Protein aggregation as bacterial inclusion bodies is reversible
Protein aggregation as bacterial inclusion bodies is reversible
M.Mar Carrio¨,Antonio Villaverde*
Institut de Biologia Fonamental and Departament de Gene?tica and Microbiologia,Universitat Auto?noma de Barcelona,Bellaterra,
08193Barcelona,Spain
Received14November2000;accepted4December2000
First published online8January2001
Edited by Felix Wieland
Abstract Inclusion bodies are refractile,intracellular protein aggregates usually observed in bacteria upon targeted gene overexpression.Since their occurrence has a major economical impact in protein production bio-processes,in vitro refolding strategies are under continuous exploration.In this work,we prove spontaneous in vivo release of both L-galactosidase and P22tailspike polypeptides from inclusion bodies resulting in their almost complete disintegration and in the concomitant appear-ance of soluble,properly folded native proteins with full biological activity.Since,in particular,the tailspike protein exhibits an unusually slow and complex folding pathway involving deep interdigitation of L-sheet structures,its in vivo refolding indicates that bacterial inclusion body proteins are not collapsed into an irreversible unfolded state.Then,inclusion bodies can be observed as transient deposits of folding-prone polypeptides,resulting from an unbalanced equilibrium between in vivo protein precipitation and refolding that can be actively displaced by arresting protein synthesis.The observation that the formation of big inclusion bodies is reversible in vivo can be also relevant in the context of amyloid diseases,in which deposition of important amounts of aggregated protein initiates the pathogenic process.?2001Federation of European Biochemical Soci-eties.Published by Elsevier Science B.V.All rights reserved. Key words:Inclusion body;Protein aggregation;Refolding; Recombinant protein;L-Galactosidase;TSP
1.Introduction
Inclusion bodies(IBs)are major protein aggregates com-monly occurring in recombinant bacteria when the expression of plasmid-encoded genes is directed at high rates[1^3].De-spite some physiological factors in￡uencing IB formation have been identi￠ed[2],attempts to prevent protein aggregation are in general unsuccessful[3].Therefore,and since polypeptides embedded in IBs are devoid of any biological activity and therefore usefulness in a biotechnological context,refolding procedures for in vitro protein recovery from puri￠ed IBs are under continuous development[4^7].On the other hand, bacterial IBs are interesting and convenient models for dy-namic and structural analysis of protein aggregation,that could serve to better understand biological situations which are di¤cult to approach experimentally,such as protein de-position in amyloid diseases.Despite this potential interest, bacterial IBs,often viewed as an obstacle in bioproduction processes,have been in general poorly investigated.
In this work,we prove that bacterial IBs are not inert protein aggregates that undergo a parsimonious volumetric grow by product accumulation,but on the contrary,the result of an unbalanced equilibrium between in vivo protein aggre-gation and solubilisation.Interestingly,this equilibrium can be spontaneously displaced towards protein refolding when protein synthesis is arrested,a situation that conducts to an almost complete IB disintegration and to the appearing of fully active protein forms.This fact can have a signi￠cant impact on protein recovery when using bacteria as cell fac-tory.In addition,it o?ers new data about the general mechan-ics of protein aggregation and an interesting model to monitor protein aggregation and solubilisation in real time,a possibil-ity that could be relevant also in the context of prionic and other amyloid diseases.
2.Materials and methods
2.1.Bacterial strains,plasmids,proteins and culture conditions
The Lon3Escherichia coli strain BL21[8]and its LacZ3derivative BL26were used for protein production.Plasmid pJVP1LAC is a pJLA602derivative that encodes a L-galactosidase fusion harbouring the VP1capsid protein of foot and mouth disease virus(FMDV)[9], whose production is controlled by the lambda p R and p L lytic pro-moters and the temperature-sensitive CI857repressor.Plasmid pTTSPA is a pTrc99derivative that encodes a pseudo-wild-type TSP protein(TSPA)with the full biological activities of TSP[10], whose production is under the control of p tac promoter.Production of both VP1LAC and TSPA in E.coli results in IB formation.Luria Bertani(LB)medium[8]plus100W g/ml ampicillin was used for cul-ture of recombinant cells,and induction of gene expression was achieved by temperature upshift from28to423C for VP1LAC and by IPTG addition(up to1mM)at373C for TSPA.At di?erent times after induction of gene expression,protein synthesis was arrested by chloramphenicol addition(up to200W g/ml).In TSPA-producing cul-tures,media were also washed by centrifugation to remove IPTG, immediately prior to chloramphenicol addition.After chlorampheni-col addition,pJVP1LAC-carrying cells were incubated at283C to allow a proper folding and activity of CI857ts repressor.For some in vivo experiments,the strain JGT17,a v ibp derivative of MC4100 [11]was also used.
2.2.IB analysis and puri￠cation and determination of protein activity Procedures for numeric and volumetric IB analysis inside the cells were already described[12],as well as the IB puri￠cation protocol by repeated detergent treatment[13].Since TSP IBs are rather smaller than VP1LAC's,in vivo analyses were done on24h-and3h-aged IBs respectively.Soluble and insoluble cell fractions were analysed by PAGE and proteins were detected in Western blot by using appropri-ate sera.L-Galactosidase activity was determined according to Mill-er's method[14].TSP activity was determined by plaque counting on con￡uent cultures of Salmonella typhimurium LT2after incubating cell
0014-5793/01/$20.00?2001Federation of European Biochemical Societies.Published by Elsevier Science B.V.All rights reserved. PII:S0014-5793(01)02073-7
extracts and tailless P22particles for assembling [10].When required,cells were disrupted by sonication as described [15].For in vitro anal-ysis,puri￠ed TSP and VP1LAC IBs (10U concentrated)from 3h-induced cultures,were incubated at about 1.3W g of protein per ml at 373C with 20U concentrated,sonic cell extracts from plasmid-free BL26cells at late exponential growth phase.These cells,were also grown in LB medium at 373C as indicated above and shifted to 423C at the middle exponential phase.Protease inhibitors PMSF (to 1mM)and benzamidine (to 2.5W g/ml)were also added.As a control,IBs were incubated under the same conditions with the cell-free bu?ers used for further activity analysis,using Z bu?er for VP1LAC IBs [14]and TMBS for TSP IBs [10].Samples were taken every 30min for activity analysis as described above,and soluble and insoluble protein fractionation.Proteins in the obtained fractions were analysed by Western blot.In the ￠gures,representative experiments are shown from sets of four replicas.
3.Results
3.1.In vivo refolding of IB protein
In a previous work,we have shown a dynamic transition between soluble and insoluble forms of L -galactosidase fusion proteins in IB-forming cells,that might involve a signi￠cant fraction of IB polypeptides and in which proteolysis is con-nected [16].Since it had not been still solved whether proteol-ysis could be a mechanism of IB protein solubilisation or on the contrary,it occurs over already solubilised polypeptides,we have studied L -galactosidase enzymatic activity and IB volumetric evolution after arresting the synthesis of the L -ga-lactosidase fusion protein VP1LAC.Under these conditions,both soluble protein (Fig.1A)and L -galactosidase activity (Fig.1B)increase,concomitantly with a reduction in the in-soluble VP1LAC fraction (Fig.1A).Note that in a recombi-nant L -galactosidase,that does not aggregate as IBs (protein CO46),enzymatic activity is rapidly lost after the arrest of protein synthesis (Fig.1B)by degradation of the soluble CO46.Moreover,in BL26/pJVP1LAC cells,a simultaneous decrease of IB number and average volume is also observed (Figs.1C,D,2,top).Altogether,these results strongly suggest that IB-embedded protein is solubilised in vivo resulting in disintegration of IB particles trough their progressive volu-metric reduction.In addition,at least a fraction of IB protein can reach the native conformation with fully biological activ-ity,proving that proteolysis occurs on polypeptides previously released by a proteolytic-independent process.The fact that in
an Ibp 3strain,in which IBs are also formed (not shown),L -galactosidase activity is recovered as in the wild-type (Fig.1B),suggests that IbpA,B proteins are not critical in this refolding process.
In an additional approach to evaluate in vivo IB evolution in a di?erent expression system we monitored IB evolution in cells producing P22TSP protein IBs.TSP is a homotrimeric protein that undergoes a complex folding pathway from which unfolded intermediates collapse as IBs under overpro-duction conditions [17,18].In addition,TSP has been exten-sively used as a model for the analysis of molecular interac-tions between aggregated polypeptides [19]and of protein folding and unfolding pathways [20^24].The arrest of re-combinant protein synthesis in IB-carrying cells results,as in the case of L -galactosidase,in IB disintegration (Fig.2,bot-tom;Fig.3D).Loss of TSP in the insoluble cell fraction can be also monitored,as in the case of VP1LAC,by a numeric IB reduction and a concomitant rise of TSP with full biolog-ical activity (Fig.3B).This indicates that the aggregated pro-tein can be released from IBs in absence of protein synthesis and transferred to the soluble cell fraction as TSP monomers,that,also in absence of protein synthesis,can refold as fully active TSP trimers.Note that a rapid increase in the trimeric native form (Fig.3B)is accounted by an initial lost of the monomeric form from the soluble cell fraction (Fig.3A)and that a rate transition in the folding pathway between 1and 2h is coincident with the appearing of monomeric forms from IB particles,that results again in a further folding rate tran-sition at about 4h.Some folding intermediates and degrada-tion fragments have also been observed in blots (not shown).Although it cannot be excluded that IBs formed by other proteins could undergo alternative or less e¤cient refolding processes,the fact that two structurally di?erent proteins are released with a comparable e¤ciency from IBs reveal an un-expected context for protein aggregation in bacterial cells,in which IB formation and growth must be regarded as the result of an unbalanced equilibrium between protein synthesis and aggregation.During production of misfolding-prone proteins,bottlenecks in the protein folding assistant network would conduct to deposition of unfolded and misfolded polypep-tides,that would be progressively refolded upon chaperone availability,a situation that is strongly favoured when the de novo protein production is
arrested.
Fig.1.A:Presence of VP1LAC in the insoluble (black circles,left scale)and soluble (white circles,right scale)cell fractions from BL26bacte-rial cultures.The vertical line indicates chloramphenicol addition and temperature downshift.DU are densitometric units.B:L -Galactosidase
activity in bacterial cell cultures producing either VP1LAC (black squares,left scale)or CO46(white squares,right scale).CO46is a pseudo-wild-type L -galactosidase not forming IBs.The activity in a VP1LAC-producing,IbpAB 3strain is also indicated (white triangles,left scale).U are Miller L -galactosidase units [14].C:Percentage of cells carrying either none (black bars),1(light grey bars),or 2IBs (dark grey bars),in BL21/pJVP1LAC from the same culture than in A and B.D:Variation in the average volume of remaining IBs.The induction time is indi-cated in all the panels.
3.2.In vitro refolding of IB protein
Some components of the bacterial folding assistant network have been identi￠ed,although their sequential implication in the cascade folding process is still under exploration [25^27].Irrespective of the speci￠c factors acting on bacterial cells on IB protein refolding,the possibility to induce in vitro protein solubilisation from protein aggregates could be of interest in a variety of purposes.In Fig.4A,we show a rising of a major VP1LAC degradation product (fragment B)[9]and a concom-itant increase of L -galactosidase enzymatic activity by incuba-tion of puri￠ed IBs in sonic extracts of E.coli cells.A simul-taneous rising of intact VP1LAC is also observed by high sensitive developing of blots (not shown),but the amount of this species is too low for an accurate determination.L -Ga-lactosidase activity is not detected when IBs are incubated in saline bu?er,although in some of these samples,low
protein
Fig.2.Micrographies of VP1LAC (top)and TSP (bottom)BL26producing cells.Numbers indicate time in h after stopping the synthesis of re-combinant proteins.The black bar represents 5W
m.
Fig.3.A:Monitoring of TSP monomer amounts after chloramphenicol addition (time 0)in insoluble (black circles,left scale)and soluble (white circles,right scale)cell fractions.B:TSP activity monitored by phage rescue in the total cell fraction (black squares,left scale)and TSP found in active,trimeric forms in the soluble cell fraction (white squares,right scale).C:Percentage of cells carrying either none (black bars),1(light grey bars),or 2IBs (dark grey bars),in BL26/pTTSPA from the same culture as in A and B.Note that in A,the detection of mono-mers in the insoluble cell fraction does not necessarily imply that TSP is actually in the monomeric form as embedded into IBs,since for elec-trophoretic analysis of insoluble protein samples must be denatured before loading.D:Variation in the average volume of remaining IBs.The induction time is indicated in all the panels.
amounts were eventually observed in the soluble cell fraction of some samples (not shown).The intact form of the soluble enzyme in cell extract-treated IB samples is hardly detectable in blots,and since the main degradation fragment is not present in pure IBs [9],this indicates a rapid proteolysis after the release of polypeptides from aggregates,in agreement with the late fading of the enzymatic activity.On the other hand,about 60%of IB protein is lost in about 2h.In Fig.4B,an analogous increase of TSP phage rescuing activity is observed in TSP IBs cell extract mixtures,simultaneously to a lost up to 40%of IB protein.Again,the late decrease of TSP activity and concentration of soluble TSP indicates further protein degradation.4.Discussion
Since early studies on bacterial physiology,IBs were be-lieved to be compact protein aggregates of unfolded polypep-tide chains,that being unreachable by proteases and chaper-ones,remain inert once produced in the cell [1,28].However,
it has been observed enzymatic activity associated to some enzyme-based IBs [29,30]and also the presence of native-like secondary structure in IB protein [31].In addition,the ￠nding of di?erent conformational states within IB particles [32]has been very recently con￠rmed by combining scanning electron microscopy and kinetic modelling of in vitro IB tryp-tic digestion [13].These observations indicate that as in the case of amyloid ￠brils,IBs might be formed by a range of folding intermediates rather that by completely unfolded chains.
Even more intriguing is the observation of a dynamic pro-tein transition between soluble and insoluble cell fractions during volumetric IB growth in vivo [16],that appeared to be linked to the proteolytic digestion.By exploring this event in both a L -galactosidase fusion (VP1LAC)and P22TSP,we prove here that IB growth is the result of an unbalanced equi-librium between protein precipitation and cell-mediated re-folding and solubilisation,that can be spontaneously redi-rected towards body disintegration by arresting the synthesis of the recombinant polypeptide.Under this situation and when IBs had been already formed,their number and volume rapidly decrease in living cells (Figs 1,2and 3),concomitant with a transition of the target protein from the insoluble to the soluble cell fraction and a protein refolding process to gain full functionality.Note that TSP folding is a specially long and complex molecular process [17]to reach deep L -sheet interdigitation between subunits [33].In the view of these results,it seems reasonable to speculate that components of the bacterial folding assistant network are able to act over aggregates of misfolded protein prompting protein release and correct protein folding from IBs.This solubilisation pro-cess is eclipsed when protein synthesis is directed at high rates,but becomes evident when de novo synthesis is arrested.How-ever,note that in both in vivo and in vitro situations,a small protein amount remains insoluble after prolonged experi-ments,a fact that could be in agreement with the observation of a heterogeneity in the molecular organisation of IB poly-peptides as recently described [13].It is worthy to note,that whereas TSP IBs are homogeneously a?ected by protein sol-ubilisation (Fig.3D),recalcitrant species of aggregated VP1LAC seem to be heterogeneously distributed among IBs in the bacterial culture,since a small fraction of these particles displays essentially the same volume in absence of protein synthesis (Fig.1D).This observation could indicate that dif-ferent polypeptides can be packaged in di?erent organisation patterns within IB particles.
Independent approaches have proved that chaperones can prevent protein aggregation in di?erent cellular contexts and also favour in vivo solubilisation from aggregates from di?er-ent origin [34^40].However,as far as we know,bacterial inclusion bodies have not been explored in this context and its transient nature never reported,despite being extremely common and inconvenient in recombinant bacteria.The data presented here indicate that IB formation is not a dead-end process in the protein quality network [41]of bac-terial cells,but a transient situation in which IBs act as a reservoir of misfolded polypeptide chains,over which cell components can still apply its folding assistant potential.The fact that IB solubilisation can also be done in vitro by using cell extracts (Fig.4),o?ers intriguing possibilities to solve or diminish one of the main bottlenecks in the use of bacteria as a cell factory for foreign proteins,namely IB
for-
Fig.4.A:L -Galactosidase activity (right scale)from VP1LAC IBs
incubated with crude cell extracts (black triangles)or with saline bu?er (white triangles).Protein amounts (left scale)in the insoluble (black circles)and soluble (white circles)cell fractions are also indi-cated.Whereas the insoluble protein corresponds to the intact VP1LAC,the soluble fraction is mainly composed by a major deg-radation fragment of 90kDa [9].B:TSP activity as monitored by infectious phages rescued from P22tailless particles (right scale),in TSP IBs incubated with crude cell extracts (black triangles)or with saline bu?er (white triangles).Protein amounts (left scale)in the in-soluble (black circles)and soluble (white circles)cell fractions are also indicated.Intact TSP monomers are the main component of the soluble cell fraction.
mation.More importantly,the fact that protein aggregation can be reverted even from poorly structured elements such as IBs prompts to deeply scrutinise possibilities for therapeutic approaches to amyloid diseases based on the reversion of the aggregation process.This possibility is specially appealing since the recent report that chaperones can act as neurode-generative repressors[35,36]and modulators of￠bril forma-tion[37].
Acknowledgements:We are indebted to J.Checa,V.Ferreres for tech-nical assistance and Dr.F.Baneyx for generously providing strain JGT17.This work has been supported by grant BIO98-0527(CICYT) and by M a Francesca de Roviralta Foundation.M.M.C.is a recipient of a predoctoral fellowship from UAB,Barcelona,Spain.
References
[1]Marston,F.A.O.(1986)Biochem.J.240,1^12.
[2]Strandberg,L.and Enfors,S.O.(1991)Appl.Environ.Micro-
biol.57,1669^1674.
[3]Georgiou,G.and Valax,P.(1996)Curr.Opin.Biotechnol.7,
190^197.
[4]Clark,E.D.B.(1998)Curr.Opin.Biotechnol.9,157^163.
[5]Misawa,S.and Kumagai,I.(1999)Biopolymers51,297^307.
[6]Guise,A.D.,West,S.M.and Chaudhuri,J.B.(1996)Mol.Bio-
technol.6,53^64.
[7]Shi,P.Y.,Maizels,N.and Weiner,A.M.(1997)Biotechniques
23,1036^1038.
[8]Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989)Molecular
Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edn.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY.
[9]Corchero,J.L.,Viaplana,E.,Benito,A.and Villaverde,A.(1996)
J.Biotechnol.48,191^200.
[10]Carbonell,X.and Villaverde,A.(1998)Biochem.Biophys.Res.
Commun.244,428^433.
[11]Thomas,J.G.and Baneyx,F.(1998)J.Bacteriol.180,5165^5172.
[12]Carrio¨,M.M.,Corchero,J.L.and Villaverde,A.(1998)FEMS
Microbiol.Lett.169,9^15.
[13]Carrio¨,M.M.,Cubarsi,R.and Villaverde,A.(2000)FEBS Lett.
471,7^11.
[14]Miller,J.H.(1972)Experiments in Molecular Genetics,Cold
Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY. [15]Feliu,J.X.,Cubarsi,R.and Villaverde,A.(1998)Biotechnol.
Bioeng.58,536^540.
[16]Carrio¨,M.M.,Corchero,J.L.and Villaverde,A.(1999)Biochim.
Biophys.Acta1434,170^176.
[17]King,J.,Haase-Pettingell,C.,Robinson,A.S.,Speed,M.and
Mitraki,A.(1996)FASEB J.10,57^66.[18]Haase-Pettingell,C.A.and King,J.(1988)J.Biol.Chem.263,
4977^4983.
[19]Speed,M.A.,Wang,D.I.and King,J.(1996)Nat.Biotechnol.
14,1283^1287.
[20]Schuler,B.,Rachel,R.and Seckler,R.(1999)J.Biol.Chem.274,
18589^18596.
[21]Speed,M.A.,Morshead,T.,Wang,D.I.and King,J.(1997)
Protein Sci.6,99^108.
[22]Mitraki,A.,Fane,B.,Haase-Pettingell,C.,Sturtevant,J.and
King,J.(1991)Science253,54^58.
[23]Speed,M.A.,Wang,D.I.and King,J.(1995)Protein Sci.4,900^
908.
[24]Carbonell,X.and Villaverde,A.(1998)FEBS Lett.432,228^
230.
[25]Buchberger,A.,Schroder,H.,Hesterkamp,T.,Schonfeld,H.J.
and Bukau,B.(1996)J.Mol.Biol.261,328^333.
[26]Braig,K.(1998)Curr.Opin.Struct.Biol.8,159^165.
[27]Veinger,L.,Diamant,S.,Buchner,J.and Goloubino?,P.(1998)
J.Biol.Chem.273,11032^11037.
[28]Hellebust,H.,Murby,M.,Abrahmsen,L.,Uhle¨n,M.and En-
fors,S.-O.(1989)Biotechnology7,165^168.
[29]Worrall,D.M.and Goss,N.H.(1989)Aust.J.Biotechnol.3,28^
32.
[30]Tokatlidis,K.,Dhurjati,P.,Millet,J.,Be¨guin,P.and Albert,J.P.
(1991)FEBS Lett.282,205^208.
[31]Oberg,K.,Chrunk,B.A.,Wetzel,R.and Fink,A.L.(1994)Bio-
chemistry33,2628^2634.
[32]Bowden,G.A.,Paredes,A.M.and Georgiou,G.(1991)Biotech-
nology9,725^730.
[33]Steinbacher,S.,Seckler,R.,Miller,S.,Steipe,B.,Huber,R.and
Reinemer,P.(1994)Science265,383^386.
[34]Krobistch,S.and Lindquist,S.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.
USA97,1589^1594.
[35]Warrick,J.,Chan,H.Y.E.,Gray-Board,G.L.,Chai,Y.H.,Paul-
son,H.L.and Bonini,N.M.(1999)Nat.Genet.19,148^154. [36]Kazemi-Esfarjani,P.and Benzer,S.(2000)Science287,1837^
1840.
[37]Muchowski,P.J.,Scha?ar,G.,Sittler,A.,Wanker,E.E.,Hayer-
Hartl,M.K.and Hartl,F.U.(2000)https://www.wendangku.net/doc/5714833267.html,A 97,7841^7846.
[38]Charmichel,J.,Chatellier,J.,Woolfson,A.,Milstein,C.,Fersht,
A.R.and Rubinsztein,D.C.(2000)https://www.wendangku.net/doc/5714833267.html,A
97,9701^9705.
[39]Mogk,A.,Tomoyasu,T.,Goloubino?,P.,Rudiger,S.,Roderm,
D.,Langen,H.and Bukau,B.(1999)EMBO J.18,6934^
6949.
[40]Diamant,S.,Ben-Zvi,A.P.,Bukau,B.and Goloubino?,P.
(2000)J.Biol.Chem.275,21107^21113.
[41]Wickner,S.,Maurizi,M.R.and Gottesman,S.(1999)Science
286,1888^1893.
第四章 蛋白质纤维
第四章蛋白质纤维 §4.1蛋白质纤维的一般知识 蛋白质纤维：指基本组成物质为蛋白质的一类纤维。 毛：羊毛、驼毛、兔毛、马毛 天然蛋白质纤维蚕丝：桑蚕丝，柞蚕丝 蛋白质纤维再生蛋白质纤维大豆纤维，牛奶纤维 一蛋白质的组成及结构 属于高分子化合物，结构十分复杂，蛋白质又称朊，是构成生命最原始最基础的物质，羊毛的主要成分是：角朊（角质），丝的主要成分是丝朊（丝素）。 1 元素组成主要元素：碳、氢、氧、氮，还有少量硫磷、铁 2 氨基酸组成蛋白质的基本组成为氨基酸，主要为α－氨基酸， 结构通式： H2N—CH2—COOH R 3 分子结构 蛋白质分子是氨基酸彼此通过氨基和羧基脱水缩合，以酰胺键（即肽键－CO－NH－）联接而成的大分子。 酰胺键又称为肽键，由肽键相连接的缩氨酸叫做肽。 R 蛋白质大分子链为多肽链，又称为多缩氨酸链，是由基团—NH—CH—CO—重复连接而成。 分子之间的作用力：氢键、盐式键、二硫键 二蛋白质的两性性质 蛋白质分子中既含有氨基又含有羧基，因而具有酸性又具有碱性，是典型的两性高分子电解质。 等电点：调节溶液中的pH值，当蛋白质所带的正负电荷数相等时，此时的pH值即为蛋白质的等电点。 羊毛等电点：4.2～4.8 蚕丝等电点：3.5～5.2 在等电点时，具有特别重要的性质：蛋白质不发生电泳现象，溶解度、膨化度、粘度、渗透压、导电率等均显示最低值。
§4.2羊毛 羊毛主要指：绵羊身上剪下的毛。 羊毛的特性：弹性好，手感丰满、吸湿能力强、保暖性好，不易沾污，光泽柔和、染色性能优良，具有独特的缩绒性。 一羊毛的形态结构 原毛：从羊身上剪下来的羊毛 羊毛杂质：羊毛脂、羊汗、沙土、水分、草屑、草籽或其他植物性杂质。 羊毛脂：高级脂肪酸和高级一元醇组成的复杂的有机混合物 羊汗：有机酸盐和无机酸盐组成 羊毛可分为三个部分：毛尖、毛根、毛干。 外观：羊毛纤维具有天然卷曲、纵向呈鳞片覆盖的圆柱体， 从内至外分为三层：鳞片层（表皮层）、皮质层、髓质层 鳞片层（表皮层）：逆鳞片方向的摩擦系数大于顺鳞片方向的摩擦系数，称为 定向摩擦系数，这使羊毛具有缩绒性和毡缩性。 皮质层：羊毛的主要组成部分，决定羊毛纤维的物理性能，存在天然色素，因而有些色毛的颜色难以除去。 髓质层：由薄膜细胞组成，髓质层使纤维的强度、卷曲、弹性、染色性较差。 二羊毛的化学组成和分子结构 羊毛的主要成分：角质（角朊），由α－氨基酸缩合而成。 组成元素：碳、氢、氧、氮，还有硫 分子结构：α－氨基酸缩合而成的链状大分子 构型：α－螺旋结构 三羊毛的超分子结构（具体见P99） 由3个螺旋结构的多缩氨酸链组成基本原纤微原纤原纤束（皮质细胞） 四羊毛的机械性能 1 羊毛的线密度 羊毛纤维的直径差异很大，最细绒毛直径为7μm，最粗可达240μm 2 羊毛的长度 由于天然卷曲的存在，其长度可分为自然长度和伸直长度，国产细羊毛的长度在5.5～9 cm, 半细毛的长度在6～40cm。 3 羊毛的卷曲
蛋白翻译后修饰(研究生高级生化)
蛋白翻译后修饰(齐以涛老师) 上课老师没说重点 1.蛋白的概念:由许多氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合 物。 2.蛋白后修饰概念和意义（ＰＰT4-5） 3.蛋白后修饰种类 1．切除加工 2. 糖基化 3.羟基化 4.甲基化 5．磷酸化?６．乙酰化?7．泛素化 200. … ８.类泛素化?９.…? 磷酸化修饰 １.概念: 磷酸化是通过蛋白质磷酸化激酶将ATP的磷酸基转移到蛋 白的特定位点上的过程。大部分细胞过程实际上是被可逆 的蛋白磷酸化所调控的,至少有3０%的蛋白被磷酸化修饰 2.作用位点： 丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸是主要的磷酸化氨基酸,大多数 磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是 可变的。
３.实例(MＡＰK途径): 分裂原活化的蛋白激酶（MAPK)、分裂原活化的蛋白激酶的激酶（MＡＰＫK)、分裂原活化的蛋白激酶的激酶之激酶(MAＰKＫK)。在真核细胞中，这3种类型的激酶构成一个MAPＫ级联系统(MAＰK casｃade），通过ＭAPＫＫK-MAPＫK－ＭAＰＫ逐级磷酸化，将外来信号级联放大并传递下去。 具体过程如下： ?MＡPKKＫ位于级联系统的最上游,能够通过胁迫信号感受器或者信号分子的受体，或者其本身就直接感受胞外信号刺激而发生磷酸化?ＭAPKKK磷酸化后变为活化状态,可以使MAＰKK磷酸化 ?ＭAPKＫ始终存在于细胞质中，MAPKK磷酸化以后通过双重磷酸化作用将ＭAＰK激活 ?MAＰK被磷酸化后有3种可能的去向: (1）停留在细胞质中,激活一系列其它的蛋白激酶 (2)在细胞质中使细胞骨架成分磷酸化 (3)进入细胞核,通过磷酸化转录因子，调控基因的表达
大豆蛋白纤维
大豆纤维的探究及应用 院系：外语系 学号：201313060124 姓名：司淼
目录 大豆纤维 大豆纤维释义 大豆纤维简介 大豆蛋白纤维 大豆纤维纱线 大豆纤维的面料 大豆纤维染整 大豆纤维服饰 大豆纤维衣服正确洗涤方法
大豆纤维释义 1. Soy Fiber 属于膳食纤维，在减肥过程中可以产生饱足感，而减少食物的摄取，但它们会干扰其他营养素的吸收，因此不建议单独食用。 2. SB=soybean SB=soybean 大豆纤维 3. soybean fibers soybean fibers大豆纤维 大豆纤维简介 大豆蛋白纤维属于再生植物蛋白纤维类，是以榨过油的大豆豆粕为原料，利用生物工程技术，提取出豆粕中的球蛋白，通过添加功能性助剂，与腈基、羟基等高聚物接枝、共聚、共混，制成一定浓度的蛋白质纺丝液，改变蛋白质空间结构，经湿法纺丝而成. 其有着羊绒般的柔软手感，蚕丝般的柔和光泽，棉的保暖性和良好的亲肤性等优良性能，还有明显的抑菌功能，被誉为“新世纪的健康舒适纤维”。 经过工业化规模生产，大豆纤维从纺纱到织造到染整的相关生产技术均已相对成熟，其价格已从初期的每吨7万多元，降至3.5万元左右，已被下游应用企业所认可，产业链结构也逐步形成． 大豆纤维是以脱去油脂的大豆豆粕作原料，提取植物球蛋白经合成后制成的新型再生植物蛋白纤维，是由我国纺织科技工作者自主开发，并在国际上率先实现了工业化生产的高新技术，也是迄今为止我国获得的唯一完全知识产权的纤维发明。 在成为纤维之前，要从大豆中提取蛋白质与高聚物为原料，采用生物工程等高新技术处理，经湿法纺丝而成。这种单丝，细度细、比重轻、强伸度高、耐酸耐碱性强、吸湿导湿性好。有着羊绒般的柔软手感，蚕丝般的柔和光泽，棉的保暖性和良好的亲肤性等优良性能，还有明显的抑菌功能，被誉为“新世纪的健康舒适纤维”。 以50％以上的大豆纤维与羊绒混纺成高支纱，用于生产春、秋、冬季的薄型绒衫，其效果与纯羊绒一样滑糯、轻盈、柔软，能保留精纺面料的光泽和细腻感，增加滑糯手感，也是生产轻薄柔软型高级西装和大衣的理想面料。 用大豆纤维与真丝交织或与绢丝混纺制成的面料，既能保持丝绸亮泽、飘逸的特点，又能改善其悬垂性，消除产生汗渍及吸湿后贴肤的特点，是制作睡衣、衬衫、晚礼服等高档服装的理想面料。 此外，大豆纤维与亚麻等麻纤维混纺，是制作功能性内衣及夏季服装的理想面料；与棉混纺的高支纱，是制造高档衬衫、高级寝卧具的理想材料；或者加入少量氨纶，手感柔软舒适，用于制作T恤、内衣、沙滩装、休闲服、运动服、时尚女装等，极具休闲风格。 大豆蛋白纤维是由华康集团董事长李官奇先生历经十年研究开发成功，获得世界发明专利金奖，李官奇先生的这项发明为纺织业带来了一场新的革命，在纤维材料发展史上和人造
组蛋白翻译后修饰的类型
组蛋白翻译后修饰的类型 组蛋白和组蛋白翻译后修饰通过影响染色质的结构来调控基因的表达，目前已成为表观遗传学研究的焦点之一。 染色质是一系列核小体相互连接成的念珠状结构。核小体的核心是由组蛋白H2A 、H2B、H3 、H4各两个分子构成的八聚体, 在八聚体的表面缠绕有圈的双螺旋DNA。相邻的两个核小体之间由DNA连接, 称为纤丝(fiber), 在纤丝部位结合有组蛋白分子H1。在组蛋白H1存在时,核小体之间紧密接触,形成直径为10nm的纤维状结构。这就是染色体构型变化的一级结构。在染色质中, DNA 和组蛋白是染色质的稳定成分,组蛋白与DNA的含量之比接近 1∶1 。组蛋白是染色质的主要蛋白质成分,通过带正电荷的氨基末端区域与带负电荷的DNA骨架相互作用, 对基因的表达有重要调控作用。 染色体活性调控的一个重要的机制是组蛋白的可逆共价修饰，通常容易发生在组蛋白 H3和H4的N端尾部，组蛋白H2A和H2B的N和C末端，包括甲基化，乙酰化，磷酸化，ADP-核糖基化，泛素化和小分子类泛素化修饰，这些翻译后修饰可改变组蛋白与DNA之间的相互作用，影响调控复合物与染色质结合的能力及染色质重塑，进而影响着细胞的多种功能。 ⒈甲基化 组蛋白甲基化是由组蛋白甲基化转移酶（histonemethyltransferase，HMT）完成的。甲基化可发生在组蛋白的赖氨酸和精氨酸残基上，而且赖氨酸残基能够发生单、双、三甲基化，而精氨酸残基能够单、双甲基化，这些不同程度的甲基化极大地增加了组蛋白修饰和调节基因表达的复杂性。甲基化的作用位点在赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）的侧链N原子上。组蛋白H3的第4、9、27和36位，H4的第20位Lys，H3的第2、l7、26位及H4的第3位Arg都是甲基化的常见位点。研究表明·，组蛋白精氨酸甲基化是一种相对动态的标记，精氨酸甲基化与基因激活相关，而H3和H4精氨酸的甲基化丢失与基因沉默相关。相反，赖氨酸甲基化似乎是基因表达调控中一种较为稳定的标记。例如，H3第4位的赖氨酸残基甲基化与基因激活相关，而第9位和第27位赖氨酸甲基化与基因沉默相关。此外，H4—K20的甲基化与基因沉默相关，H3—K36和H3—K79的甲基化与基因激活有关。但应当注意的是，甲基化个数与基因沉默和激活的程度相关。 ⒉乙酰化 组蛋白乙酰化主要发生在H3、H4的N端比较保守的赖氨酸位置上，是由组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶协调进行。组蛋白乙酰化呈多样性，核小体上有多个位点可提供乙酰化位点，但特定基因部位的组蛋白乙酰化和去乙酰化是以一种非随机的、位置特异的方式进行。乙酰化可能通过对组蛋白电荷以及相互作用蛋白的影响，来调节基因转录。早期对染色质及其特征性组分进行归类划分时就有人总结指出：异染色质结构域组蛋白呈低乙酰化，常染色质结构域组蛋白呈高乙酰化。最近有研究发现，某些HAT复合物含有一些常见的转录因子，某些HDAC复合物含有已被证实的阻遏蛋白。这些发现支持了高乙酰化与激活基因表达、低乙酰化与抑制基因表达有关的看法。 3.磷酸化 组蛋白H3在有丝分裂过程中，两个丝氨酸残基Ser10和Ser28发生了磷酸化作用。Ser10磷酸化组蛋白H3首先出现在G2晚期的核周缘，Ser28磷酸化组蛋白H3紧随其后出现，两个位点的磷酸化在中期到达高峰，并扩展到染色体的所有部分。当细胞有丝分裂进入后期和末期，组蛋白H3Ser28的磷酸化逐渐消退，而组蛋白H3Ser10磷酸化的荧光信号也逐渐从染色体上消失，此时在纺锤体中央部位出现Ser10磷酸化H3.研究结果表明，组蛋白H3Ser10和Ser28的磷酸化与细胞有丝分裂染色体的凝集和解凝集过程有着时间和空间上的相关性。Ser10和Ser28这两个位点发生磷酸化作用，可使组蛋白H3氨基末端的正电荷数降低，改变了组蛋白一DNA间的相互作用，这可能是导致染色质变构凝集的原因之一。根据激光共聚
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蛋白质结构预测和序列分析软件蛋白质数据库及蛋白质序列分析 第一节、蛋白质数据库介绍 一、蛋白质一级数据库 1、 SWISS-PROT 数据库 SWISS-PROT和PIR是国际上二个主要的蛋白质序列数据 库，目前这二个数据库在EMBL和GenBank数据库上均建 立了镜像 (mirror) 站点。 SWISS-PROT数据库包括了从EMBL翻译而来的蛋白质序 列，这些序列经过检验和注释。该数据库主要由日内瓦大 学医学生物化学系和欧洲生物信息学研究所(EBI)合作维 护。SWISS-PROT的序列数量呈直线增长。 2、TrEMBL数据库： SWISS-PROT的数据存在一个滞后问题，即 进行注释需要时间。一大批含有开放阅读 了解决这一问题，TrEMBL(Translated E 白质数据库，它包括了所有EMBL库中的 质序列数据源，但这势必导致其注释质量 3、PIR数据库： PIR数据库的数据最初是由美国国家生物医学研究基金 会（National Biomedical Research Foundation, NBRF） 收集的蛋白质序列，主要翻译自GenBank的DNA序列。 1988年，美国的NBRF、日本的JIPID（the Japanese International Protein Sequence Database日本国家蛋 白质信息数据库）、德国的MIPS（Munich Information Centre for Protein Sequences摹尼黑蛋白质序列信息 中心）合作，共同收集和维护PIR数据库。PIR根据注释 程度(质量)分为4个等级。 4、 ExPASy数据库： 目前，瑞士生物信息学研究所（Swiss I 质分析专家系统（Expert protein anal 据库。 网址：https://www.wendangku.net/doc/5714833267.html, 我国的北京大学生物信息中心(www.cbi.
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蛋白翻译后修饰（齐以涛老师） 上课老师没说重点 1.蛋白的概念：由许多氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合 物。 2.蛋白后修饰概念和意义（PPT4-5） 3.蛋白后修饰种类 1. 切除加工 2. 糖基化 3. 羟基化 4. 甲基化 5. 磷酸化 6. 乙酰化 7. 泛素化 8. 类泛素化 9. … 200. … 磷酸化修饰 1.概念： 磷酸化是通过蛋白质磷酸化激酶将ATP的磷酸基转移到蛋 白的特定位点上的过程。大部分细胞过程实际上是被可逆 的蛋白磷酸化所调控的，至少有30%的蛋白被磷酸化修饰
2.作用位点： 丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸是主要的磷酸化氨基酸，大多数 磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是 可变的。 3.实例(MAPK途径)： 分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）、分裂原活化的蛋白激酶的激酶（MAPKK）、分裂原活化的蛋白激酶的激酶之激酶（MAPKKK）。 在真核细胞中，这3种类型的激酶构成一个MAPK级联系统（MAPK cascade），通过MAPKKK-MAPKK-MAPK逐级磷酸化，将外来信号级联放大并传递下去。 具体过程如下： ?MAPKKK位于级联系统的最上游，能够通过胁迫信号感受器或者信号分子的受体，或者其本身就直接感受胞外信号刺激而发生磷酸化?MAPKKK磷酸化后变为活化状态，可以使MAPKK磷酸化?MAPKK始终存在于细胞质中，MAPKK磷酸化以后通过双重磷酸化作用将MAPK激活
?MAPK被磷酸化后有3种可能的去向： （1）停留在细胞质中，激活一系列其它的蛋白激酶 （2）在细胞质中使细胞骨架成分磷酸化 （3）进入细胞核，通过磷酸化转录因子，调控基因的表达 4.功能和意义: 一：调节酶蛋白及生理代谢 ①糖分解代谢中糖原磷酸化酶活性的调节，被磷酸化的酶具有活 性，去磷酸化的酶无活性 ②磷酸化或去磷酸化使胞内已存在酶的活性被激活或失活，调节 胞内活性酶的含量 二:调节转录因子活性 转录因子通常包含DNA结合结构域和转录激活结构域.转录因子在转录激活结构域或调控结构域发生磷酸化，直接影响其转录活性. c-Jun转录激活结构域的两个丝氨酸残基磷酸化，正调控c-Jun的转录活性. 三：调节转录因子核转位 ?TGF-b与其I型、II型受体结合，结合后的TGF-b I型受体识别R-Smad包括Smad2和Smad3，作用于C末端的丝氨酸使其磷酸化而被激活，激活后的R-Smad与Smad4结合转入细胞核内，发挥转录调节活性 ?NF-kB与其抑制因子IkB形成复合体时存在于胞质。当IkB磷酸化、
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当网络不是很畅通时或并不急于得到较多数量的蛋白质序列时，可采用EMAIL方式进行序列检索。? 蛋白质基本性质分析? 蛋白质序列的基本性质分析是蛋白质序列分析的基本方面，一般包括蛋白质的氨基酸组成，分子质量，等电点，亲水性，和疏水性、信号肽，跨膜区及结构功能域的分析等到。蛋白质的很多功能特征可直接由分析其序列而获得。例如，疏水性图谱可通知来预测跨膜螺旋。同时，也有很多短片段被细胞用来将目的蛋白质向特定细胞器进行转移的靶标（其中最典型的例子是在羧基端含有KDEL序列特征的蛋白质将被引向内质网。WEB中有很多此类资源用于帮助预测蛋白质的功能。? 疏水性分析? 位于ExPASy的ProtScale程序（?）可被用来计算蛋白质的疏水性图谱。该网站充许用户计算蛋白质的50余种不同属性，并为每一种氨基酸输出相应的分值。输入的数据可为蛋白质序列或SWISSPROT数据库的序列接受号。需要调整的只是计算窗口的大小（n）该参数用于估计每种氨基酸残基的平均显示尺度。? 进行蛋白质的亲/疏水性分析时，也可用一些windows下的软件如，bioedit,dnamana等。? 跨膜区分析? 有多种预测跨膜螺旋的方法，最简单的是直接，观察以20个氨基酸为单位的疏水性氨基酸残基的分布区域，但同时还有多种更加复杂的、精确的算法能够预测跨膜螺旋的具体位置和它们的膜向性。这些技术主要是基于对已知
蛋白质结构预测方法综述
蛋白质结构预测方法综述 卜东波陈翔王志勇 《计算机不能做什么？》是一本好书，其中文版序言也堪称佳构。在这篇十余页的短文中，马希文教授总结了使用计算机解决实际问题的三步曲，即首先进行形式化，将领域相关的实际问题抽象转化成一个数学问题；然后分析问题的可计算性；最后进行算法设计，分析算法的时间和空间复杂度，寻找最优算法。 蛋白质空间结构预测是很有生物学意义的问题，迄今亦有很多的工作。有意思的是，其中一些典型工作恰恰是上述三步曲的绝好示例，本文即沿着这一路线作一总结，介绍于后。 1 背景知识 生物细胞种有许多蛋白质（由20余种氨基酸所形成的长链），这些大分子对于完成生物功能是至关重要的。蛋白质的空间结构往往决定了其功能，因此，如何揭示蛋白质的结构是非常重要的工作。 生物学界常常将蛋白质的结构分为4个层次：一级结构，也就是组成蛋白质的氨基酸序列；二级结构，即骨架原子间的相互作用形成的局部结构，比如alpha螺旋,beta片层和loop区等；三级结构，即二级结构在更大范围内的堆积形成的空间结构；四级结构主要描述不同亚基之间的相互作用。 经过多年努力，结构测定的实验方法得到了很好的发展，比较常用的有核磁共振和X光晶体衍射两种。然而由于实验测定比较耗时和昂贵，对于某些不易结晶的蛋白质来说不适用。相比之下，测定蛋白质氨基酸序列则比较容易。因此如果能够从一级序列推断出空间结构则是非常有意义的工作。这也就是下面的蛋白质折叠问题： 1蛋白质折叠问题（Protein Folding Problem） 输入: 蛋白质的氨基酸序列
输出: 蛋白质的空间结构 蛋白质结构预测的可行性是有坚实依据的。因为一般而言，蛋白质的空间结构是由其一级结构确定的。生化实验表明：如果在体外无任何其他物质存在的条件下，使得蛋白质去折叠，然后复性，蛋白质将立刻重新折叠回原来的空间结构，整个过程在不到1秒种内即可完成。因此有理由认为对于大部分蛋白质而言，其空间结构信息已经完全蕴涵于氨基酸序列中。从物理学的角度讲，系统的稳定状态通常是能量最小的状态，这也是蛋白质预测工作的理论基础。 2 蛋白质结构预测方法 蛋白质结构预测的方法可以分为三种： 同源性（Homology ）方法：这类方法的理论依据是如果两个蛋白质的序列比较相似，则其结构也有很大可能比较相似。有工作表明，如果序列相似性高于75％，则可以使用这种方法进行粗略的预测。这类方法的优点是准确度高，缺点是只能处理和模板库中蛋白质序列相似性较高的情况。 从头计算（Ab initio ） 方法：这类方法的依据是热力学理论，即求蛋白质能量最小的状态。生物学家和物理学家等认为从原理上讲这是影响蛋白质结构的本质因素。然而由于巨大的计算量，这种方法并不实用，目前只能计算几个氨基酸形成的结构。IBM 开发的Blue Gene 超级计算机，就是要解决这个问题。 穿线法(Threading )方法：由于Ab Initio 方法目前只有理论上的意义，Homology 方法受限于待求蛋白质必需和已知模板库中某个蛋白质有较高的序列相似性，对于其他大部分蛋白质来说，有必要寻求新的方法。Threading 就此应运而生。 以上三种方法中，Ab Initio 方法不依赖于已知结构，其余两种则需要已知结构的协助。通常将蛋白质序列和其真实三级结构组织成模板库，待预测三级结构的蛋白质序列，则称之为查询序列(query sequence)。 3 蛋白质结构预测的Threading 方法 Threading 方法有三个代表性的工作：Eisenburg 基于环境串的工作、Xu Ying 的Prospetor 和Xu Jinbo 、Li Ming 的RAPTOR 。 Threading 的方法：首先取出一条模版和查询序列作序列比对(Alignment)，并将模版蛋白质与查询序列匹配上的残基的空间坐标赋给查询序列上相应的残基。比对的过程是在我们设计的一个能量函数指导下进行的。根据比对结果和得到的查询序列的空间坐标，通过我们设计的能量函数，得到一个能量值。将这个操作应用到所有的模版上，取能量值最低的那条模版产生的查询序列的空间坐标为我们的预测结果。 需要指出的是，此处的能量函数却不再是热力学意义上的能量函数。它实质上是概率的负对数，即 ，我们用统计意义上的能量来代替真实的分子能量，这两者有大致相同的形式。 p E log ?=如果沿着马希文教授的观点看上述工作 ，则更有意思：Eisenburg 指出如果仅仅停留在简单地使用每个原子的空间坐标(x,y,z)来形式化表示蛋白质空间结构，则难以进一步深入研究。Eisenburg 创造性地使用环境串表示结构，从而将结构预测问题转化成序列串和环境串之间的比对问题；其后，Xu Ying 作了进一步发展，将蛋白质序列表示成一系列核（core ）组成的序列，Core 和Core 之间存在相互作用。因此结构就表示成Core 的空间坐标，以及Core 之间的相互作用。在这种表示方法的基础上，Xu Ying 开发了一种求最优匹配的动态规划算法，得到了很好的结果。但是由于其较高的复杂度，在Prospetor2上不得不作了一些简化；Xu Jinbo 和Li Ming 很漂亮地解决了这个问题，将求最优匹配的过程表示成一个整数规划问题，并且证明了一些常用
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蛋白质结构预测网址 物理性质预测： Compute PI/MW Peptidemass TGREASE SAPS 基于组成的蛋白质识别预测 AACompIdent PROPSEARCH 二级结构和折叠类预测 nnpredict Predictprotein SSPRED 特殊结构或结构预测 COILS MacStripe 与核酸序列一样，蛋白质序列的检索往往是进行相关分析的第一步，由于数据库和网络技校术的发展，蛋白序列的检索是十分方便，将蛋白质序列数据库下载到本地检索和通过国际互联网进行检索均是可行的。 由NCBI检索蛋白质序列 可联网到：“”进行检索。 利用SRS系统从EMBL检索蛋白质序列 联网到：”，可利用EMBL的SRS系统进行蛋白质序列的检索。 通过EMAIL进行序列检索 当网络不是很畅通时或并不急于得到较多数量的蛋白质序列时，可采用EMAIL方式进行序列检索。 蛋白质基本性质分析 蛋白质序列的基本性质分析是蛋白质序列分析的基本方面，一般包括蛋白质的氨基酸组成，分子质量，等电点，亲水性，和疏水性、信号肽，跨膜区及结构功能域的分析等到。蛋白质的很多功能特征可直接由分析其序列而获得。例如，疏水性图谱可通知来预测跨膜螺旋。同时，也有很多短片段被细胞用来将目的蛋白质向特定细胞器进行转移的靶标（其中最典型的例子是在羧基端含有KDEL序列特征的蛋白质将被引向内质网。WEB中有很多此类资源用于帮助预测蛋白质的功能。 疏水性分析 位于ExPASy的ProtScale程序（）可被用来计算蛋白质的疏水性图谱。该网站充许用户计算蛋白质的50余种不同属性，并为每一种氨基酸输出相应的分值。输入的数据可为蛋白质序列或SWISSPROT数据库的序列接受号。需要调整的只是计算窗口的大小（n）该参数用于估计每种氨基酸残基的平均显示尺度。 进行蛋白质的亲/疏水性分析时，也可用一些windows下的软件如， bioedit,dnamana等。 跨膜区分析 有多种预测跨膜螺旋的方法，最简单的是直接，观察以20个氨基酸为单位的疏水性氨基酸残基的分布区域，但同时还有多种更加复杂的、精确的算法能够预测跨膜螺旋的具体位置和它们的膜向性。这些技术主要是基于对已知跨膜螺旋的研究而得到的。自然存在的跨膜螺旋Tmbase 数据库，可通过匿名FTP获得()，参见表一
蛋白质结构预测
实习 5 ：蛋白质结构预测 学号20090***** 姓名****** 专业年级生命生技**** 实验时间2012.6.21 提交报告时间2012.6.21 实验目的： 1.学会使用GOR和HNN方法预测蛋白质二级结构 2.学会使用SWISS-MODEL进行蛋白质高级结构预测 实验内容： 1.分别用GOR和HNN方法预测蛋白质序列的二级结构，并对比异同性。 2.利用SWISS-MODEL进行蛋白质的三级结构预测，并对预测结果进行解释。 作业： 1. 搜索一条你感兴趣的蛋白质序列，分别用GOR和HNN进行二级结构预测，解释预测结果，分析两个方法结果有何异同。 答：所选用蛋白质序列为>>gi|390408302|gb|AFL70986.1| gag protein, partial [Human immunodeficiency virus] （1）GOR预测结果： 图1 图1是每个氨基酸在序列中所处的状态，可以看出序列的二级结构预测结果为： 1到9位个氨基酸为无规卷曲，10到33位氨基酸为α螺旋,34到37位为β折叠，38到45位为无规卷曲，46到49位为α螺旋，50到53位为无规卷曲，54到65为α螺旋，66到72位为无规卷曲，73到95位为α螺旋，96到101位为无规卷曲，102到108为β折叠，109到115位为无规卷曲，117位为β折叠。 图2 图2为各种结构在序列中所占的比例，其中Alpha helix占53.85%，Extended strand占11.11%，Random coil占35.04%，无他二级结构。
图3 图3为各个氨基酸在序列中的状态以及二级结构在全序列中二级结构分布情况。 （2）HNN预测： 图4 图4是每个氨基酸在序列中所处的状态，可以看出序列的二级结构预测结果为： 1到6位个氨基酸为无规卷曲，7到34位氨基酸为α螺旋,35到37位为β折叠，38位为α螺旋，39到44位为无规卷曲，45到49位为α螺旋，50到55位为无规卷曲，56到65为α螺旋，66到71位为无规卷曲，72到83位为α螺旋，84到86位为无规卷曲，87到95位为α螺旋，96到102为无规卷曲，103到108位为β折叠，108到117位为无规卷曲。 图5 图5为各种结构在序列中所占的比例，其中Alpha helix占55.56%，Extended strand占7.69%，Random coil占36.75%，无他二级结构。
蛋白质功能-结构-相互作用预测网站工具合集
蛋白质组学 蛋白质是生物体的重要组成部分，参与几乎所有生理和细胞代谢过程。此外，与基因组学和转录组学比较，对一个细胞或组织中表达的所有蛋白质，及其修饰和相互作用的大规模研究称为蛋白质组学。 蛋白质组学通常被认为是在基因组学和转录组学之后，生物系统研究的下一步。然而，蛋白质组的研究远比基因组学复杂，这是由于蛋白质内在的复杂特点，如蛋白质各种各样的翻译后修饰所决定的。并且，研究基因组学的技术要比研究蛋白质组学的技术强得多，虽然在蛋白质组学研究中，质谱技术的研究已取得了一些进展。 尽管存在方法上的挑战，蛋白质组学正在迅速发展，并且对癌症的临床诊断和疾病治疗做出了重要贡献。几项研究鉴定出了一些蛋白质在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和食道癌中表达变化。例如，通过蛋白质组学技术，人们可以在患者血液中明确鉴定出肿瘤标志物。表1列出了更多的蛋白质组学技术用于研究癌症的例子。 另外，高尔基体功能复杂。最新研究表明，它除了参与蛋白加工外，还能参与细胞分化及细胞间信号传导的过程，并在凋亡中扮演重要角色，其功能障碍也许和肿瘤的发生、发展有某种联系。根据人类基因组研究，约1000多种人类高尔基体蛋白质中仅有500~600种得到了鉴定，建立一条关于高尔基体蛋白质组成的技术路线将有助于其功能的深入研究。 蛋白质组学是一种有效的研究方法，特别是随着亚细胞器蛋白质组学技术的迅猛发展，使高尔基体的全面研究变为可能。因此研究人员希望能以胃癌细胞中的高尔基体为研究对象，通过亚细胞器蛋白质组学方法，建立胃癌细胞中高尔基体的蛋白质组方法学。 研究人员采用蔗糖密度梯度的超速离心方法分离纯化高尔基体，双向凝胶电泳（2-DE）分离高尔基体蛋白质，用ImageMaster 2D软件分析所得图谱，基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定蛋白质点等一系列亚细胞器蛋白质组学方法建立了胃癌细胞内高尔基体的蛋白图谱。 最后，人们根据分离出的纯度较高的高尔基体建立了分辨率和重复性均较好的双向电泳图谱，运用质谱技术鉴定出12个蛋白质，包括蛋白合成相关蛋白、膜融合蛋白、调节蛋白、凋亡相关蛋白、运输蛋白和细胞增殖分化相关蛋白。通过亚细胞器分离纯化、双向电泳的蛋白分离及MALDI-TOF MS蛋白鉴定分析，研究人员首次成功建立了胃癌细胞SGC7901中高尔基体的蛋白质组学技术路线。 3.1 蛋白质功能预测工具 也许生物信息学方法在癌症研究中最常用的就是基因功能预测方法，但是这些数据库只存储了基因组的大约一半基因的功能。为了在微阵列资料基础上完成功能性的富集分析，基因簇的功能注解是非常重要的。近几年生物学家研发了一些基因功能预测的方法，这些方法旨在超越传统的BLAST搜索来预测基因的功能。基因功能预测可以以氨基酸序列、三级结构、与之相互作用的配体、相互作用过程或基因的表达方式为基础。其中最重要的是基于氨基酸序列的分析，因为这种方法适合于微阵列分析的全部基因。 在表3中，前三项列举了三种同源搜索方法。FASTA方法虽然应用还不太广泛，但它要优于BLAST，或者至少相当。FASTA程序是第一个使用的数据库相似性搜索程序。为了达到较高的敏感程度，程序引用取代矩阵实行局部比对以获得最佳搜索。美国弗吉尼亚大学可以提供这项程序的地方版本，当然数据库搜索结果依赖于要搜索的数据库序列。如果最近的序列数据库版本在弗吉尼亚大学不能获得，那么就最好试一下京都大学（Kyoto University）的KEGG站点。PSI-BLAST（位点特异性反复BLAST）是BLAST的转化版本，PSI-BLAST的特色是每次用profile 搜索数据库后再利用搜索的结果重新构建profile，然后用新的profile再次搜索数据库，如此反复直至没有新的结果产生为止。PSI-BLAST先用带空位的BLAST搜索数据库，将获得的序列通过多序列比对来构建第一个profile。PSI-BLAST自然地拓展了BLAST方法，能寻找蛋白质序列中的隐含模式，有研究表明这种方法可以有效地找到很多序列差异较大而结构功能相似的相关蛋白，所以它比BLAST和FASTA有更好的敏感性。PSI-BLAST服务可以
蛋白质结构与功能的生物信息学研究
实验名称：蛋白质结构与功能的生物信息学研究 实验目的：1.掌握运用BLAST工具对指定蛋白质的氨基酸序列同源性搜索的方法。 2.掌握用不同的工具分析蛋白质的氨基酸序列的基本性质 3掌握蛋白质的氨基酸序列进行三维结构的分析 4.熟悉对蛋白质的氨基酸序列所代表蛋白的修饰情况、所参与的 代谢途径、相互作用的蛋白，以及与疾病的相关性的分析。实验方法和流程： 一、同源性搜索 同源性从分子水平讲则是指两个核酸分子的核苷酸序列或两个蛋白质分子的氨基酸序列间的相似程度。BLAST工具能对生物不同蛋白质的氨基酸序列或不同的基因的DNA序列极性比对，并从相应数据库中找到相同或相似序列。对指定的蛋白质的氨基酸序列进行同源性搜索步骤如下： ↓ 登录网址https://www.wendangku.net/doc/5714833267.html,/blast/ ↓ 输入序列后,运行blast工具 ↓ 序列比对的图形结果显示
序列比对的图形结果：用相似性区段（Hit）覆盖输入序列的范围判断两个序列 的相似性。如果图形中包含低得分的颜色（主要是红色） 区段，表明两序列的并非完全匹配。 ↓ 匹配序列列表及得分
各序列得分 可选择不同的比对工具 备注: Clustal是一款用来对()的软件。可以用来发现特征序列，进行蛋白分类，证明序列间的同源性，帮助预测新序列二级结构与三级结构，确定PCR引物，以及 在分子进化分析方面均有很大帮助。Clustal包括Clustalx和Clustalw(前者是 图形化界面版本后者是命令界面)，是生物信息学常用的多序列比对工具。 该序列的比对结果有100条，按得分降序排列，其中最大得分2373，最小得分 分为1195. ↓ 详细的比对序列的排列情况 第一个匹配 序列 第一个序列的匹配率为100% Score表示打分矩阵计算出来的值，由搜索算法决定的，值越大说明匹配程度
第5章-蛋白质翻译后修饰
Chapter V Chapter V Post‐translational Modification Of Proteins
One gene more proteins One gene, more proteins https://www.wendangku.net/doc/5714833267.html,
?蛋白质翻译后修饰（PTM）是指蛋白质在翻译中或翻译后经历的个共价加工过程，即通过1个或几个氨基酸残基加上修饰的一个 基团或通过蛋白质水解剪去基团而改变蛋白质的性质。 ?从定义的角度，可以如下理解蛋白质翻译后修饰： 1. 对某氨基酸的修饰包括共价连接简单的官能团（如乙酰基或磷酸基） 1对某一氨基酸的修饰包括 和引入一些复杂结构，如脂类和糖类。 2. 将已经结束翻译的转录本产物切割成成熟的形式，如信号肽或活性肽的 加 工等。 3. 氨基酸的交联，如丝氨酸和酪氨酸。
?可以说，蛋白质组中任一蛋白质都能在翻译时或翻译后进行修饰。不同类型的修饰都会影响蛋白质的电荷状态、疏水性、构饰不同类型的修饰都会影响蛋白质的 象和（或）稳定性，最终影响其功能。 ?诸多实例表明蛋白质的修饰都采取一种可逆模式‐“开”或“关” 的状态行或者调节蛋白质的功能或者作为个真实的分的状态进行，或者调节蛋白质的功能，或者作为一个真实的分子开关。 ?目前已发现300多种不同的翻译后修饰，主要形式包括磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化、羧基化、核糖基化以及二硫键的配对等。 等
?加入官能团 乙酰化—通常于蛋白质的N末端加入乙酰。 磷酸化—加入磷酸根至Ser、Tyr、Thr或His。 糖化—将糖基加入Asn、羟离氨酸、Ser或Thr，形成糖蛋白。 烷基化加入如甲基或乙基等烷基。 — 甲基化—烷基化中常见的一种，在Lys、Arg等的侧链氨基上加入甲基。 生物素化—主要有组蛋白的生物素酰化修饰，由羧化全酶合成酶与组蛋白直接相互作用完成，以及生物素附加物令赖氨酸残基酰化。 以及生物素附加物令赖氨酸残基酰化 谷氨酸化—谷氨酸与导管素及其他蛋白质之间建立共价键。 甘氨酸化—一个至超过40种甘氨酸与导管素的C末端建立共价键。 异戊二烯化—加入如法呢醇及四异戊二烯等异戊二烯。 硫辛酸化—附着硫辛酸的功能性。 磷酸泛酰巯基乙胺基化—像在脂肪酸、聚酮、非核糖体肽链及白氨酸的生物合 聚酮 成中，从乙酰辅酶A加入4‘磷酸泛酰巯基乙胺基。 硫酸化—将硫酸根加入至酪氨酸。 硒化 C末端酰胺化 ‐‐‐‐‐‐‐‐
蛋白质结构与功能的关系
蛋白质结构与功能的关系 专业：植物学 摘要：蛋白质特定的功能都是由其特定的构象所决定的，各种蛋白质特定的构象又与其一级结构密切相关。天然蛋白质的构象一旦发生变化，必然会影响到它的生物活性。由于蛋白质的构象的变化引起蛋白质功能变化，可能导致蛋白质构象紊乱症，当然也能引起生物体对环境的适应性增强。而分子模拟技术为蛋白质的研究提供了一种崭新的手段。在理论上解决了结构预测和功能分析以及蛋白质工程实施方面所面临的难题。它在蛋白质的结构预测和模建工作中占有举足轻重的地位，实现了生物技术与计算机技术的完美结合。 关键词：蛋白质的结构、功能；折叠/功能关系；蛋白质构象紊乱症；分子模拟技术；同源建模 RNase是由124个氨基酸残基组成的单肽链，分子中 8 个Cys的-SH构成4对二硫键，形成具有一定空间构象的蛋白质分子。在蛋白质变性剂和一些还原剂存在下，酶分子中的二硫键全部被还原，酶的空间结构破坏，肽链完全伸展，酶的催化活性完全丧失。当用透析的方法除去变性剂和巯基乙醇后，发现酶大部分活性恢复，所有的二硫键准确无误地恢复原来状态。若用其他的方法改变分子中二硫键的配对方式，酶完全丧失活性。这个实验表明，蛋白质的一级结构决定它的空间结构，而特定的空间结构是蛋白质具有生物活性的保证。前体与活性蛋白质一级结构的关系，由108个氨基酸残基构成的前胰岛素原，在合成的时候完全没有活性，当切去N-端的24个氨基酸信号肽，形成84个氨基酸的胰岛素原，胰岛素原也没活性，在包装分泌时，A、B链之间的33个氨基酸残基被切除，才形成具有活性的胰岛素。 功能不同的蛋白质总是有着不同的序列；种属来源不同而功能相同的蛋白质的一级结构，可能有某些差异，但与功能相关的结构也总是相同。若一级结构变化，蛋白质的功能可能发生很大的变化。蛋白质特定的功能都是由其特定的构象所决定的，各种蛋白质特定的构象又与其一级结构密切相关。天然蛋白质的构象一旦发生变化，必然会影响到它的生物活性。由于蛋白质的构象的变化引起蛋白质功能变化，可能导致蛋白质构象紊乱症，当然也能引起生物体对环境的适应性增强。 虽然蛋白质结构与生物功能的关系比序列与功能的关系更加紧密，但结构与功能的这种关联亦若隐若现，并不能排除折叠差别悬殊的蛋白质执行相似的功能，折叠相似的蛋白质执行差别悬殊功能的现象的存在。无奈，该领域仍不得不将100多年前Fisher提出的“锁一钥
蛋白质结构与功能的关系
蛋白质结构与功能的关系 （The relationship between protein structure and function） 摘要蛋白质特定的功能都是由其特定的构象所决定的，各种蛋白质特定的构象又与其一级结构密切相关。天然蛋白质的构象一旦发生变化，必然会影响到它的生物活性。由于蛋白质的构象的变化引起蛋白质功能变化，可能导致蛋白质构象紊乱症，当然也能引起生物体对环境的适应性增强！现而今关于蛋白质功能研究还有待发展，一门新兴学科正在发展，血清蛋白组学，生物信息学等！本文仅就蛋白质结构与其功能关系进行粗略阐述。 关键词：蛋白质结构；折叠/功能关系；蛋白质构象紊乱症；分子伴侣 Keywords：protein structure；fold／function relationship；protein conformational disorder；molecular chaperons 虽然蛋白质结构与生物功能的关系比序列与功能的关系更加紧密，但结构与功能的这种关联亦若隐若现，并不能排除折叠差别悬殊的蛋白质执行相似的功能，折叠相似的蛋白质执行差别悬殊功能的现象的存在。无奈，该领域仍不得不将100多年前Fisher提出的“锁一钥匙”模型(“lock—key”model)和50多年前Koshand提出的诱导契合模型(induce fitmodel)作为蛋白质实现功能的理论基础。这2个略显粗糙的模型只是认为蛋白质执行功能的部位局限在结构中的一个或几个小区域内，此类区域通常是蛋白质表面上的凹洞或裂隙。这种凹洞或裂隙被称为“活性部位(active site)”或“别构部位（fallosteric site）”，凹陷部位与配体分子在空间形状和静电上互补。此外，在酶的活性部位中还存在着几个作为催化基团(catalyticgroup)的氨基酸残基。对蛋白质未来的研究应从实验基本数据的归纳和统计入手，从原始的水平上发现蛋白质的潜藏机制【1】。 蛋白质结构与功能关系的研究主要是以力求刻画蛋白质的3D结构的几何学为基础的。蛋白质结构既非规则的几何形，又非完全的无规线团(randomcoil)，而是有序(α一螺旋和β一折叠)与无序(线团或环域loop)的混合体。理解蛋白质3D结构的技巧是将结构简化，只保留某种几何特征或拓扑模式，并将其数字化。探求数字中所蕴含的规律，且根据这一规律将蛋白质进行分类，再将分类的结构与蛋白质的功能进行比较，以检验蛋白质抽象结构的合理性。如果一种对蛋白质结构的简化、比较和分类能与蛋自质的功能有较好地对应关系，那么这就是一种对蛋白质结构的有价值的理解。蛋白质结构中，多种弱力(氢键、范德华力、静电相互作用、疏水相互作用、堆积力等)和可逆的二硫键使多肽链折叠成特定的构象。从某种意义上说，共价键维系了蛋白质的一级结构；主链上的氢键维系了蛋白质的二级结构；而氨基酸侧链的相互作用和二硫桥维系着蛋白质的三级结构。亚基(subunit)内部的侧链相互作用是构象稳定的基础，蛋白质链之间的侧链的相互作用是亚基组装(四级结构)的基础，而蛋白质中侧链与配体基团问的相互作用是蛋白质行使功能的基础。 牛胰核糖核酸酶(RNase)变性和复性的实验是蛋白质结构与功能关系的很好例证。蛋白质空间结构遭到破坏；，可导致蛋白质的理比性质和生物学性质的变化，这就是蛋白质变性。变性的蛋白质，只要其一级结构仍然完好，可在一定条件下恢复其空间结构，随之理化性质和生物学性质也可重现，这被称为复性。RNase是由124个氨基酸残基组成的一条肽链，分子中8个半胱氨酸的巯基构成4对二硫键，进而形成具有一定空间构象的活性蛋白质。天然RNase遇尿素和β巯基乙醇时发生变性，其分子中的氢键和4个二硫键解开，严密的空间结构遭破坏，丧失了生物学活性，但一级结构完整无损。若去除尿素和β巯基乙醇，RNase又可恢复其原有构象和生物学活性。RNase分子中的8个巯基若随机排列成二硫键可有105种方式。有活性的RNase只是其中的一种，复性时之所以选择了自