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Triton X-100

Triton X-100 (曲拉通X-100) 化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚,是一种优异的表面活化剂、润湿及洗涤剂。

1、在免疫组织化学(厚切片) 和免疫细胞化学中,Triton X-100 被用来做细胞破膜剂/细胞通透剂,即在细胞膜上打孔,可以溶解细胞膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆内,这样抗体就能进入内与相关的抗原结合了。

2、Triton X-100一般在阻断缓冲液中或稀释缓冲液中使用,基本不用做洗液。使用浓度0.2%。较厚的石蜡切片更应该应用Triton X-100,这样可以获得更好的染色背景。

3、在PBS中加入0.2%-0.5%的Triton X-100,可以使片子冲洗更充分,特别是一抗孵育后使用,可以降低背景。

做细胞爬片的免疫组化时,需要在细胞膜上打孔要用到Triton X-100,可以用0.1%Triton X-100(用0.1%柠檬酸三钠缓冲液配制)破膜。

内源生物素含量较高的组织切片做免疫组化,当一抗孵育后可以在PBS中加入0.2%-0.5%的Triton X-100进行洗涤,这样能降低背景。

0.1%浓度,4度预冷的。作用时间为10分钟

用Triton-X100就可以破膜对于抗原表达在胞浆,可以用0。1%的triton20分钟,不要时间长,免得抗原外溢,如果是0.3%,时间放短也可以,具体的时间还要根据自己的具体情况摸一下. 免疫组化的玻片准备,一般是先用洗衣粉将玻片洗净.流水冲洗干净,泡酸48小时,然后流水冲洗,洗净,放于蒸馏水中洗三次,然后于无水酒精洗片,将玻片放置于铝饭盒中,烤箱80度烤干,冷却后用多聚或APES处理,烤干即可.

1 将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中,按2*104/ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片,5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。

2 PBS清洗标本3次各1 min。

3 冰丙酮固定15 min。

4 空气干燥5min。

5 PBS清洗标本3次各2 min。

6 0.5%Triton X-100( DPBS配) 孵育1次20 min。

7 PBS清洗标本3次各2 min。

8 3%H2O2孵育15 min。

9 DPBS清洗标本3次各2 min。

10 封闭血清孵育(5%正常二抗血清DPBS液)20min。

11 一抗孵育(PBS配,滴度1:200,湿盒)4OC 过夜

或37OC 60 min。

阴性对照最好用一抗来源血清,否则用PBS液

12 PBS清洗标本3次各5 min。

13 二抗工作液孵育(湿盒)37OC 30 min。

14 PBS清洗标本3次各5 min。

15 C液(湿盒)37OC 30 min。

16、PBS清洗标本3次各5 min。

17、DAB显色(避光,镜下观察至棕色)约3~10min。

18、蒸馏水洗2次1 min。

19、苏木素复染0.5~1min。

20、自来水洗30min。

21、树胶封片。

1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础,要获得良好细胞爬片须注意以下:

(1)对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上,这样细胞爬片才较牢固,冲洗时不易脱片;

(2)接种的细胞密度适中,以2*104/ml为宜,若细胞密度太高,5天后细胞连接成片冲洗时易脱片;

2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4OC冰箱,冰丙酮固定时会使细胞收缩,可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。

3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿,(不可用吸管太用力吹,易脱片)

4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜

5、Triton X-100(屈立通)表面活性剂,脱去细胞膜中最主要的成分脂质,对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用,对于抗原表达在胞浆者时间要控制好,使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。

Triton X-100

Triton X-100在免疫组化中尤其是冰冻切片中经常用到,它的作用是破膜,在细胞膜上打孔,利于细胞内的抗原的暴露。冰冻切片中的用量一般是用0.3%的Triton X-100,室温30分钟即可。在石蜡切片中也有用的,用0.01%的Triton X-100稀释抗体,然后4度过夜,当然不同的抗体条件不一样的,需要实践的摸索。

Triton X-100浓度一般用0.3%的,是用PBS进行稀释.

步骤是:

切片固定后,PBS洗三遍,然后将切片放进Triton X-100溶液中,室温十分钟即可.

然后进行双氧水甲醇封闭.进行以后的步骤.