长期施肥管理对红壤稻田土壤微生物量碳和微生物多样性的影响
中国农业科学 2010,43(16):3340-3347
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2010.16.009
长期施肥管理对红壤稻田土壤微生物量碳
和微生物多样性的影响
卜洪震1，王丽宏2，尤金成3，肖小平4，杨光立4，胡跃高1，曾昭海1
（1中国农业大学农学与生物技术学院/农业部农作制度重点开放实验室，北京 100193；2河北农业大学农学院，河北保定 071001；
3呼伦贝尔市草原研究所，内蒙古海拉尔021008；4湖南省农业科学院土壤与肥料研究所，长沙 410125）
摘要：【目的】土壤微生物在地球化学循环及维持土壤肥力和作物产量方面发挥了重要作用，为了研究长期不同施肥制度对土壤肥力状况的影响，明确施肥制度与土壤微生物的关系。【方法】采用土壤熏蒸和磷脂脂肪酸分
析方法，研究了湖南宁乡不施肥处理、施用化肥、常规施肥、秸秆还田、30%有机肥+化肥和60%有机肥+化肥6个
长期肥料定位试验的土壤微生物量碳及磷脂脂肪酸。【结果】与不施肥对照相比，施用化肥、秸秆还田及有机肥与
化肥配合施用可以显著的提高土壤微生物量碳及总磷脂脂肪酸的量。长期施用化肥后，群落中含有iC15:0的微生
物明显增多，长期施用有机肥和秸秆还田后，群落中含iC15:0微生物明显减少，而含aC15:0微生物则显著增加。
通过对21种测得磷脂脂肪酸进行主成分分析，结果表明，前两个主成分可以解释总变异的87.6%。除C12:0和C15:0
外，大部分的非饱和脂肪酸和环式脂肪酸的变异可以在第一主成分中反映出来。从肥料处理的主成分分析结果看，
第一主成分及第二主成分可以解释肥料处理变异的89.8%，相比较而言，化肥处理和常规施肥处理相互间的差别
较小，60%有机肥处理与秸秆还田处理几乎重合。【结论】不同施肥处理对土壤微生物量碳和微生物多样性有重要
影响，肥料处理差异可以在微生物结构与多样性变化上得以体现。
关键词：红壤；施肥；微生物量碳；磷脂脂肪酸
Impact of Long-Term Fertilization on the Microbial Biomass
Carbon and Soil Microbial Communities in Paddy Red Soil
BU Hong-zhen1, W ANG Li-hong2, YOU Jin-cheng, XIAO Xiao-ping3, Y ANG Guang-li3, HU Y ue-gao1, ZENG Zhao-hai1
(1College of Agronomy and Biotechnology, China Agricultural University/Key Laboratory of Farming System, Ministry of Agriculture,
Beijing 100193; 2Agronomy College, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, Hebei; 3Institute of Grasslands in Hulunbuir
City, Hailaer 021008, Inner Morgolia; 3Soil and Fertilizer Institute, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125)
Abstract:【Objective】Soil microorganisms are involved in various biochemical processes and play a vital role in maintaining
soil fertility and plant yields. The impacts of different long-term fertilization treatments on soil microbial community structure were
studied to clarify the relationship between them. 【Method】Soil samples were collected from long-term fertilization experimental
plots receiving no fertilization, chemical fertilization, chemical fertilization as normally applied by local farmers, harvested residue
return, 60% organic manure plus chemical fertilization and 30% organic manure plus chemical fertilizer. Total microbial biomass
carbon was determined by chloroform- fumigation-extraction. Phospholipid fatty acid (PLFA) profiles for each treatment were used
to characterize the microbial community structure and were analyzed by principle component analysis. 【Result】Compared with the
unfertilized control, all fertilization treatments showed significant increases in total microbial biomass carbon and PLFAs. The
iC15:0 fatty acids significantly increased under long-term application of chemical fertilizer but decreased under both organic manure
and residue return fertilization. In contrast, under organic manure and residue return, the aC15:0 fatty acids increased. Principal
component analyses of the 21 PLFAs detected in the six treatments showed that 87.6 % of the total variance of the individual PFLAs
could be explained by two principal components. All unsaturated and cyclopropyl PLFAs except C12:0 and C15:0 were highly
收稿日期：2010-02-03；接受日期：2010-03-23
基金项目：国家自然科学基金（30671222，30871491）、国家“十一五”科技支撑计划（2007BAD89B01，2006BAD02A15）、2008年公益性行业（农业）科研专项（200803028）
作者简介：卜洪震，博士研究生。Tel：010-********；E-mail：buhz@https://www.wendangku.net/doc/5514453514.html,。通信作者曾昭海，副教授，博士。Tel：010-********；E-mail：zengzhaohai@https://www.wendangku.net/doc/5514453514.html,。并列通信作者胡跃高，教授，博士。Tel：010-********；E-mail：huyuegao@https://www.wendangku.net/doc/5514453514.html,
16期卜洪震等：长期施肥管理对红壤稻田土壤微生物量碳和微生物多样性的影响 3341
weighted on the first principal component. The first and the second principal components could also explain 89.8% of the total
variance of fertilization treatment. There was a very little different between the chemical fertilizer treatment and the treatment
receiving chemical fertilizer as typically applied by local farmers. There was also almost no difference between the treatment that
received residue return and the treatment that received 60% organic manure plus chemical fertilizer. 【Conclusion】 Long-term
fertilization can significantly impact soil microbial biomass carbon and influence microbial community structure. PLFAs reflect soil
microbial community structure and can be used to detect shifts in response to fertilization.
Key words: red soil; fertilization; microbial biomass carbon; phospholipid fatty acid (PLFA)
0 引言
【研究意义】红壤是中国中亚热带湿润地区分布的地带性土壤，红壤地区种植的主要作物是水稻，其稻米产量占全国的80%，养活着全国22.5%的人口[1]。红壤地区长期定位施肥管理对于了解不同肥料管理对稻田土壤肥力与土壤健康状况有重要作用。土壤微生物组成与活性决定着生物地球化学循环、土壤有机质的周转及土壤肥力和质量，也与植物的生产力有关。土壤微生物还可以敏感地指示气候和土壤环境条件的变化，土壤微生物参数可能是最早用于反映土壤质量的指标[2]。【前人研究进展】以往关于红壤稻田长期定位施肥管理试验主要集中在施肥管理对有机碳和养分含量的影响[3]、肥料利用率[4]、供磷能力[5]及稻田甲烷排放[6]。张逸飞等[1]利用BIOLOG TM生态测试板对红壤稻田长期施肥管理条件微生物群落功能多样性开展了研究，结果表明施肥使微生物群落物种丰富度有所减少，施用磷肥可以增加微生物群落功能多样性；颜慧等[7]利用磷脂脂肪酸（PLFA）方法分析了中国科学院红壤生态实验站长期定位试验中氮、磷、钾及有机肥配合施用对红壤稻田土中微生物多样性的影响。【本研究切入点】以往相关领域的研究主要是针对N、P、K等不同肥料配比施用对土壤微生物的影响，很少关注长期秸秆还田、有机肥和N肥配合施用、同时结合双季稻与冬季作物轮作等处理措施对土壤微生物结构与多样性的影响。本研究主要是利用磷脂脂肪酸方法研究湖南宁乡红壤稻田长期施用化肥、化肥与有机肥按照不同比例配合施用以及长期秸秆还田对土壤微生物群落多样性的影响。【拟解决的关键问题】探讨不同施肥管理条件下土壤微生物量碳及土壤微生物多样性变化，为红壤稻田土肥力评价与稻田健康管理提供微生物参数，为红壤稻田耕地质量提高和土壤微环境改善提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验方案及样品采集
肥料试验地位于湖南省宁乡县长期定位土壤监测点（北纬28°07′、东经112°18′），设6个施肥处理包括：处理1为化肥处理：施氮、磷、钾化肥，不施任何有机肥；处理2为60%有机肥处理：有机肥的氮含量占总施氮量的60%，其余40%的氮为化肥氮；处理3习惯施肥处理：按当地群众习惯施肥；处理4秸秆还田处理：施用与处理1等量氮的晚稻秸秆；处理5无肥对照：不施任何肥料；处理6为30%有机肥处理：施用有机肥的氮含量占总施氮量的30%，其余70%的氮为化肥氮（各处理施肥量见表1）。试验始于1986年，施肥量根据田间测土状况进行调整，每年种植模式为双季稻-大麦周年轮作。每个小区长10.00 m，宽6.67 m。2005年12月在双季稻收获后种植大麦期间进行田间土壤取样。由于该长期试验开始于20多年以前，受当时条件的限制没有设置重复。为了减少这方面的缺陷，每个处理实行了多点取样，每种处理按照“S”形在田间小区内取10个点，取样深度为0—20 cm，土壤取样后立即带回实验室。放在4℃冰柜中保存备用。
1.2 土壤微生物量碳测定
微生物量碳采用氯仿熏蒸浸提法测定[8-9]。将土壤
表1 1987—2005年不同处理平均施肥量
Table 1 Average amount of fertilizer under different fertilizations from 1987 to 2005 (kg·hm-2)
肥料种类Types of fertilizer N P2O5K2O
早稻Early rice 190.1 15.2 73.3
化肥
Mineral fertilizer 晚稻Late rice 156.3 15.8 65.2
早稻Early rice 273.8 66.8 120.8 60%有机肥+化肥
60% manure plus fertilizer晚稻Late rice 228.7 54.4 107.9
早稻Early rice 189.6 21.2 58.9
常规施肥
Convention 晚稻Late rice 169.9 13.2 59.4
早稻Early rice 142.8 15.6 53.9
秸秆还田
Residue return to soil 晚稻Late rice 157.8 15.8 56.7
早稻Early rice 0 0 0
无肥对照
No fertilizer 晚稻Late rice 0 0 0
早稻Early rice 228.9 45.0 102.1 30%有机肥+化肥
30% manure plus fertilizer晚稻Late rice 191.2 29.8 93.2
3342 中国农业科学43卷
含水量调至40%田间持水量，置于密闭塑料桶内，在25℃恒温黑暗条件下培养至少7 d。培养的同时在桶内放置2小杯清水和1小杯10 mol?L-1 NaOH溶液。称取培养后的土样约相当于20 g干土的土壤3份，置于干燥器中，同时放置2小杯去乙醇氯仿和1小杯10 mol?L-1 NaOH溶液，抽真空后于25℃黑暗条件下培养24 h，然后抽尽土壤中残留氯仿，用0.5 mol?L-1 K2SO4溶液浸提，土液比为1﹕4（W﹕V）。在280 r/min的转速下振荡30 min，用定量滤纸过滤。熏蒸培养的同时，称取等量的3份土样按照上述方法振荡浸提，得到对照滤液。用外加热法测定滤液中有机质含量，用0.05 mol?L-1 FeSO4标准溶液滴定。计算公式为：SMBC = Ec/kEc = 2.64 Ec，式中Ec = 熏蒸土壤浸提测定的全碳-不熏蒸土壤浸提测定的全碳，kEc为所浸提出来的微生物量碳占土壤微生物量碳的比例，即浸提效率，取值为0.38。
1.3 磷脂脂肪酸测定
1.3.1 脂肪酸的提取 采用修正的Bligh-Dyer方法[10]。将田间取样土壤充分混合后，除去土壤中的植物残体、石块及蚯蚓等，过2 mm筛。调节土壤至40%田间持水量，在25℃培养7 d，称取相当于20 g烘干土壤的湿润土壤3份，用混合浸提液（缓冲液﹕甲醇﹕氯仿体积比为0.8﹕2﹕1）在＜18℃下以200 r/min避光振荡2 h后，加入水和氯仿各37.5 mL，充分混匀后于4℃冰箱中黑暗静置12 h，除去混合液中的甲醇和水后，再用30—40℃水浴旋转蒸发约1 mL。
1.3.2 磷脂脂肪酸的分离将样品注入硅胶柱中，分别用氯仿、丙酮各洗柱2次，去掉中性脂肪酸和糖脂类，然后用甲醇将磷脂脂肪酸洗脱于一个干净小瓶中，洗脱液用N2干燥后放在-20℃下保存。
1.3.3 磷脂脂肪酸碱性甲醇水解和甲酯化 用1 mL 甲醇和甲苯混合液（体积比为1﹕1）溶解干燥的磷脂样品，在其中加入30 μL标准样品（标准样品是将c19:0和c13:0标准样品溶解于正己烷中，配成1 mmol?L-1溶液）。加入0.2 mol?L-1 1 mL KOH-甲醇溶液，在37—40℃水浴锅中加热15 min，冷却至室温后再用1 mL 0.2 mol?L-1醋酸调节pH至中性，加入氯仿和水各2 mL，静置分层后收集底层的氯仿，并利用无水Na2SO4干燥吸取其中部分水分，并用N2干燥。
1.3.4 磷脂脂肪酸的测定将脂肪酸重新溶解于100 μL的正己烷中，利用气相色谱（Hewlett-Packard 6890）测定脂肪酸，载气为氦气，补偿气体为氮气，助燃气体为空气，流量分别为20—30 mL?min-1、30 mL?min-1及300 mL?min-1，初始温度为70℃保持1 min 后，以20℃?min-1增加到150℃，再以5℃?min-1升值250℃后以10℃?min-1升至300℃，每个样品运行总时间是31.5 min。按照下式计算脂肪酸含量：
PLFA（ng?g-1干土）=（PFAME×ng Std）/（PISTD dilution×W）
式中，PFAME 和PISTD分别为样品和标准品的峰面积，ng Std为标准样品的浓度（ng?μL-1），W为土壤样品的烘干重。
1.4 磷脂脂肪酸命名
脂肪酸采用Frostegard等[11]方法命名,分子式以“X:YωZ（c/t）”表示，其中X代表脂肪酸分子的C 原子总数，Y代表不饱和烯键的数目，ω代表烯键距离羧基的位置，Z为烯键或环丙烷链的位置。前缀i （iso）代表异构甲基支链（距甲基端的第三个碳原子），a（anteiso）代表前异构甲基支链（距甲基端的第三个碳原子），cyc代表环丙基，br表示甲基链的位置未知。后缀c和t分别代表顺式和反式同分异构体，OH前的数字表示羟基的位置（从羧基端计数，第二个碳为α、第三个碳为β）。根据Frostegard等[11]和Zelles等[10,12]的研究，脂肪酸为i14:0, i15:lc, i15:0, a15:0, i16:lc, i16:0, 16:lω7c, i17:0, 17:1ω6c, a17:0, 17:0cy, 18:1ω7c, 18:1ω5c和19:0cy 代表细菌的种群，其中i15:0、a15:0、i16:0、i17:0、a17:0以及17:0cy代表革兰氏阳性菌，C14:02OH C14:0 3OH C16:0 2OH C18:1ω9和cyc19:0?代表革兰氏阴性菌；真菌种群的磷脂脂肪酸有16:lω5c、18:2ω6,9c、18:lω9c以及18:2ω9, 12；放线菌的脂肪酸种类有10Mel6:0, 10Me17:0 和10Me18:0。
1.5 分析及数据处理方法
所有测定结果均为3次重复的平均值。用SPSS 进行PLFA的主成分分析，为保证结果可靠性，减少误差，仅分析含量高于0.1%的脂肪酸。
2 结果
2.1 长期不同肥料管理对微生物量碳的影响
土壤微生物量碳是土壤碳的周转与贮备库，是土壤有效碳的重要来源，是评价土壤养分有效性和土壤微生物状况随环境变化的敏感指标。不同施肥处理间的土壤微生物量差异显著（图1），与对照相比（不施肥），施用化肥、秸秆还田以及有机肥与化肥配合施用，均可以显著提高土壤微生物量碳。与单纯施用化肥相比，有机肥与化肥配合施用及秸秆还田均可以
16期卜洪震等：长期施肥管理对红壤稻田土壤微生物量碳和微生物多样性的影响
3343
图1 长期不同施肥管理对土壤微生物量碳的影响
Fig. 1 Effects of long-term fertilizations on microbial biomass C 显著提高土壤微生物量碳，其中60%厩肥与化肥配施提高的比例为51.7%，30%厩肥与化肥配施提高的比例为41.9%，秸秆还田微生物量碳提高的比例为22.4%。
2.2长期不同施肥处理土壤磷脂脂肪酸的组成及含量
与对照（不施肥）相比，施用化肥、化肥与有机肥配施以及秸秆还田均可以显著的提高总磷脂脂肪酸的含量（表2）。在所有测定的21种磷脂脂肪酸中，施用化肥后，微生物群落中含C12:0未能检测到，群落中含aC15:0、C14:0 3OH、C18:1ω9、C18:0、iC15:0和C18:2ω9,12的微生物显著增加，而群落中含C18:1ω9t&c11微生物则显著减少。而秸秆还田后，群落中含iC15:0和 C18:1ω9t&c11微生物显著减少，其它种类均有不同程度的增加，除C14:0 2OH、C16:0 2OH及C20:0差异未能达到显著水平外，其它种类的微生物差异均达到了显著水平。有机肥与化肥配合施
表2 不同施肥处理土壤磷脂脂肪酸的组成及含量
Table 2 Composition and concentrations of PLFAs in different fertilizations
磷脂脂肪酸PLFA
施用化肥
Mineral fertilizer
60%有机肥+化肥
60% manure plus fertilizer
常规施肥
Convention
秸秆还田
Residue return to soil
无肥对照
No fertilizer
30%有机肥+化肥
30% manure plus fertilizer
C12:0 nd nd 0.89b nd 1.45a 1.66a C14:0 3.21bc 3.27bc 3.06bc 3.84b 2.73c 5.02a iC15:0 23.49a 0.94c 24.76a 1.01c 11.41b 1.25c aC15:0 19.54c 30.80b 15.06d 30.70b 15.20d 46.19a C15:0 2.49ab 2.59ab 2.40ab 2.93a 2.14b 1.80c C14:0 2OH 1.56a nd 1.55a 1.86a 1.21a 1.98a C14:0 3OH 2.48a 2.72a 2.40ab 2.84a 1.93b 2.74a iC16:0 7.65bc 8.00bc 7.46bc 9.05b 5.80c 12.65a C16:1d9 2.99cd 4.47b 3.35cd 3.54c 2.53d 5.78a C16:0 8.31cd 13.87b 9.30c 10.64c 6.63d 18.36a iC17:0 6.61cd 8.14bc 7.28bc 8.93b 5.16d 12.09a C17:0d9,10 1.98cd 2.30bc 1.95cd 2.53ab 1.53d 3.06a C17:0 10.95cd 12.69bc 10.95cd 13.62b 8.41d 18.27a C16:0 2OH 3.49b 3.51b 3.65b 3.63b 2.92b 5.30a C18:2ω9,12 18.52c 22.10b 19.95bc 24.71a 1.15e 12.25d C18:1ω9 19.02c 25.78b 20.72c 26.83b 15.22d 30.03a C18:1ω9t&c11 2.38c 3.46c 2.78c 3.33c 16.08b 22.71a C18:0 5.24bc 5.13c 5.78bc 6.99a 2.17d 6.12ab C19:0c9,10 14.94c 22.28a 18.34b 21.88a 13.05c 16.66bc cyc19:0? 1.81c 2.46b 2.14bc 2.44b 1.70c 3.42a C20:0 1.41b 1.67b 1.52b 1.71b 1.60b 2.23a 总量
Total PLFAs (ng·g-1)
158.08c 176.17bc 165.26bc 182.99b 120.00d 229.53a
nd: 未达到检测水平。同一行内数值后标以不同字母表示在0.05 水平上差异显著
nd: Not detected. Values within the same rows followed by different letters are significantly different at the 0.05 probability level
3344 中国农业科学43卷
用后，群落中含 iC15:0微生物显著减少。60%有机肥处理中，群落中含C18:1ω9t&c11微生物减少也达到显著水平。群落中含C12:0 和C14:0 2OH未能达到检测水平，在余下的17种脂肪酸中，除C14:0、C15:0、iC16:0、C16:0 2OH及C20:0五种磷脂脂肪酸增加未能达到显著水平外，其它12种脂肪酸都显著增加。
2.3 不同施肥处理土壤微生物结构及变化
根据Frostegard等的定义[11]，可以分别计算出革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌的磷脂脂肪酸含量及它们相互间的比例（表3）。在不同的施肥处理中，30%有机肥与氮肥配施革兰氏阳性菌与阴性菌磷脂脂肪酸含量均最高，分别为72.17和43.47 ng?g-1。从革兰氏阳性菌与阴性菌的比值看，施用化肥处理的比值最高，为2.03，与其它处理间的差异达到显著水平。真菌的磷脂脂肪酸含量以30%秸秆还田的结果最高，为24.71 ng?g-1，与其它各处理的差异均达到了显著水平。细菌与真菌比值变化可以作为土壤生态系统缓冲能力的重要指标[13]，30%秸秆还田与60%有机肥配合施用氮肥的真菌与细菌的比值分别为0.28和0.27，显著高于其它肥料处理，说明通过秸秆还田和施用有机肥可以提高土壤的缓冲能力。
表3 不同施肥处理土壤中革兰氏阴性细菌（G?）、革兰氏阳性细菌（G+）和真菌磷脂脂肪酸含量及其比值 Table 3 PLFAs in G+, G?, fungi and the ratio among them in different fertilizations and the ratio of them (ng?g-1)
施用化肥Mineral fertilizer 60%有机肥+化肥
60% manure
plus fertilizer
常规施肥
Convention
秸秆还田
Residue return
to soil
无肥对照
No fertilizer
30%有机肥+化肥
30% manure
plus fertilizer
阳性细菌G+ Gram-positive bacteria 57.29b 47.87d 54.55bc 49.69cd 37.58e 72.17a
阴性细菌G? Gram-negative bacteria 28.36d 34.48bc 30.45cd 37.60b 22.97e 43.47a
阳性细菌/阴性细菌G+/G? 2.03a 1.39d 1.80b 1.32d 1.64c 1.66bc 真菌Fungi 18.53c 22.10b 19.95bc 24.71a 1.15e 12.25d
真菌/细菌Fungi/Bateria G++G?0.22c 0.27a 0.23c 0.28a 0.02e 0.10d
同一行内数值后标以不同字母表示在0.05 水平上差异显著
Values within the same rows followed by different letters are significantly different at the 0.05 probability level
2.4 土壤微生物磷脂脂肪酸及肥料处理的主成分分析
通过对21种磷脂脂肪酸进行主成分分析，前两个主成分可以解释总变异的87.6%。除了C14:0 3OH和C18:0在第一和第二主成分中均占较大比例外，其它19个脂肪酸分别属于不同的主成分（表4及图2）。从主成分的分析结果看，除C12:0和C15:0外，大部分的非饱和脂肪酸和环式脂肪酸的变异可以在第一主成分中反映出来，第二主成分主要反应的是真菌和在第一主成分中未能反应出来的脂肪酸。从肥料处理的主成分分析结果看（图3），第一主成分及第二主成分可以解释肥料处理变异的89.8%，相比较而言，化肥处理（No.25）和常规施肥处理（No.27）相互间的磷脂脂肪酸的组成与结构差别较小，60%有机肥处理（No.26）与秸秆还田处理（No.28）磷脂脂肪酸的组成与结构几乎重合，说明如果以土壤微生物的磷脂脂肪酸的结构分析，它们相互间变化不大。30%有机肥处理（No.30）与不施肥处理（No.29）与其它处理间的磷脂脂肪酸的结构差别较大。
图2 6种不同肥料处理单个磷脂脂肪酸载荷值
Fig. 2 PCA showing loading values for individual PLFAs
16期 卜洪震等：长期施肥管理对红壤稻田土壤微生物量碳和微生物多样性的影响 3345 表4 不同肥料处理中21种脂肪酸在第一主成分及第二主
成分的载荷值 Table 4 Principal component analysis performed after an axis
rotation the PLFA content
主成分
Component 磷脂脂肪酸标志物
Biomarker of PLFA 第一主成分 Factor 1 第二主成分 Factor 2 C12:0 0.20 -0.92 C14:0 0.97 -0.14 iC15:0 -0.65 -0.07 aC15:0 0.97 -0.020 C15:0 -0.29 0.91 C14:0 2OH 0.27 -0.28 C14:0 3OH 0.77 0.63 iC16:0 0.98 -0.09 C16:1d9 0.95 -0.07 C16:0 0.95 -0.04 iC17:0 1.00 0.01 C17:0d9,10 0.99 0.13 C17:0 1.00 0.00 C16:0 2OH 0.93 -0.24 C18:2w9,12 0.26 0.94 C18:1w9 0.95 0.29 C18:1w9t&c11 0.45 -0.87 C18:0 0.65 0.62 C19:0c9,10 0.39 0.82 cyc19:0? 0.99 -0.08 C20:0
0.90 -0.39 可解释总变异的比例
Proportion of variance explained
62.8
24.8
图3 不同肥料处理磷脂脂肪酸图谱主成分分析
Fig. 3 PCA showing variations in PLFAs pattern with
different fertilizations
3 讨论
土壤微生物量碳与土壤肥力密切相关，土壤微生物量大小也受农业管理措施的影响。本研究发现，与不施肥对照相比，施用化肥及有机肥与化肥配施均可以显著的提高土壤微生物量碳。由于施用化学肥料后，作物生物量增加，因此，还田的根茬也相应增加，为土壤微生物提供了丰富的有机物，使微生物活性增加。施用有机肥和作物秸秆还田，一方面增加了土壤的根茬量，另一方面也为土壤投入了大量的有机物，相应地也促进了土壤微生物的活性。上述结果与B?hme 等[14]的结果一致。测定总磷脂脂肪酸含量是定量分析土壤微生物较好的方法，土壤微生物量碳也是反映土壤总微生物活性的一个重要参数，都与土壤健康及肥力状况密切相关。通过对磷脂脂肪酸与微生物量间进行相关分析，二者是显著的正相关关系，相关系数为r =0.829。该研究结果与Zelles 等[15]及Yao 等[16]的结果一致。因此，秸秆还田、合理的施用化肥以及化肥与有机肥配合施用均是提高土壤肥力状况的有效措施。
施肥处理可以显著增加磷脂脂肪酸的总量，但不同的施肥处理在增加磷脂脂肪酸的种类方面存在差异。长期施用化肥后，群落中含有iC15:0的微生物明显增多，而施用有机肥和秸秆还田后，群落中含iC15:0明显减少，而aC15:0显著增加。由于iC15:0 和aC15:0都代表革兰氏阳性菌，而革兰氏阳性菌属于多样性与种类都非常丰富的细菌类群，如好氧的Bacillus 和Arthrobacter 以及厌氧的Clostridium [17]。尽管很多革兰氏阳性菌细胞膜中均含有上述两种磷脂脂肪酸，但由于不同的种类的格兰氏阳性菌产生这两种磷脂脂肪酸的比例不同[18]，因此，长期施用化肥促进了群落中包含iC15:0微生物的生长或者是促进群落中微生物产生iC15:0比例增加，而长期施用秸秆和有机肥对群落中包含aC15:0微生物的影响与此相类似。国内外很多研究者在研究施肥对土壤微生物群落的影响时，得出的基本结论是施肥促进了细菌的生长[7,19]。本研究发现，施化肥与有机肥均显著提高真菌的磷脂脂肪酸含量和真菌与细菌磷脂脂肪酸的比值。这可能是由于本研究中所测定的真菌磷脂脂肪酸为C18:2ω9,12，而相关文献中的磷脂脂肪酸则为18:2ω6c 和18:l ω9，同时，由于直接从土壤中提取出的真菌脂肪酸种类仍十分有限[20]，造成很多种类的真菌在土壤中并没有真正反映出来。
土壤微生物多样性可以分别从遗传、表型及功能
3346 中国农业科学43卷
几个层面开展研究。微生物分子生物学技术的发展，尤其是DGGE/TGGE（变形梯度凝胶电泳/温度梯度电泳）和T-RFLP（末端限制性片段长度多样性）等分子标记技术的出现，使土壤微生物结构与多样性的研究变得更加简单[21-22]。尽管该技术有巨大的潜力，但在DNA的提取量以及PCR扩增的引物选择上仍然有很多问题需要克服，以DNA为基础的技术不能够用于监测土壤微生物早期的结构变化[23]。虽然磷脂脂肪酸分析（PLFAs）技术不能在菌种和菌株水平上鉴定土壤微生物的种类，也不能对古菌进行分析，但却可以弥补以DNA为基础的分子标记技术的不足。应用该技术可以很好地对土壤微生物表型结构进行测定，并且广泛地应用在土壤微生物多样性研究，可以揭示植物植被[24-25]、土地管理与利用方式[26-27]、有机物与重金属污染[28-29]、季节变化与气候变化[30]等诸多要素对土壤微生物结构与多样性的影响。
4 结论
4.1 施用化学肥料、秸秆还田及有机肥与化肥配合施用可以显著的提高土壤的微生物量碳，土壤微生物量碳高低顺序依次为60%有机肥+化肥＞30%有机肥+化肥＞30%秸秆还田＞常规施肥＞化肥＞无肥处理。
4.2 磷脂脂肪酸分析结果表明，长期施肥处理与秸秆还田可以显著提高总磷脂脂肪酸的含量、真菌磷脂脂肪酸含量以及真菌磷脂脂肪酸与细菌磷脂脂肪酸的比值，肥料种类不同，磷脂脂肪酸的种类也会产生差异。
4.3 21种磷脂脂肪酸进行主成分分析结果表明，前两个主成分可以解释总变异的87.6%。肥料处理的主成分分析结果看，第一主成分及第二主成分可以解释肥料处理变异的89.8%。相比较而言，化肥处理和常规施肥处理相互间的磷脂脂肪酸组成与结构差别较小，60%有机肥处理与30%秸秆还田处理磷脂脂肪酸的组成与结构几乎重合。
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（责任编辑李云霞）