20℃预冷,冻存管是1‰DEPC水处理过的)洗沉淀,充分混匀洗涤(约1min),4℃、12000g离心1min,去上清;
16.重复洗涤一次,去上清;
17.4℃、12000g空管离心1min,用枪将液体吸出;
18.打开离心管的盖子,超净工作台上吹1min无菌风;
19.加20uLDEPC水溶解(可离心溶解,4℃、12000g离心1min),4℃放置几
分钟(此时可做胶),取1uL 点样,琼脂糖凝胶电泳检测;
20.在板上点溴酚蓝,约5uL/点,加RNA样液1uL(用DEPC水处理过的白枪
头),电泳检测。