细胞融合
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科目细胞生物学实验题目动物细胞融合
【实验目的】
1、了解动物细胞融合的常用方法。
2、学习化学融合和电融合的基本操作过程。
3、观察动物细胞融合过程中细胞的行为和变化。
【实验原理】
细胞融合，是指在自发或人工诱导下，两个或两个以上细胞或原生质体合并为双核或者多核细胞的过程。基本过程包括细胞融合形成异核体、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（如病毒诱导融合法）、化学方法（如聚乙二醇PEG诱导融合法）、物理方法（如电场诱导融合法）。
1、病毒诱导融合
仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融合。这类病毒的被膜中含有融合蛋白，可介导病毒同宿主细胞融合，同时也可介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。
2、化学诱导融合
很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG
是广泛使用的化学融合剂。
3、电激诱导融合
包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。
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本次试验利用PEG诱导细胞融合，聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，使细胞发生融合。
【实验材料和用品】
1、材料
鸡血红细胞
2、试剂
0.85％生理盐水、50%PEG、Alsver’s液、GKN液
3、器材
离心管、滴管、离心机、光学显微镜、载玻片、盖玻片
【实验步骤】
1、鸡血细胞的制备与保存，取2mL鸡血+2mL Alsver’s液，再加6mL Alsver’s液，混匀后制成悬液。（在4℃下保存，本实验老师完成此步骤）。
2、取步骤1悬液1 mL +4 mL 0.85%的NaCl溶液，进行以下三次离心处理：
①：1200r/min离心5分钟。（去上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5 mL）
②：1000~1200r/min离心5分钟。（去上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5 mL）
③：1000~1200r/min离心7分钟。
3、将步骤2最后一次的沉降血球（去上清液后，约0.1~0.2mL），加入GKN液至1~2mL，制成10%的细胞悬液。
4、取上述10%的细胞悬液1mL，加入3mLGKN液。
5、实验①：取步骤4中悬液1.0mL+0.5mL 50%PEG液
实验②：取步骤4中悬液0.5mL+0.5mL 50%PEG液
实验③：取步骤4中悬液0.5mL+1.0mL 50%PEG液
混匀制片，常温下静止2-3分钟，在显微镜下观察。
【实验结果】
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在显微镜中能观察到未融合的细胞、接触融合的细胞（包括刚接触融合状、典型哑铃状、椭圆状等）等情况，具体形态如下图：
未融合的细胞（10
×40）接触融合的细胞（10
×40）
接触融合的细胞（10×40）接触融合的细胞（10×40）
【讨论与结论】
PEG法细胞融合的影响因素：
1. PEG的分子量与浓度: 细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高, 对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。
2. PEG的pH值: 经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。
3. PEG的处理时间: 处理时间越长，融合效果越好, 但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养, 故处理时间可适当放宽至数分钟。
4. 融合时的温度: 由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正
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比。因此，为了获得更好的融合效果, 在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细, 一般采用的温度为38~40℃。
5. 注意区分融合细胞与重叠细胞（若为融合细胞，那么无论怎么转动细焦旋钮，细胞膜皆是不完整的；否则反之），此次试验观察到较多细胞聚集成团，可能是细胞悬液浓度略大或滴的量不合适所致。
本实验所用材料为鸡的血细胞的原因：
1.鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴别；
2.实验材料便宜、易得。细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。细胞内只有一个核，定为未融合细胞；有二至多个核，定为融合细胞。
本实验注意项：
2、实验中由于为低速离心，故弃去上清时不宜直接倒掉，可使用滴管、移液管、移液器等吸取，否则血细胞容易弥散。
3、操作步骤（4）时应注意先加入细胞悬液，再加GKN液，使GKN液穿过细胞悬液。
4、离心时注意严格配平，不平时用水补平。
【思考题】
细胞融合的应用
（一）动物细胞
1、用于生产单克隆抗体
只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能像骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术。
2、用于基因定位和绘制人类基因图谱
杂种细胞中某一染色体或其片段的存在与否与细胞的某一性状表达与否相联系，从而可以实现把基因定位于某一染色体或某一区段上。
3、用于动物育种
体细胞核移植技术是将细胞核移植到另一细胞的细胞质中的生物技术。动物体细胞融合后，杂种细胞难以发育再生为一个个体。但借助于细胞核移植的方法将融合后杂种细胞的细
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胞核移入去核成熟卵内，可培育新的杂种。另外，细胞核移植技术的建立，还为目前进行的哺乳动物体细胞克隆和转基因技术做了良好的铺垫。
4、用于细胞疗法
将患者的任何体细胞与去核卵细胞融合，融合子进行有丝分裂形成囊胚，囊胚的内细胞团是多能干细胞，对多能干细胞进行诱导使其定向分化可形成所需的组织和器官用于器官移植，不仅解决了器官和组织来源问题，而且也避免宿主对外来物的免疫排斥。
5、动物体细胞融合在基础理论研究方面的作用
在这方面，细胞融合主要用于研究细胞核质关系和个体发育，解释疾病的发生机制和膜蛋白动力学研究。
（二）植物细胞融合技术应用
植物细胞融合技术目前主要是作为扩大变异的手段，同时也朝着将抗药性和胞质雄性不育等细胞基质基因导入另一个体细胞的方向发展，有可能形成新的核质杂种。如果获得了有用性状的细胞系，在还不能形成植株时，就可以通过快速大量繁殖细胞加以利用。
1、在生产研究方面
植物细胞融合在育种上有重要的应用价值，在生产研究应用方面，通过诱导不同种属间甚至不同科间原生质体的融合，可能打破有性杂交不亲和性的界限，广泛地组合各种基因型，从而有可能形成有性杂交方法所无法获得的新型杂交植株。
2、运用于外源遗传物质引入原生质体
植物细胞融合可以将细胞器、DNA、质粒、病毒、细菌等外源遗传物质引入原生质体，从而有可能引起细胞遗传性的改变，为某些珍稀动物的复壮等提供了可行的方法，应用于植物育种、种质保存、无性系的快速繁殖和有用物质生产等等。
（三）、微生物细胞融合技术应用
用于植物和微生物育种是细胞融合技术最基本的应用领域，对微生物而言，该技术主要用于改良微生物菌种特性，提高目的产物的产量，使菌种获得新的性状，合成新产物等。
1、微生物细胞融合技术的对象
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在目前，微生物细胞融合的对象已拓展到酵母、霉菌、细菌、放线菌等多种微生物的种间以至属间，不断培育出用于各种领域的新菌种。
2、微生物细胞融合技术的应用
微生物细胞融合技术的一项突出应用是生物药品的生产，包括抗生素、生物活性物质、疫苗等。它适用于疾病的诊断、预防及治疗等。另一方面的突出应用就是为发酵工业提供优良菌种。
细胞融合技术的应用与前景
细胞融合技术的应用与前景 人们很早就注意到了在自然条件下发生的细胞融合现象，首先在病料组织中发现了由细胞融合产生的多核细胞，紧接着发现在脊椎动物和无脊椎动物的正常细胞中也可发生细胞融合，随后在体外组织培养中也发现了离体细胞的融合现象。自从发现活病毒可在体内介导癌细胞融合后，人们又实现了利用灭活病毒促进动物异种细胞融合，从而打破了细胞融合的种属屏障，推动细胞融合技术跃上新的 台阶。原生质体的大量制备较为困难，限制了植物细胞融合技术的发展，因此植物细胞融合的起步较动物细胞融合要迟10年左右。直到用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功后，才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。由于病毒诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因，人们又找到了比病毒简便、快速和高效且比病毒更易制备和控制，活性稳定，使用方便的化学物质PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合，但在PEG诱导细胞融合的有效的浓度范围内(50～55)对细胞毒性很大，因此人们又找到了新的方法来替代PEG，这些新方法有电脉冲诱导细胞融合技术和激光融合技术以及空间融合技术等。纵观细胞融合技术的发展历史，该技术的不断改进首先表现在融合剂上，从致癌活病毒到灭活病毒再到化学物质，其次体现在新方法上，再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法一般采用将化学法和物理法结合起来进行，如将磁、超声、机械等和激光、电相结合，同时添加化学剂以便进一步提高融合率，细胞融合的方法和手段始终朝操作方便、简单，便于量化研究，同时融合率又能得到不断提高的 方向发展。 1．细胞融合的意义 所谓细胞融合就是指在外力(诱导剂或促融剂)作用下，两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合或细胞杂交口]。如取材为体细胞则称体细胞杂交，体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞，由此形成的杂交细胞，其特性会有很大的变化。细胞融合不受种属的局限，可实现种间生物体细胞的融合，使远缘杂交成为可能，因而是改造细胞遗传物质的有力手段。它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限和生殖壁垒，极大地扩大了遗传物质的重组范围；细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，在技术和仪器设备上的要求不象基因工程那样复杂，投资少，有利于广泛开展研究和推广，有着重大的实践意义，正得到科学界的日益重视[2_引。经过长期反复研究和实践，细胞融合技术逐步发展和完善起来，已成为生物工程的基础技术之一。特别是近20年来，从理论和实践两个方面，有力地推动了生物科学各领域的发展。细胞融合方法得到了不断的更新，融合率也得到逐步的提高。 2．动物细胞融合技术 动物细胞融合是从细胞水平来改变动物细胞的遗传性，用于生产单克隆抗体、疫苗等特定的生物制品，改良培育动物新品种，缩短动物的育种过程。动物细胞融合的应用范围已广及生物学的各个分支学科，特别是在绘制人类基因图谱方面取得了显著成绩。虽然细胞杂交属于理论生物学范畴，但在实际应用方面也有重大突破。在基础理论研究上，动物细胞融合技术对研究细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制等方面都有重要意义。在实际应用方面，动物细胞融合技术在药物定向释放系统、细胞治疗以及抗肿瘤免疫等方面起到重要的用。动物体细
细胞电融合仪 ECM2001 安装操作手册
ECM?2001 安装/操作手册
2．技术规格 3．操作细则 4．产生杂交瘤的实验方法 5．服务及保修 6．附录：电穿孔技术在转基因及动物克隆中的应用
损伤请速与我公司联系。 请小心地拆开包装，将仪器及附件取出，并依据合同清点货物内容及数量，如果有任何外观损伤或者货物与合同有差异，请速与我公司联系。 请保留包装箱，以便满足将来一旦要运送该仪器的需求。 2.电源： 该仪器采用220V电源，请确认您的电源为稳定的220V。如果电源不稳定的话，有可能对仪器造成严重损害！ 请确认您的电源严格接地，我们提供给您的电源线为三芯带地线电源。请不要改动该三芯电源线结构，否则有可能对仪器造成严重伤害！ 3.安装： 如果确认仪器包装无问题，且与合同相符，则可以进行安装。 请将仪器安装在一个干燥，水平，常温环境中。尽量避免灰尘和化学药品对仪器的损害。 仪器与其他物品的距离不少于15厘米，以保证仪器冷却的需求。 将电源线等附件拆包装，待用，依据后续章节继续操作。 第二节技术规格 1.外观尺寸： 宽：17＂ 高：11＂ 长：17.5＂ 2.重量： 47磅 3.电气规格： 电源：220V，单相，7A耐熔保险 交流：频率固定在1MHZ 电压： 0 – 75 V （从零到峰值） 脉冲时间：0 – 99 秒 直流：高电压模式（HV） 电压： 10 – 3000 V （峰值） 脉冲时间：1 – 99 毫秒 低电压模式（LV） 电压： 10 – 500 V （峰值） 脉冲时间：1 – 99 毫秒 0.01– 0.99 毫秒 脉冲次数：1 – 99
第三节操作细则 1.注意事项： 请严格按照下述操作细则对ECM 2001进行操作。 在没有连接打印机的情况下，严禁按“PRINT SETTINGS”按钮！否则仪器将会锁死。 如果打开仪器电源的时候，发现“MANUAL START”按钮处于亮灯状态，请马上关闭电源！ 2.程序或步骤（操作过程） 高电压警告：为了实际操作和安全的原因，在手动或自动操作模式中，ECM 2001在施加交流电场或直流脉冲的过程中，请不要接触任何电缆或电极连接处，当需要连接或拆下电缆时，要检查系统不在操作中或处于备用状态。 Automatic自动操作模式： 1.连接Chamber（融合池）和位于ECM 2001背面的输出插口。 2.如果使用打印机的话，把打印机电源电缆插到ECM 2001背面的打印电源接口上(J4)。 3.如果使用打印机的话，用串口线缆将打印机连接到ECM 2001背面的打印机输入口上。 4.如果使用Enhancer 400（示波器）的话，将Enhancer 400的电源线插在市电上。 5.如果使用Enhancer 400（示波器）的话，先用电缆将Enhancer 400的输入插口与ECM 2001背面的输出插口连接，然后用电缆把融合池连接在Enhancer 400上的输出插口上。 6.把ECM 2001的电源线插到合适的电源插座上（220伏）。 7.打开ECM 2001背面上的电源开关。 8.设定所需的AC Voltage (1) 即交流电压。 9.设定所需的AC Duration Seconds (2) 即交流持续时间。 10.选择HV或LV模式(4)。 11.设定DC Pulse Length (5) 即直流脉冲长度。 12.设定DC Voltage(6) 即直流电压。 13.设定Number of Pulses (7) 即脉冲个数。 14.设定Post-Fusion AC Seconds (3) 即融合后交流时间到所需的脉冲长度。 15.把细胞悬液/试剂倒入BTX Chamber（融合池）中。 16.检查所有的设置。 17.按下Automatic Start(9) 即自动按钮，ECM 2001发出一声嘟嘟声，把预先设 置的所有参数送到Chamber（融合池）上。 18.仅对电穿孔来讲，设置AC Voltage (1)、AC Duration (2)和Post-Fusion AC (3) 为零，其余步骤不变。 Manual手动操作模式： 1．其余步骤同1-11，按一下Manual Start(12) 即手动按钮，手动模式中，AC
细胞融合实验报告
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目动物细胞融合 【实验题目】 动物细胞融合 【实验目的】 1.了解动物细胞融合的常用方法。 2.学习化学融合的基本操作过程。 3.观察动物细胞融合过程中细胞的行为与变化。 【实验材料与用品】 1、材料 鸡血红细胞 2、试剂 50%PEG、GKN溶液、Alsever’s细胞保存液、0.85%氯化钠溶液。 3、器材 倒置显微镜、离心机、载玻片、盖玻片、离心管、废液缸、滴管等。 【实验原理】 细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括：病毒诱导融合、化学诱导融和和电激诱导融合。 1、病毒诱导融合 仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融时也可介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。 2、化学诱导融合 很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG 是广泛使用的化学融合剂。 3、电激诱导融合
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目动物细胞融合 包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。 【实验步骤】 在本次实验中采用的是化学诱导融合的方法，利用PEG使鸡血红细胞发生融合。具体实验步骤如下： 1、取鸡血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混匀后制悬液（4℃保存）【老师已做好，可直接使用】 2、取（1）中悬液1ml+4ml的0.85%的NaCl溶液，进行以下三次离心处理： ①在1200r/min下离心5min，去掉上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5ml； ②1000-1200r/min下离心5min，去掉上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5ml； ③1000-1200r/min下离心7min 【因时间关系此次实验只离心一次】 3、将离心后的沉降血球（去上清后约0.1-0.2ml）加入GKN至1-2ml，使之成为10%的细胞悬液； 4、取上述10%的血球悬液1ml,加入3mlGKN液，使每毫升含血球15000000个； 5、分别取（4）1ml+0.5ml50%PEG，（4）0.5ml+0.5ml50%PEG，（4）0.5ml+1.0ml50%PEG，混匀滴片，编号分别为①②③号溶液。在常温下2-3min后，显微镜下观察。 【实验结果】 1、实验中可观察到两个和多个细胞发生质膜融合现象,可看到不同融合状态的细胞： ①两细胞的细胞膜相互接触、粘连； ②接触部分的细胞膜崩解，两细胞的细胞质相同，形成一个细胞质的通道，呈现哑铃状； ③通道扩大，两个细胞连成一体，呈现一个长椭圆形细胞； ④细胞融合完成形成含有双核或者多核的细胞，呈圆形。 比较典型的细胞融合时的形态如下图：
细胞融合操作规程1
细胞融合 一、实验材料 手术剪，镊子，离心机，蜡盘等。 二、实验所配试剂 1640基础培养液：取一包1640干粉，溶于1000 mL双蒸水中，慢慢加入2.5 g NaHCO3，0.22 μm滤膜过滤除菌，分装，4℃冰箱保存备用。 青链霉素溶液（100×）：取青霉素100万单位和链霉素1 g，无菌溶于100mL已灭菌的三蒸水中，0.22 μm滤膜过滤除菌，1 mL/管分装，-20℃冻存备用。 1640完全培养液：向1640基础培养液中加入10％的小牛血清和1%青链霉素溶液（100×）（为养成良好的操作习惯，建议不加最好），摇匀，4℃冰箱保存备用。 HT培养液：在100 mL含15%血清的1640完全培养液中加入1 mL 100×的HT溶液，摇匀，4℃冰箱保存备用。 HA T培养液：在100 mL含15%血清的1640完全培养液中加入2 mL 50×的HA T溶液（使用前HA T有部分白色沉淀应充分混匀），摇匀，4℃冰箱保存备用。 GNK溶液：准确称取KCL 0.4g ，NaCL 8g ，Na2HPO4·2H2O 1.77g(Na2HPO4·12H2O 3.56g)，NaH2PO4·H2O 0.69g(NaH2PO4·2H2O 0.78g)，酚红0.01g，葡萄糖2g，加DDW 定容至1000mL，调节pH 值至7.2，115℃高压灭菌，4℃保存备用。
三、实验步骤 1.免疫小鼠 选择6-8周龄的Balb/c雌性小鼠进行免疫，免疫剂量50μg/只，皮下注射。免疫程序如下： 首次免疫：100μL抗原+100μL弗氏完全佐剂/只 加强免疫：100μL抗原+100μL弗氏不完全佐剂/只，于首免后2周后进行。共免疫3次，每次间隔2周。第二次免疫后的第十天断尾采血（一般尾部采血4μL，溶于200μL PBS混匀备用）检测效价，如果效价很低或没有效价，建议直接放弃，不用继续再免疫。如果效价可以，在二免后的2周进行三免，最后一次免疫10天后，断尾采血，用适当的抗原进行包被，用间接ELISA检测抗体效价，效价达到1:1600以上即可进行细胞融合。 超强免疫：最后一次加强免疫后2周，细胞融合前3~5天，尾静脉或腹腔注射50μg纯抗原。 2. 饲养细胞的制备 融合前1-2 d制备饲养细胞。取昆明鼠1只致死（收集小鼠血清，以供筛选时用该血清做阴性对照），75%酒精消毒体表，无菌手术剪刀轻轻剥去小鼠的腹部皮肤，以防止剪破腹膜，暴露腹膜。然后用5mL注射器和16号针头将5mL预冷的HAT打入小鼠腹腔，轻轻压挤腹部，重新吸出注入的液体（在吸取过程中为防止污染，避免针头刺破肠管），收取小鼠腹腔巨噬细胞。用HAT稀释至40ml，100uL/孔添
细胞融合技术的发展过程
细胞融合技术的发展过程 生物方法融合：1957年，冈田善雄意外发现仙台病毒（HVJ），能诱导悬液中小鼠艾氏腹细胞（EAC）融合。然后Harris、Kada等用于诱导种间细胞融合，获得成功。 化学方法融合:1972年，卡尔森首先用硝酸钠进行烟草两个种的细胞原生质体的融合，1974年K a o等，首先发现聚乙二醇（PEG）能诱导植物细胞原生质体融合产生杂交细胞。 1975年Pentecorvo发现P E G也能帮助哺乳类动物细胞的融合，1976年，Davidson更进一步证实这一结果，并且认为其具有简单快速、高效率等优点。因而，1975年之后聚乙二醇就逐渐取代了仙台病毒。 电融合法电融合法:70年代未期和80年代初期发展起来的一种新的细 胞融合方法。1970年，Senda首先应用电脉冲，通过微电极在显微镜下使植物细胞融合，奠定电融合技术基础。 激光诱导卵细胞融合:激光诱导方法是最新的细胞融合方法，该法为张闻迪等人在1988年首先应用，他们利用激光微束的单色性、高功率密度、短脉宽和极小的作用范围等特点。对泥鳅受精卵进行融合试验，获得成功，且融合后的细胞可存活发育，经卵裂期、囊胚期、原肠期、孵化期、直至幼鱼。整个过程可通过显微镜观察，还可同时由电视摄象监视器观察和进行照相记录。 典型试题解析
试题：回答下列关于细胞工程的问题。（1）如图是细胞融合的示意图， 据图回答。 ①若A、B是植物细胞，则在细胞融合之前已用处理过。用 聚乙二醇诱导融合之后，体系中会出现未融合的细胞，原因 是。 ②若A是小鼠骨髓瘤细胞，B是受到抗原刺激的B淋巴细胞，用灭活的 仙台病毒诱导融合之后，需要用特定的选择性培养基进行筛选。在该培 养基上，细胞和的细胞都会 死亡，只有融合的杂种细胞（杂交瘤细胞）能够生长。杂交瘤细胞不止 一种，原因是。 （2）植物组织培养有一项应用是培育“脱毒苗”，动物细胞培养需要 创造“无菌无毒的环境”，脱毒苗中的“毒”是指，“无菌无毒环境”中的“毒”是指。 （3）制备单克隆抗体有一项重要的应用是作为诊断试剂，例如“早早 孕诊断试剂盒”。“早早孕诊断试剂盒”通过检测被测试者尿液中人绒 毛膜促性腺激素的含量，从而判断被测试者是否怀孕，其起检测作用的 核心物质是。 （4）动物的培育过程中需要进行细胞核移植，早期的细胞 核移植操作会将供体细胞的细胞核取出，再植入去核的卵母细胞，但取 出细胞核的过程会对细胞核造成一定的损伤。后期的核移植操作是直接 将供体细胞注射到去核卵母细胞外的透明带位置，再通过电刺激的方法 诱导，从而实现供体细胞核进入去核卵母细胞。 【答案】：（1）①纤维素酶和果胶酶融合的成功率不是百分之 百②未融合的亲本融合的具有同种核小鼠脾脏中分离 的B淋巴细胞是多种 （2）病毒代谢废物 （3）抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体 （4）克隆供体细胞膜与去核卵母细胞膜融合 【解析】：植物体细胞杂交技术：就是将不同种的植物体细胞原生质体 在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成完整植物体的技术；单克隆抗体的制备过程：首先用特定抗原注射小鼠体内，使其发生免疫，小鼠体内产生具有免疫能力的B淋巴细胞，再利用动物细胞融合技术将 B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，经过两次筛选获得产生特定抗体的杂交 瘤细胞。据图分析，图示A细胞与B细胞融合，形成的C是正在融合的 细胞，D是杂种细胞。
细胞融合技术的发展及应用
#专题综述# 细胞融合技术的发展及应用* 霍乃蕊a,韩克光b (山西农业大学a.食品科学与工程学院;b.动物科技学院,山西太谷030801) 摘要:细胞工程是四大生物工程之一,细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上,另一方面体现在新方法上,再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法正在尝试将各种物理、化学手段综合应用,使细胞融合的方法和手段向操作更为简便,便于量化研究,同时又能使融合率得到不断提高的方向发展。本文以细胞融合技术的发展历史为主线,对上述内容做了简要综述。 关键词:细胞融合技术;发展;应用 中图分类号:Q813.2 文献标识码:A 文章编号:100727146(2006)022******* C ell Fu si on T echn iqu e:its D eve l opm en t and App lica ti on s H U O N a i2ru i a,HA N Ke2guang b (Shanxi Agr i cu lt ura lUn i ve rs it y a.College of Food Sc i ence and Eng i neering; b.College ofAn i m a l Sc ience and Technol ogy,Ta i gu030801,Shanx,i Ch i na) Ab stra ct:C ell u l a r engi neer i ng i s o ne of t he f our techniques of biote chnolo gy,and as t he core of ce ll ular engi neering, the cell fusi on technique ha s acqu ired outstand i ng ach ieve m ents i n m any fields such as agr icu lt ure,m ed icine and envi2 ron m enta l protecti on.Its app licati on i s still i ncreasi ng i n nu m ber.The i m prove m ent of t he ce ll fusi on techn i que i nvol ves the fusi on agent,new m e t hods and the cells used i n fusi on.No w new cell fusi on m ethods are re sorti ng to the co m b i ned usage of phys i ca l and chem i ca lm ethods to deve l op a s i m p le and co nven i ent,easy quantificati on and a t t he sam e ti m e can i ncrease the fusi on rate.A ll these aspects were d i scussed i n th i s pape r centered aro und the h i story of the cell f usio n te ch2 n i que. K ey word s:ce ll fus i on techn i que;deve l op m ent;app licati on 细胞工程是生物工程主要组成之一,出现于20世纪70年代末至80年代初,是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一,已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段,而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生物学,特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的意义。随着细胞融合技术研究的不断深入,细胞融合 第15卷第2期2006年4月 激光生物学报 ACTA LAS ER BI O LOGY SI NI CA Vo.l15No.2 Ap r.2006 *收稿日期:2005203210;修回日期:2005209222 基金项目:山西省科委攻关项目(04105523);山西省自然科学基金项目(20041094) 作者简介:霍乃蕊(1972)),女,博士,现为澳大利亚纽卡斯尔大学访问学者,主要从事生物工程方面研究. (电子信箱)sxndkgh@163.co m
细胞工程在细胞融合技术上的应用
摘要：细胞工程是四大生物工程之一，细胞融合技术作为细胞工程的一项 心基础技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果，而且应用领域不断扩大。细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上，另一方面体现在新方法上，再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法正在尝试将各种物理、化学手段综合应用，使细胞融合的方法和手段向操作更为简便，便于量化研究，同时又能使融合率得到不断提高的方向发展。 关键词：方法动物细胞融合植物细胞融合应用 1.细胞融合常用的技术 1.1生物法 仙台病毒HVJ诱导法 1962年日本的冈田善雄偶然发现了由日本血凝性病毒HVJ或称仙台病毒引起的艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象+ 冈田善雄的研究为人工诱导体细胞杂交奠定了方法学基础, 细胞融合现象的发现引起细胞学界的高度重视。 1.2化学法 1.2.1盐类融合法 此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。1.2.2高钙和高pH值融合法 Keller首先发现高Ca2+和高pH值可以诱发融合。Melchers用此法将烟草种内2个光敏感突变体诱导融合成功并获得100余株体细胞杂种。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。 1.2.2聚乙二醇融合法(PEG法) 加拿大籍华人高国楠(1974)用聚乙二醇(PEG)为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌豆的融合[5]。此法比病毒更易制备和控制,活性稳定,用PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合。在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%～55%)对细胞的毒性应进一步减小。 1.3物理法 1.3.1电脉冲诱导细胞融合技术 电脉冲诱导细胞融合技术,产生于20世纪80年代,目前已成为细胞融合的有效手段之一。该技术融合效率高,是PEG的100倍,操作简便、快速,对细胞无毒无害,可在显微镜下观察融合全过程[6]。 1.3.2激光融合技术 1987和1989年德国海德堡理化研究所采用准分子激光器使油菜原生质体融合,从开始照射到完成融合仅需几秒钟[7]。该法可选择任意两个细胞进行融合,易于实现特异性细胞融合,作用于细胞的应力小,定时定位性强,损伤小,参数易于控制,操作方便,可利用监控器清晰地观察整个融合过程,实验重复性好,无菌无毒性,但它只能逐一处理细胞。 2细胞融合技术的最新进展
实验一：鸡血细胞融合
实验一：鸡血细胞融合 一、实验目的 1、熟悉细胞融合的理论； 2、掌握PEG诱导的细胞融合方法。 二、实验原理 1、细胞融合原理 两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因为各自存在完整的细胞膜，在特殊融合诱导物的作用下，两个细胞膜发生一定的变化，就可促进两个或多个细胞聚集，相接触的细胞膜之间融合，继之细胞质融合，形成一个大的融合细胞。 利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起,使两细胞的胞质沟通,从而造成相互接触的细胞之间发生融合。 细胞与组织不同，不排斥异类、异种细胞。不仅能产生同种细胞融合、种间细胞融合，而且也能诱导动植物细胞间产生融合。细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合。 2、细胞融合方法 诱导细胞融合的主要方法有：病毒诱导融合，化学融合剂诱导融合和电融合。 1. 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。 2. 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚已二醇（PEG）。PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝结；②破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个打的双核或多核融合细胞。 3. 电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。 所有的细胞融合方法都有其各自的优缺点，我们在本次实验中采用PEG诱导细胞融合的方法。 三、实验材料和用品
诱导细胞融合——电 场 法
诱导细胞融合——电场法 实验目的 本实验学习掌握电场法诱导细胞融合的方法。 实验原理 电融合技术的原理是：在短时间强电场(高压脉冲电场，场强为kV／cm量级，脉冲宽度为卜q量级)的作用下，细胞膜发生可逆性电击穿，瞬时地失去其高电阻和低通透特性，然后在数分钟内恢复原状。当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接轴区时，即可诱导它们的膜相互融合，导致细胞融合。该方法具有直观、定向、高效的优点。 实验材料、用品 材料：小麦叶片原生质体，烟草叶片原生质体。） 试剂：1%(W／V) 纤维素酶,1% (W／V)果胶酶,0.7mol／L甘露醇;10mmol/L CaCl2.2H2O,0.7mmol/L KH2PO4,pH 6.8～7.0。 ***用具：离心机，振荡器，电融合仪，细胞融合池。 实验步骤 1、将制备原生质体悬液以1000r／min离心5min，用超纯水配制的0.6 M甘露醇清洗，重复两次。
2、吸去上清夜，再用0．6 M甘露醇将细胞密度调整成5*104个／ml混匀。 3、开启电融合仪电源，将正弦交变电场频率选择在1～1．30MHz 左右，正弦交变电场电压峰值为15V左右，占空比为50％，直流脉冲电压为200V，电脉冲宽度为10～100 μs，脉冲个数为2个。 4、用移液枪将原生质体悬液吸入电融合室中，置于显微镜下接上电极，待观察。 5、给原生质体悬液施加正弦交变电场，由低到高分别调节交变电场频率和电压，直流脉冲可调节参数为电压、脉冲宽度、间隙时间、脉冲个数等，在原生质体相互成串后，发生有效接触后，立即庙低到液施以电脉冲。高在显微镜下观察，可见原生质体迅速排列成串。 6、静止片刻在显微镜下观察原生质体在被施加电脉冲前后的变化及融合的情况选择确定。 7、用移液器向电融合室中吸出原生质体悬液滴片，马上进行台盼蓝染色，观察并计算原生质体的融和率和成活率，计三个视野，取其平均数。 作业 1.将观察到的细胞融合绘图。 2.计算用倒置显微镜观察的细胞融合率。
细胞电融合仪ECM安装操作手册
细胞电融合仪 ECM?2001 安装/操作手册
目录 1．检查清点货物及安装 2．技术规格 3．操作细则 4．产生杂交瘤的实验方法 5．服务及保修 6．附录：电穿孔技术在转基因及动物克隆中的应用
第一节检查清点货物及安装 1.拆封包装： ECM 2001细胞电融合仪采用纸箱包装，收到货物后，请检查包装完好程度，如果有任何损伤请速与我公司联系。 请小心地拆开包装，将仪器及附件取出，并依据合同清点货物内容及数量，如果有任何外观损伤或者货物与合同有差异，请速与我公司联系。 请保留包装箱，以便满足将来一旦要运送该仪器的需求。 2.电源： 该仪器采用220V电源，请确认您的电源为稳定的220V。如果电源不稳定的话，有可能对仪器造成严重损害！ 请确认您的电源严格接地，我们提供给您的电源线为三芯带地线电源。请不要改动该三芯电源线结构，否则有可能对仪器造成严重伤害！ 3.安装： 如果确认仪器包装无问题，且与合同相符，则可以进行安装。 请将仪器安装在一个干燥，水平，常温环境中。尽量避免灰尘和化学药品对仪器的损害。 仪器与其他物品的距离不少于15厘米，以保证仪器冷却的需求。 将电源线等附件拆包装，待用，依据后续章节继续操作。 第二节技术规格 1.外观尺寸： 宽：17＂
高：11＂ 长：＂ 2.重量： 47磅 3.电气规格： 电源：220V，单相，7A耐熔保险 交流：频率固定在1MHZ 电压： 0 – 75 V （从零到峰值） 脉冲时间：0 – 99 秒 直流：高电压模式（HV） 电压： 10 – 3000 V （峰值） 脉冲时间：1 – 99 毫秒 低电压模式（LV） 电压： 10 – 500 V （峰值） 脉冲时间：1 – 99 毫秒 0.01–毫秒 脉冲次数：1 – 99
细胞融合技术研究进展
细胞融合技术研究进展 年级专业 课程 学生姓名 学号 指导教师
摘要：人们对细胞融合的机理、融合方法的了解越来越多，其应用范围也越来越广。对细胞融合的机理、方法、应用及目前存在的问题进行了综述。 关键词：细胞融合;机理;方法;应用 细胞融合不仅为细胞的起源、核质关系、肌肉骨骼胎盘的发育[1]、肿瘤发生、干细胞介导的组织再生等理论领域的研究提供了有力的手段[2],而且被广泛应用于微生物学、育种学、发生生物学,特别是在单克隆抗体[3-4]及动植物远缘杂交育种方面具有重要意义。 1细胞融合的机理 最近研究表明,细胞融合与病毒和细胞之间的融合以及细胞内的膜泡融合有许多相似之处,即带包被的病毒(或细胞)通过转膜病毒蛋白介导与宿主细胞的细胞膜进行融合。I类病毒融合蛋白包括流感病毒红血球凝集素(HA)和人类免疫缺陷病毒包被蛋白,它们都具有相似的结构域,即都具有a-螺旋结构。病毒和细胞之间正是通过这些蛋白来完成融合过程(伴随有构象的变化)的。细胞内的膜泡融合也是如此,其相关融合蛋白包括GTPases及SNARE家族。因此推测细胞融合采用相似的机理。然而细胞融合蛋白并不全具有a-螺旋结构,提示a-螺旋并非融合所必需[2]。 2细胞融合的方法 2.1生物法 自从发现活的仙台病毒可在体内介导癌细胞融合后,人们又实现了利用灭活的病毒促进动物异种细胞融合,从而打破了细胞融合的种属屏障,推动细胞融合技术跃上新台阶。解决病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异等问题是病毒诱导细胞融合新的研究方向。 2.2化学法 2.2.1盐类融合法 此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。2.2.2高钙和高pH值融合法 Keller首先发现高Ca2+和高pH值可以诱发融合。Melchers用此法将烟草种内2个光敏感突变体诱导融合成功并获得100余株体细胞杂种。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。 2.2.3聚乙二醇融合法(PEG法) 加拿大籍华人高国楠(1974)用聚乙二醇(PEG)为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌豆的融合[5]。此法比病毒更易制备和控制,活性稳定,用PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合。在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%～55%)对细胞的毒性应进一步减小。 2.3物理法 2.3.1电脉冲诱导细胞融合技术 电脉冲诱导细胞融合技术,产生于20世纪80年代,目前已成为细胞融合的有效手段之一。该技术融合效率高,是PEG的100倍,操作简便、快速,对细胞无毒无害,可在显微镜下观察融合全过程[6]。
PEG诱导细胞融合
科目细胞生物学实验实验题目动物细胞融合日期2013.03.07 姓名*** 系年级2011级生物基地学号*** 实验一利用聚乙二醇为媒介物进行细胞融合 摘要 细胞融合(cell fusion)是在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融合形成异核体(heterokaryon)、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。 诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（离心，震动，电刺激）。某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。 关键词 细胞融合；人工诱导；PEG 前言 人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。 细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。细胞融合另一个重要应用就是制备单克隆抗体，单克隆抗体可以用作诊断试剂，治疗疾病和运载药物，具有准确，高效，简易，快速等优点。因此，融合细胞的研究为生物学无论在基础理论上或生产实践上开辟了一条新的道路。这一技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。 一．实验目的 1.了解动物细胞融合的常用方法及原理。 2.掌握利用PEG为介导物对细胞进行诱导融合的方法。 3.观察动物细胞融和过程中细胞的行为和变化。 二．实验原理
PEG诱导细胞融合
实验十一 PEG诱导细胞融合 一、实验目的 1．了解聚乙二醇诱导细胞融合的原理与技术。 2．学会鉴别融合细胞。 二、实验原理 细胞融合又称细胞杂交，是指两个或两个以上的细胞合并成一个细胞的现象。细胞融合技术是细胞工程骨干技术，除了用于一些基础性研究外，在植物方面主要用于合成新种；动物方面主要用于生产单克隆抗体。 细胞融合的诱导因素主要有以下三种： 1、生物融合因子：如病毒。 2、物理因素：如电融合仪,主要用于植物细胞。 3、化学因素：如聚乙二醇（PEG），分子量200－6000都可用，以1000较好。聚乙二醇最早用于诱导植物原生质体的融合，现已普遍用于多种细胞。其优点是:材料易得、操作方法简单、效果稳定。 病毒介导的细胞融合常用灭活的仙台病毒，主要用于动物细胞融合。其优点是融合率高，对各种动物细胞都适宜；缺点是不稳定，在保存过程中融合活性降低，并且制备过程繁琐。 细胞融合，即在自然条件下或利用人工法 (生物的、物理的、化学的)，使两个或两个以上的细胞合并成一个具有双核或多核细胞的过程。人工诱导细胞融合始于20世纪50年代，并迅速成为一门新兴技术。由于不仅同种细胞可以融合，种间远缘细胞也能融合，甚至于动植细胞也能合二为一，因此细胞融合技术目前较广泛应用于细胞生物学、遗传学和医学研究等各个领域，并且取得显著的成绩。 聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C(CH20CH2)nCH2OH，相对分子质量在200-6000均可用作细胞融合剂。普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合：细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百分比表示。该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。 三、实验材料及用品 实验材料：鸡红细胞、鸡白细胞 实验器材：普通离心机，水浴锅：50oC，37oC，细胞计数板 四、实验步骤 1、配50％PEG：称取10gPEG，加入带盖离心管中；将带盖离心管放入电炉上的沸水中，加 热使PEG熔化；待冷却至50oC时，加入等体积预热至50oC的HanKs液或不加血清的培养液混匀，保存于37oC水浴中。 2、准备鸡血：加2ml肝素抗凝鸡血于10ml带盖离心管中，800rpm离心5min，去血浆；再 加5ml Hanks液洗红细胞一次，800rpm离心，去上清；配制成2%鸡血。 3、分离鸡白细胞：1ml淋巴细胞分离液+1ml鸡血，2000rpm离心20分钟，吸出白细胞放入 另一个离心管中加入5ml Hanks液1000rpm离心5min,弃上清。 4、混合细胞：取0.5ml鸡红细胞加入白细胞沉淀，用手轻弹离心管底部，使沉淀松散。 5、PEG介导融合：吸取1ml 50％PEG，在37oC水浴中1分钟内加入细胞沉淀中，边加边振 摇离心管，使PEG与细胞混匀； 6、终止PEG作用：向试管中加入8－10ml Hanks液轻轻吹打混匀，在37oC水浴中静置5min （稀释PEG终止其作用，并降低介质密度，便于离心）；
细胞融合技术及其研究进展
细胞融合技术及其研究进展 摘要：自1958年Okada首次表明紫外灭活的仙台病毒可以诱导体外培养细胞融合形成多核体以来，细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术，已在医药、环保、免疫学、医药、食品以及农业等领域的基础研究和应用开发。本文综述了细胞融合技术中的常用方法：仙台病毒（HVJ）诱导法、聚乙二醇（PEG）化学诱导法、电融合诱导法及激光诱导法的基本原理和研究进展。 关键词：细胞；细胞融合；细胞工程 1 引言 在细胞融合是 20 世纪发展起来的一种细胞工程技术，可以在一定的条件的诱导下使两个或多个细胞(原生质体) 相互接触，进而发生膜融合、胞质融合和核融合，从而形成杂种细胞。细胞融合所形成的新细胞( 杂合细胞) 得到了来自两个父本细胞的遗传物质，因而具有新的遗传学或生物学特性[1]。细胞融合逐渐成为细胞工程的一项核心技术，它不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等领域的研究提供了有力手段，而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发育生物学、免疫学、医药、食品以及农业等领域具有广泛应用价值[2]。它已成为杂交育种、单克隆抗体制备、动物克隆以及抗癌疫苗研发等现代生物医学研究中的一项关键技术。 随着研究的不断深入，细胞融合技术的应用领域越来越广，产生的影响也日益显著，本文就其现有的研究情况进行讨论。 2 细胞融合技术 2.1仙台病毒(HVJ)诱导法 2.1.1仙台病毒诱导法原理 1962年日本的冈田善雄偶然发现了由仙台病毒引起的细胞融合成多核细胞的现象[2]。由于仙台病毒诱导细胞融合法较简便,特别是许多种类的细胞对其敏感,所以常选用仙台病毒作为细胞融合的诱导剂。仙台病毒属于RNA病毒,其质膜表面存在两种糖蛋白,一种是HANA 蛋白,它具有凝集红细胞能力和神经氨酸普酶活性。一种是F蛋白,它具有质膜融合能力(质膜和细胞膜融合的能力)、细胞融合能力和溶血能力。仙台病毒诱导细胞融合的能力与共质
细胞融合
姓名学号班级 组别同组者 科目细胞生物学实验题目动物细胞融合 【实验目的】 1、了解动物细胞融合的常用方法。 2、学习化学融合和电融合的基本操作过程。 3、观察动物细胞融合过程中细胞的行为和变化。 【实验原理】 细胞融合，是指在自发或人工诱导下，两个或两个以上细胞或原生质体合并为双核或者多核细胞的过程。基本过程包括细胞融合形成异核体、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（如病毒诱导融合法）、化学方法（如聚乙二醇PEG诱导融合法）、物理方法（如电场诱导融合法）。 1、病毒诱导融合 仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融合。这类病毒的被膜中含有融合蛋白，可介导病毒同宿主细胞融合，同时也可介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。 2、化学诱导融合 很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG 是广泛使用的化学融合剂。 3、电激诱导融合 包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。
细胞融合的应用
细胞融合的应用 细胞融合技术已在农业、工业、医药等领域取得了开创性的研究成果，应用领域不断扩大。该技术不仅为核质关系、基因定位、基因调控、遗传互补、细胞免疫、疾病发生、膜蛋白动力学等理论领域的研究提供了有力的手段，而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发育生物学，在实际应用中特别是在单克隆抗体、抗肿瘤疫苗及动植物远缘杂交育种和微生物菌种选育，绘制基因图谱等方面具有十分重要的意义。随着细胞融合技术的不断改进和完善，动物、植物及微生物细胞融合技术无论在基础理论研究还是在实际应用中产生的影响将日益显著。 人们很早就注意到了在自然条件下发生的细胞融合现象，首先在病料组织中发现了由细胞融合产生的多核细胞，紧接着发现在脊椎动物和无脊椎动物的正常细胞中也可发生细胞融合，随后在体外组织培养中也发现了离体细胞的融合现象。自从发现活病毒可在体内介导癌细胞融合后，人们又实现了利用灭活病毒促进动物异种细胞融合，从而打破了细胞融合的种属屏障，推动细胞融合技术跃上新的台阶。原生质体的大量制备较为困难，限制了植物细胞融合技术的发展，因此植物细胞融合的起步较动物细胞融合要迟10年左右。直到用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功后，才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。由于病毒诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因，人们又找到了比病毒简便、快速和高效且比病毒更易制备和控制，活性稳定，使用方便的化学物质PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合，但在PEG诱导细胞融合的有效的浓度范围内(50%～55%)对细胞毒性很大，因此人们又找到了新的方法来替代PEG，这些新方法有电脉冲诱导细胞融合技术和激光融合技术以及空间融合技术等。纵观细胞融合技术的发展历史，该技术的不断改进首先表现在融合剂上，从致癌活病毒到灭活病毒再到化学物质，其次体现在新方法上，再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法一般采用将化学法和物理法结合起来进行，如将磁、超声、机械等和激光、电相结合，同时添加化学剂以便进一步提高融合率，细胞融合的方法和手段始终朝操作方便、简单，便于量化研究，同时融合率又能得到不断提高的方向发展 动物细胞融合技术 动物细胞融合是从细胞水平来改变动物细胞的遗传性，用于生产单克隆抗体、疫苗等特定的生物制品，改良培育动物新品种，缩短动物的育种过程。动物细胞融合的应用范围已广及生物学的各个分支学科，特别是在绘制人类基因图谱方面取得了显著成绩。虽然细胞杂交属于理论生物学范畴，但在实际应用方面也有重大突破。在基础理论研究上，动物细胞融合技术对研究细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制等方面都有重要意义。在实际应用方面，动物细胞融合技术在药物定向释放系统、细胞治疗以及抗肿瘤免疫等方面起到重要的作用。动物体细胞杂交技术主要应用于以下几个方面。 2.1 用于基因定位和绘制人类基因图谱 JP2 杂种细胞中某一染色体或其片段的存在与否与细胞的某一性状表达与否相联系，从而可以实现把基因定位于某一染色体或某一区段上。1967年Weise和Green发现在人和鼠的融合细胞中，人的染色体优先丢失，并证明利用这一特点有可能对人染色体上的基因进行定位。1970年Ruddle等开始系统地用融合细胞作为实验系统来绘制人类基因图。 2.2 用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗 一般认为肿瘤细胞表面抗原不能诱导强的免疫应答反应，树突状细胞（dendritic cells,DCs）与肿瘤细胞融合形成的树突状细胞疫苗能够有效地激发机体的细胞免疫应答，无论是在动物研究还是在人体早期临床试验中都证明这是一种方便、安全、可行的方法[4]。并且由于融合细胞可以在体内存活，因此可以维持较长时期的免疫应答，有利于诱发机体产生有效的抗肿瘤免疫。肿瘤抗原可以肽段或完整蛋白的形式与DCs结合，或者将肿瘤抗原基因转化进DCs中，使其内源性地表达抗原，这两种方法在抗肿瘤免疫应答中均有效[5-9]，但适于免疫的肿瘤抗原及其基因难以鉴定从而限制了其应用[2]，有实验证明用这两种方法制备的肿瘤疫苗的免疫原性不及肿瘤细胞与树突状细胞直接融合的异核细胞，融合细胞保持了DCs和肿瘤细胞的特性，并且能高效地将未知的肿瘤抗原提呈给免疫系统，今后肿瘤疫苗的研究工作将集中在疫苗的