应用qPCR方法检测中国近海塔玛亚历山大藻复合种的研究_高岩

第33卷第8期2013年8月

环境科学学报Acta Scientiae Circumstantiae

Vol．33，No．8Aug．，2013

基金项目：国家自然科学基金面上项目（No．41176100）；国家重点基础研究发展（973）计划项目（No．2010CB428705）；国家自然科学基金委创新研究群体基金项目（No．41121064）

Supported by the National Natural Science Foundation of China （No．41176100），the National Basic Research Program of China （No．2010CB428705）and the Innovation Research Group Program of Natural Science Foundation of China （No．41121064）

作者简介：高岩（1988—），女，博士研究生，E-mail ：gaoyan0109@mails．gucas．ac．cn ；*通讯作者（责任作者），E-mail ：rcyu@ms．qdio．ac．cn Biography ：GAO Yan （1988—），female ，Ph．D．candidate ，E-mail ：gaoyan0109@mails．gucas．ac．cn ；*Corresponding author ，E-mail ：rcyu@ms．qdio．ac．cn

高岩，于仁成，张清春，等．2013．应用qPCR 方法检测中国近海塔玛亚历山大藻复合种的研究［

J ］．环境科学学报，33（8）：2256-2263Gao Y ，Yu R C ，Zhang Q C ，et al ．2013．Application of qPCR method in detection of Alexandrium tamarense species complex in China ［J ］．Acta Scientiae Circumstantiae ，

33（8）：2256-2263应用qPCR 方法检测中国近海塔玛亚历山大藻复合种

的研究

高岩1，2，于仁成1，*，张清春1，周名江1

1．中国科学院海洋研究所海洋生态与环境科学重点实验室，青岛2660712．中国科学院大学，北京100049收稿日期：2012-11-30

修回日期：2013-03-13

录用日期：2013-03-13

摘要：亚历山大藻属的部分藻种（Alexandrium spp．）能够产生麻痹性贝毒毒素（PST ），是重要的有害藻华（HAB ）原因种．由于亚历山大藻属中的有毒和无毒藻种形态相似，且海水中亚历山大藻的细胞密度通常很低，因此，高灵敏度、高特异性的分子生物学方法在亚历山大藻检测方面具有重要的应用前景．塔玛亚历山大藻和链状亚历山大藻是中国近海主要的有毒亚历山大藻藻种，大多属于塔玛亚历山大藻复合种第四类核

糖体型（Group Ⅳ，

以往称为“亚洲温带核糖体型”）．因此，本研究尝试将实时荧光定量PCR （qPCR ）方法用于我国近海塔玛亚历山大藻复合种（Group Ⅳ）的快速检测，并对方法的特异性和灵敏度进行了检验．研究表明，所建立的qPCR 方法能够特异性地检测我国近海不同海域分离的

塔玛亚历山大藻复合种（Group Ⅳ），方法具有良好的线性响应关系和较高的灵敏度，最低可检出5个藻细胞，具有良好的应用前景．然而，实验也发现，自我国近海分离的塔玛亚历山大藻复合种的不同藻株之间，以及处于不同生长阶段的藻细胞之间，qPCR 检测结果存在显著差异，反映了目标藻核糖体RNA 基因拷贝数的差异和变化对qPCR 检测结果的影响．因此，建议在将qPCR 方法用于不同海域亚历山大藻样品检测时，应采用该海域分离的藻株专门构建标准工作曲线，以减小定量分析误差．关键词：亚历山大藻；有害藻华；实时荧光定量PCR 文章编号：0253-2468（2013）08-2256-08中图分类号：X835，X171．5

文献标识码：A

Application of qPCR method in detection of Alexandrium tamarense species

complex in China

GAO Yan 1，2，YU Rencheng 1，*

，ZHANG Qingchun 1，ZHOU Mingjiang 1

1．Key Laboratory of Marine Ecology and Environmental Sciences ，Institute of Oceanology ，Chinese Academy of Sciences ，Qingdao 2660712．University of Chinese Academy of Sciences ，Beijing 100049Received 30November 2012；

received in revised form 13March 2013；

accepted 13March 2013

Abstract ：Several species in genus Alexandrium can produce paralytic shellfish toxins （PST ），and are important causative species of harmful algal blooms．Due to the similarity in morphological features between toxic and non-toxic species and the relatively low cell abundance of toxic Alexandrium cells presented in water column ，molecular biological methods with high specificity and sensitivity have great potential in detecting toxic Alexandrium cells．A．tamarense and A．catenella are the two major toxic species presented in the coastal waters of China ，and most of the strains identified so far were assigned to the Group IV ribotype （previously named as “Temperate Asian ”ribotye ）of the A．tamarense species complex．In this study ，we developed a real-time quantitative PCR （qPCR ）method to detect the A．tamarense species complex （Group Ⅳ）in China．The method showed high specificity and sensitivity for the detection and quantification of A．tamarense species complex （Group Ⅳ）．The detection limit was as low as 5cells．However ，significant differences in quantitative results were noticed among different isolated strains of A．tamarense species complex as well as the cells collected at different growth stages．This reflected potential interference from the difference or variation of rRNA gene copy number in Alexandrium cells．Thus ，the strain of A．tamarense species complex isolated from a targeted area should be used to develop the standard calibration curve when applying the qPCR method in quantitative detection of A．tamarense species complex in the specific area．Keywords ：Alexandrium ；harmful algal bloom ；real-time quantitative PCR

8期高岩等：应用qPCR方法检测中国近海塔玛亚历山大藻复合种的研究

1引言（Introduction）

有害藻华（Harmful Algal Bloom，HAB）是近海常见的灾害性生态现象，能够通过不同途径危害人类健康和生态安全（Landberg，2002；Zingone et al．，2000）．亚历山大藻（Alexandrium）属中的部分藻种能够产生麻痹性贝毒（Paralytic Shellfish Toxins，PST），是一类重要的有害藻华原因种．在目前已知的30种亚历山大藻中，已证实能够产生毒素的有16种，其中，12种可产生麻痹性贝毒毒素（Anderson et al．，2012；Balech，1995）．水体中的亚历山大藻在被双壳贝类等滤食性动物摄食后，麻痹性贝毒会在动物体内累积，导致水产品消费者中毒，严重时甚至会导致死亡（Picot et al．，2011）．在全球范围内，因麻痹性贝毒导致的中毒事件分布最广、危害也最为突出，因此，亚历山大藻藻华问题受到了密切关注．

海水中亚历山大藻细胞的密度通常较低，即便在藻华期间，亚历山大藻也很少在浮游植物群落中占据优势．但亚历山大藻的危害效应非常突出，即使在102 103cells·L－1的低密度下，也有可能产生潜在的危害效应（GEOHAB，2001）．而且，亚历山大藻属中的部分有毒藻种和无毒藻种形态特征相似，甚至同一藻种也存在有毒和无毒藻株，仅依靠形态学特征难以鉴别．因此，在亚历山大藻藻华研究中，灵敏度高、特异性强的分子生物学方法近期得到了快速发展，并逐渐应用于亚历山大藻的藻华监测和研究中．其中，实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR）是一种很有前景的方法，已在欧洲、日本及美国近海的亚历山大藻藻华研究中得到应用（Dyhrman et al．，2006；Galluzzi et al．，2004；Hosoi-Tanabe et al．，2004），也被成功用于亚历山大藻孢囊的检测（Erdner et al．，2010；Kamikawa et al．，2007）．

亚历山大藻广泛分布于我国近海，目前已发现了塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）、链状亚历山大藻（A．catenella）、微小亚历山大藻（A．minutum）、相关亚历山大藻（A．affine）等藻种．近年来，有关我国近海亚历山大藻藻华的报道逐渐增多，自2002年以来，长江口及其邻近海域连续多年爆发亚历山大藻藻华，部分海域亚历山大藻细胞密度高达106cells·L－1．同时，贝类中也经常检测到PST毒素，中毒事件多次发生．2008年，因食用染毒杂色蛤，江苏连云港发生了七人中毒、一人死亡的中毒事件（庞中全，2009）；2010年，养殖池塘海水中的亚历山大藻引发了毛蚶（Scapharca subcrenata）中毒事件，造成14人中毒（赣榆县疾控中心，2010）；同年，香港发生了食用虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）引起的麻痹性贝毒中毒事件，共有28人出现中毒症状（广东省卫生厅，2010）．有毒亚历山大藻的藻华对我国沿海的海水养殖和水产品消费者的身体健康构成了巨大威胁．

塔玛亚历山大藻和链状亚历山大藻是我国近海最为常见的麻痹性贝毒产毒藻，这两种亚历山大藻与芬迪湾亚历山大藻（Alexandrium fundyense）的形态特征相似，核糖体RNA基因序列相近，因此，这3种亚历山大藻也被合称为塔玛亚历山大藻复合种（Alexandrium tamarense species complex）（Lily et al．，2007）．但在塔玛亚历山大藻复合种中，基于核糖体RNA基因序列划分的核糖体型与形态种却不能一一对应．以往研究表明，目前我国近海分离的塔玛亚历山大藻和链状亚历山大藻藻株大多属于塔玛亚历山大藻复合种第四类核糖体型（Group Ⅳ），或称亚洲温带核糖体型（Wang et al．，2008；唐祥海等，2006），可以采用相同的分子生物学方法进行检测．目前，针对塔玛亚历山大藻复合种（Group Ⅳ）已建立了荧光原位杂交方法（于仁成等，2006），并对海水中的亚历山大藻样品进行了检测．结果表明，该方法具有良好的定性鉴别能力，但在定量分析方面还有所欠缺．近年来，qPCR方法也开始应用于我国的有害藻华研究，目前已针对我国近海多种有害藻华原因种建立了qPCR检测方法（Yuan et al．，2012；石彦红等，2010；He et al．，2009；何闪英等，2007），并尝试将该方法应用于海水样品中东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）、米氏凯伦藻（Karenia mikimotoi）和中肋骨条藻（Skeletonema costatum）的检测，取得了良好的效果（Yuan et al．，2012）．然而，到目前为止，对我国近海亚历山大藻复合种的qPCR检测方法尚未见研究报道．因此，本研究针对我国近海的塔玛亚历山大藻复合种（Group Ⅳ），尝试将实时荧光定量PCR方法用于亚历山大藻的快速识别和计数，并对方法的特异性、灵敏度，以及影响qPCR结果准确性的因素进行分析和研究．

2材料与方法（Materials and methods）

2．1实验藻株及培养条件

实验所用藻株及其分离地如表1所示，实验中

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环境科学学报33卷

将分离自东海的链状亚历山大藻（ACDH藻株）作

为目标藻构建标准曲线，以其它藻株进行对比研究．

表1实验中采用的微藻及其核糖体RNA基因在GenBank数据库

的序列号

Table1Microalgal species used in the experiment and the GenBank

accession number for their rRNA gene

种名株系分离地LSU rRNA基因D1 D2区

Alexandrium catenella ACDH东海DQ176647 A．tamarense ATCI02南海DQ176650 A．tamarense ATCI03南海DQ176651 A．tamarense AT5-3南海DQ176649 A．tamarense ATHK南海DQ176652 A．tamarense AT-6欧洲DQ176655 A．minutum AM台湾地区DQ176657 A．minutum AM-LYG连云港

A．affine AC-1南海DQ176654 Skeletonema costatum SC-1胶州湾

所有实验藻株均在中国科学院海洋研究所海洋生态与环境科学重点实验室内保种培养，培养液采用f/2营养盐配方．培养用海水系取自青岛汇泉湾附近的自然海水，经过海洋所水族楼的海水处理系统过滤和消毒，pH值为7．9?0．1，盐度为30?1．进入实验室后首先以0．45μm混合纤维滤膜过滤，并煮沸灭菌，室温冷却后添加营养盐备用．所有保种用具均经高压蒸气灭菌20min．实验藻类培养温度为（21．0?0．5）?，光照约为4000lx，光暗比（L?D）为14h?10h．

2．2qPCR方法的建立

本研究中所用的qPCR方法参考Kamikawa等（2007）建立的Taqman qPCR方法．该方法采用一对引物对提取DNA样品进行靶序列扩增，并以一条荧光标记的特异性探针对扩增产物进行标记，以便定量分析．引物和探针系针对日本近海链状亚历山大藻核糖体大亚基RNA基因的D1 D2区设计．2．2．1引物和探针的设计与合成根据本实验室以往研究中得到的中国近海塔玛亚历山大藻复合种28S rDNA的序列信息，结合GenBank中已知亚历山大藻的LSU rDNA的序列信息，参考Kamikawa等（2007）引物和探针设计的靶区，以Primer5软件设计探针，并手工对比优化，设计了一对引物与一条特异性探针，分别命名为cat F：5'-CCTCAGTGAGATTGTAGTGC-3'和cat R：5'-GTGCAAAGGTAATCAAATGTCC-3'，TaqMan cat：5'-FAM-ATGGGTTTTGGCTGCAAGTGCA-TAMRA-3'，目标片段长度为106bp．引物及探针由大连宝生物公司合成．

2．2．2目标藻DNA模板提取DNA的提取参考Shoko Hosoi-Tanabe的方法（Hosoi-Tanabe et al．，2005）．收集的藻细胞采用400μL TE缓冲液（10 mmol·L－1Tris-HCl，pH=7．5；1mmol·L－1EDTA，pH=8．0）重悬，100?煮沸5min．加入400μL苯酚-氯仿-异戊醇（25?24?1）混合液，室温振荡后，经离心将上清液转至干净的Eppendorf管中．然后加入15μL3mol·L－1醋酸钠（pH=5．2）与400μL无水乙醇（－20?），于4?静置20min以上．离心后以70%乙醇清洗DNA两次，干燥并溶于20μL TE 缓冲液中．

2．2．3qPCR扩增与检测采用Eppendorf Mastercycler ep realplex实时荧光定量PCR仪进行qPCR反应，反应体系为：Premix Ex Taq TM12．5μL，双蒸水8．5μL，正反向引物（10μmol·L－1）各1μL，Taqman探针（5μmol·L－1）2μL（TaKaRa Bio Inc．），DNA模板2μL．PCR程序：95?预变性30s；95?变性5s，60?退火30s，共40个循环．

2．3方法验证与样品分析

2．3．1引物特异性验证分别选择：①链状亚历山大藻（ACDH藻株），②链状亚历山大藻（ACDH藻株）+微小亚历山大藻（AM藻株）+相关亚历山大藻（AC-1藻株）+中肋骨条藻（SC-1藻株）的混合藻样，③添加ACDH藻株的天然海水样品，④AM藻株，⑤AC-1藻株，以及⑥AM藻株+AC-1藻株+SC-1藻株的混合藻样等，进行qPCR反应，将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳图和qPCR反应图，分析引物的特异性．

2．3．2qPCR方法的线性响应取9000个ACDH 藻细胞，按照2．2．2节方法提取DNA，并对提取的DNA样品进行逐级2倍梯度稀释，以稀释后样品进行qPCR分析，每一样品重复3次，分析每一样品C q 值（Quantification Cycle）与DNA模板量的线性关系．

2．3．3qPCR方法的标准工作曲线与检出限以分离自东海的链状亚历山大藻ACDH藻株作为目标藻，以同一培养阶段的藻细胞构建分析的标准曲线，分别取5、10、50、100、500、1000、5000、10000个链状亚历山大藻细胞，其中，5、10个细胞组通过毛细管挑取单细胞获得，50、100、500、1000、5000、10000个细胞组通过显微镜计数后并逐级稀释获

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8期高岩等：应用qPCR方法检测中国近海塔玛亚历山大藻复合种的研究

得，所有样品均取1mL藻液，离心后提取DNA，每一浓度做3个平行．将qPCR反应所得C q值与细胞数的对数值通过线性回归拟合作为标准曲线，以最低细胞密度的响应情况来代表其检出限．

2．3．4对中国沿海分离的塔玛亚历山大藻复合种不同藻株的检测结果对比选取5株分离自中国沿海不同海域的塔玛亚历山大藻或链状亚历山大藻（表1），取处于对数生长期的藻细胞，用灭菌海水稀释至3000cells·mL－1．每一样品重复测定3次，每次取1mL稀释藻液离心收集藻细胞，提取DNA，并以所建立的qPCR方法进行定量分析．

2．3．5不同生长阶段亚历山大藻qPCR检测结果对比分别培养链状亚历山大藻ACDH藻株和塔玛亚历山大藻ATCI03藻株，培养条件如2．1节所述，初始接种密度均为500cells·mL－1．自接种日起，每隔3d采集一次样品，在显微镜下计数细胞密度．同时，取样进行qPCR分析，每次采集3个样品，每一样品收集3000个藻细胞，置于－20?冻存，直至两株藻进入衰亡期．将冻存的细胞提取DNA，并进行qPCR检测．

2．3．6qPCR方法对自然海水模拟样品的分析

自青岛汇泉湾取自然海水样品，经200#m筛绢过滤后，显微镜下观察确认无亚历山大藻细胞存在．取一定数量室内培养的链状亚历山大藻ACDH藻株添加到自然海水样品中，作为自然海水模拟样品，用所建立的qPCR方法对亚历山大藻细胞数进行检测．实验共设置2个浓度，分别含有500个和3000个亚历山大藻细胞，每一浓度设3个平行．将样品以碘液固定后分级沉降至10mL，离心收集藻细胞，提取DNA，进行qPCR反应．

2．4统计分析

采用SPSS软件，通过对样品的描述性统计分析、方差齐性分析及多重比较，分析塔玛亚历山大藻复合种不同藻株和不同生长阶段样品的qPCR检测结果之间差异的显著性．

3结果与分析（Results and analysis）

3．1qPCR方法引物的特异性验证

以qPCR方法中设计的引物扩增2．3．1节中6个藻类样品的DNA，结果发现，仅在含有目标藻ACDH藻株的3个样品中扩增到了大小约100bp 的片段，其他样品中均未检测到扩增的PCR产物（图1）．结果表明，该引物能够对塔玛亚历山大藻复合种的目标序列（LSU rRNA基因）进行特异性扩增

．

图1应用qPCR方法中的引物对不同藻类样品扩增产物的电泳分析（M：D500Marker（Takara Co．）；1 6对应2．3．1

节中的藻样① ⑥；7、8、9均为空白对照）

Fig．1Electrophoresis analysis of the amplified products of different algal samples using the primer pairs designed for the qPCR

method（M：D500Marker（Takara Co．）；1 6present algal

samples① ⑥in section2．3．1；7、8、9：blank

）

图2qPCR反应的C q值与DNA模板稀释倍数之间的关系Fig．2The relationship between C q value and dilution rate of template DNA

3．2qPCR方法的线性响应

将从ACDH藻株中提取的DNA模板逐级稀释后，经qPCR检测，其结果与DNA模板稀释倍数之间的关系如图2所示．结果表明，qPCR的C q值与DNA模板量（以稀释倍数表示）之间具有良好的线性响应关系，R2值为0．999，可见该qPCR方法对添

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环境科学学报33卷

加的目标藻DNA 模板量具有良好的线性响应．3．3qPCR 方法的标准工作曲线

按2．2节所述方法提取亚历山大藻模板DNA ，以细胞数为横坐标，以实时荧光定量PCR 方法分析得到的C q 值为纵坐标，绘制标准工作曲线，结果如图3所示．受到样品DNA 提取效率及细胞之间的差异等因素的影响，

方法的拟合度略低，但两者之间仍具有良好的线性关系，

R 2值可达0．

978．图3针对链状亚历山大藻ACDH 藻株构建的qPCR 标准工作曲线

Fig．3

qPCR calibration curve established with cells of Alexandrium catenella （strain ACDH ）

3．4不同塔玛亚历山大藻藻株qPCR 定量检测结

果对比

图4中国近海塔玛亚历山大藻复合种5个藻株qPCR 定量检测结果对比

Fig．4

Comparison of quantitative analytical results with qPCR on 5

strains of A．tamarense species complex isolated from China

对实验室培养的5株塔玛亚历山大藻复合种

（ATCI02、ATCI03、AT5-3、ATHK 为分离自南海的塔玛亚历山大藻藻株，ATCI02为分离自东海的链状亚历山大藻藻株），各取相同数量的对数生长期藻

细胞，应用所建立的qPCR 方法进行定量检测，结果

如图4所示，

分析结果表明，在5株塔玛亚历山大藻中，有4株检测结果基本一致，而分离自南海海域的

ATCI03藻C q 值明显偏低．Duncan 检验结果也显示，

ATCI03组的C q 值与其它4组存在显著差异（p ＜0．05），5株藻之间的组间差异主要来自ATCI03，其它4株藻的扩增结果没有显著差异．

3．5不同生长阶段亚历山大藻qPCR 定量检测结

果对比

对链状亚历山大藻ACDH 藻株和塔玛亚历山大藻ATCI03藻株不同生长阶段的藻细胞进行检测，结果如图5所示．可以看出，处于不同生长阶段的亚历山大藻得到的检测结果存在明显差异，对于细胞数相同的样品，在对数生长初期采集样品的C q 值明显低于对数生长中期及稳定期的样品．相同藻细胞密度下，

ATCI03藻株样品的C q 值低于ACDH 藻株，这两个藻株间的差异并不能用生长阶段的差别来解释

．

图5对不同生长阶段塔玛亚历山大藻复合种藻细胞qPCR 定量检测结果对比

Fig．5

Comparison of quantitative analytical results with qPCR on cells of A．tamarense species complex collected at different growth phases

3．6

自然海水模拟样品检测结果

应用qPCR 检测方法，对制备的自然海水模拟

样品进行了分析，所得到的检测结果如表2所示．可

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8期高岩等：应用qPCR方法检测中国近海塔玛亚历山大藻复合种的研究

以看出，根据qPCR所得到的检测结果低于真实细

胞浓度，两组链状亚历山大藻细胞的检测回收率在

60% 70%之间．对自然海水样品沉降浓缩、离心浓

缩及DNA提取过程的逐步分析表明，回收率偏低的

原因主要来自沉降浓缩过程中目标藻细胞的丢失，

这是造成检测结果偏低的主要原因之一．

表2添加链状亚历山大藻（ACDH藻株）的自然海水模拟样品

qPCR检测结果与计数结果对比情况

Table2Cell-counting and qPCR results of the natural seawater samples

supplemented with cells of A．catenella（strain ACDH）

亚历山大藻添加数量/cells

qPCR

检测结果

回收率

500410

34975%

368

30002037

188764%

1796

4讨论（Discussion）

在有害藻华研究中，由于有毒藻种和无毒藻种的形态学特征相似，而且海水中有毒藻类的细胞密度通常很低，因此，基于形态学特征的传统显微观察等方法往往难以满足有毒藻类的研究需求．与传统方法相比，分子生物学方法快速、灵敏、特异性高，特别适应于对低密度的有毒藻类进行检测．许多分子生物方法，如基因序列测定、荧光原位杂交、三明治杂交、实时定量PCR等开始逐渐应用于有害藻华研究（Zhen et al．，2009；梁斌等，2009；于仁成等，2006；张宝玉等，2005）．同时，基于分子生物学技术的有毒有害藻类监测仪器和设备也开始逐渐投入使用，如美国研发的环境样品处理器（Environmental Sample Processor，ESP），是一种全自动赤潮藻类与藻毒素监测设备，可实现自主化采样、检测、数据分析和信息传递（Scholin et al．，2006）．目前该设备已开始在美国缅因湾等海域布设，用于亚历山大藻的现场调查及毒性检测工作．同时，欧盟资助的基于基因芯片的有害藻类检测技术（ALGADEC）也取得了重要进展，已经开发出一种可用于有害藻华监测的半自动化检测设备（Diercks-Horn et al．，2011）．

与其他分子生物学方法相比，qPCR方法具有良好的特异性和灵敏度（Yuan et al．，2012；Dyhrman et al．，2006；Galluzzi et al．，2004；Hosoi-Tanabe et al．，2004）．本研究中建立的qPCR方法，可以将塔玛亚历山大藻复合种（GroupⅣ）与其他亚历山大藻藻种区分开来，具有良好的特异性．同时，根据本文的检测结果，低至5个藻细胞即可被检出．Galluzzi等（2004）根据其建立的标准工作曲线计算，最低可检测到0．2个细胞，完全可满足实际检测工作的需求．

在以往研究中发现，与其它微藻检测方法相比，qPCR方法得到的检测结果与藻细胞密度显著相关，但其结果的准确性相对较低．qPCR方法的准确性受到许多因素的影响，其中，用于构建标准工作曲线的目标藻与实际样品中的目标藻靶基因拷贝数差异是一个重要原因．目前，有害藻华研究中常选用核糖体RNA基因作为qPCR方法的靶基因，其拷贝数在不同藻种甚至同一藻种的不同藻株之间会存在显著差别．Prokopowich等（2003）分析了细胞DNA含量在0．12 54．7pg·cell－1之间的一系列微藻，发现不同微藻核糖体RNA基因拷贝数存在很大差异．同一藻种的不同地理株之间也存在核糖体拷贝数的差异．Galluzzi等（2004）对分离自地中海的A．catenella和A．taylori的核糖体RNA基因拷贝数研究发现，不同藻株的核糖体RNA基因拷贝数有明显差别．本文研究也发现，分离自我国沿海不同海域的塔玛亚历山大藻复合种各藻株之间也存在核糖体拷贝数的差异，这会影响到qPCR检测结果的准确性．对此，建议在应用qPCR方法时，应尽可能针对目标藻的当地藻株建立标准工作曲线，以消除不同地理株间核糖体RNA基因拷贝数差异造成的系统误差．此外，Dyhrman等（2006）曾提出采用不同藻株的混合样品作为标准品建立标准曲线，可在一定程度上降低不同藻株间核糖体RNA基因拷贝数差异所带来的误差．

除不同地理株间靶基因拷贝数的差异之外，不同生长状态和生活史阶段微藻细胞内靶基因拷贝数的变化也会对qPCR检测结果造成影响．受细胞周期DNA合成的影响，处于不同生长期的微藻靶基因拷贝数会有显著变动．本研究结果表明，处于对数生长初期的亚历山大藻核糖体RNA基因拷贝数显著高于对数生长后期和衰亡期的藻类，这与以往对不同生长期的A．taylori细胞的分析结果基本一致（Galluzzi et al．，2010）．此外，Penna等（2005）还发现，亚历山大藻营养细胞的核糖体RNA基因拷贝数远高于孢囊中的核糖体RNA基因拷贝数，说明亚

1622

环境科学学报33卷

历山大藻细胞内核糖体RNA基因拷贝数会受到其生理状态和生活史阶段的显著影响，可能存在核糖体RNA基因拷贝数的调节机制．不同生长阶段藻细胞中核糖体RNA基因拷贝数的变化可能与其有丝分裂活动有关．在对数生长初期，多数藻细胞DNA 合成和细胞有丝分裂活动旺盛，藻细胞中核糖体RNA基因拷贝数较高；而在对数生长后期，受到营养盐、光照等因素的限制，DNA合成和细胞有丝分裂活动下降，藻细胞中核糖体RNA基因拷贝数也相应下降．有关核糖体RNA基因拷贝数变动的机制目前尚难以完全解释，但不同生理阶段亚历山大藻核糖体RNA基因拷贝数的变化无疑会对qPCR检测准确性带来影响，这一点目前还没有好的解决方法．除此之外，qPCR的检测结果还会受到样品DNA 提取效率及PCR效率的影响．对此，可进行多个平行样品降低分析误差，也可考虑在DNA提取前加入已知细胞浓度的控制样品（Dyhrman et al．，2006），对标准曲线进行校正．

5结论（Conclusions）

1）本文所建立的qPCR方法具有良好的特异性和线性响应，可以用于中国近海塔玛亚历山大藻复合种（GroupⅣ）的快速检测．

2）qPCR检测结果受到目标藻种核糖体RNA 基因拷贝数变动的影响，分离自我国沿海不同海域的塔玛亚历山大藻复合种各藻株之间核糖体RNA 基因拷贝数也有明显差异．因此，建议在应用qPCR 进行检测时，需针对当地海域分离的亚历山大藻构建标准工作曲线．

致谢：本研究在实验仪器和设备方面得到了中国科学院海洋研究所杨红生研究员课题组的大力支持，特此致谢．

参考文献（References）：

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