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FISH试剂盒说明书

FISH试剂盒说明书

FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。 FISH(fluorescence in situ hybridization)荧光标记的原位杂交技术

试剂和说明

提供的材料

一盒包含4种试剂,可做20次试验,一次检测22mm×22mm靶区。

X/Y DNA探针盒:

X/Y DNA探针(已提前变性):﹣20℃避光保存

DAPIⅡ复染剂:﹣20℃避光保存

NP-40:﹣25~﹣30℃

22×SSC:﹣20℃~﹣25℃

储存和处理

未开封X/Y DNA试剂盒﹣20℃避光干燥处保存。20×SSC盐和NP-40可以单独储存于室温。阳性对照片应在-20 ℃条件下,密封加干燥剂保存。

需要但公司不提供的材料

实验室试剂超纯甲酰胺

100%乙醇,室温储存浓缩的(12N)盐酸 1N氢氧化钠

纯净水(蒸馏水或去离子水或Milli-Q),室温储存固定剂(3:1 甲醇:乙酸)每日新鲜配置 Drierite(商品名,干燥用无水硫酸)和液氮

实验室设备

荧光显微镜设备和推荐的滤光片

相差光学显微镜

预清洁的显微镜玻片

载玻片加热器(45℃-50℃)

22mm×22mm玻璃盖玻片

可调容积吸管(1-10ul)和无菌微量移液管头

聚丙烯微量离心管(0.5ml或1.5ml)

计时器磁力搅拌器漩涡混合器微量离心机刻度量筒

水浴锅(67±2℃和73±1℃)有氧培养箱(42℃)钻石笔湿盒镊子

一次性注射器(5ml)

染色缸(6)建议型号:Wheaton Product.No.900620竖式染色缸

pH剂和pH试纸温度计

金属丝试管架橡胶胶水

0.45um细孔过滤设备

工作液的准备

20×SSC

66g 20×SSC

200ml 纯化水

250ml 最终量

彻底混合,用pH计室温下测pH。如果需要,用浓盐酸调pH到5.3。加纯水至总量250ml。通过0.45um孔径的过滤设备过滤。室温储存6个月。

变性液

49ml 甲酰胺

7ml 20×SSC pH 5.3

14ml 纯化水 70ml 最终量

充分混合,放置于玻璃染缸。用pH计室温下测pH。确保pH在7.0-8.0。储存于有盖容器2-8℃。可最多使用1周。每次用前测定pH。

乙醇洗液

用100%乙醇和纯化水v/v稀释70%,85%。盖紧容器盖子室温下储存。若未发生蒸发或因过量使用所致溶液稀释,可使用1周。

0.4×SSC洗液

950ml 纯化水

20ml 20×SSC pH 5.3

1000ml 最终量

彻底混合。用pH计室温下测pH,用1N氢氧化钠调pH至7.0-7.5。加纯水至总量1000ml。通过0.45um孔径的过滤设备过滤。未使用过的液体室温储存6个月。使用过的液体当日丢弃。

0.1%NP-40在2×SSC中

100ml 20×SSC pH 5.3

849ml 纯化水

1ml NP-40

1000ml 最终量

彻底混合,用pH计室温下测pH,用1N氢氧化钠调pH至7.0-7.5.加纯水至总量1000ml。通过0.45um孔径的过滤设备过滤。加入70ml至染缸中保持室温。未使用的液体于加盖容器中室温储存6个月。使用过的液体当日丢弃。

标本收集、处理、储存和玻片准备

标本收集和处理

FISH测试步骤

标本DNA变性:

1. 在准备玻片前将杂交湿盒(一个密闭容器)置于42℃培养箱预热至42℃。

2. 加入变性液至玻片染色缸并于73±1℃水浴至少30min。使用前测量温度。

3. 标本DNA变性:将准备好的玻片浸泡在73±1℃变性液中5min。每一个玻片染色缸一

次不要放入超过4张玻片。

4. 用镊子将玻片从变性液中移出并立即置于室温下70%酒精洗液。摇动玻片除去甲酰胺。让玻片立于酒精洗液中1min。

5. 从70%酒精中移出玻片,依次用85%、100%酒精重复步骤4。

6. 晾干多余的酒精:用吸墨纸触及玻片底边并用实验室擦拭纸擦拭玻片下面。 P5

7. 在滴加探针溶液前,将玻片置于45-50℃载玻片加热器上不超过2min。

注意:如果在探针准备好之前玻片已备好超过2min,玻片应保留在100%酒精广口瓶内。在将玻片置于玻片加热器前不要风干。

探针准备

1. 将探针在室温复温,以降低其粘度便于准确吸取。

2. 涡流混合。在微量离心机轻微离心1-3s,使内容物沉于试管底部。再次轻轻涡流混合。

注意:探针是提前变性的,在标本玻片上滴于靶区。

杂交

1. 将10ul探针溶液滴于玻片的靶区。立即将22mm×22mm盖玻片覆盖于探针溶液上使溶液在盖玻片下均匀扩散。气泡会干扰杂交,应避免。

注意:在盖上盖玻片前勿将探针溶液滴在多个靶区。

2. 将玻片置于提前预热至42℃的杂交湿盒中,盖紧湿盒的盖子。

3. 将杂交湿盒放于42℃培养箱,杂交过程至少30min。

注意:在一些标本中,为获取更强的信号,也许需要更长的杂交时间。可能过夜培养(长达16小时)。超过1小时的培养,盖玻片必须用橡胶胶水一类的可清除密封剂密封,杂交湿盒必须加湿。

过程如下:

用5ml注射器抽橡胶胶水。在盖玻片和玻片周围涂少量橡胶胶水,从而形成密封圈。

将玻片置于加湿的杂交湿盒中(一个密闭容器,内置一片浸湿的吸墨纸或在容器内侧贴1in.×3in.纸巾)。

用密闭门关盖湿盒,培养1-16小时。培养后,从玻片上除去橡胶胶水。

杂交后洗涤

1. 加入0.4×SSC(pH7.0-7.5)至玻片染色缸中。将玻片染色缸放于73±1℃水浴中至少30min 或者直至溶液温度达到73±1℃,以预热0.4×SSC溶液。

注意:如果一次杂交的玻片数量超过4片,必须分批次洗涤。每次洗涤前洗液温度必须回至73±1℃。

2. 从第一张玻片的靶区移去盖玻片并立即将玻片置于含0.4×SSC玻片染色缸中。摇动玻片1-3秒。重复操作剩下3张玻片,73±1℃温育2min。

注意:在新加入玻片前不要移去盖玻片?在最后一张玻片加入水浴后开始计时2min。 3. 从水浴中拿出所有玻片放于室温2×SSC/0.1%NP-40缸中50-60s。玻片放置于水浴后摇动

1-3s。

4. 在暗处风干玻片(密闭抽屉或含架子的密闭橱柜)。

5. 用10ul的DAPIⅡ复染液滴于玻片靶区,覆盖盖玻片。在信号计数前将玻片储存于暗处。储存在﹣20℃的暗处储存杂交玻片(含盖玻片)。在此条件下玻片可以储存12个月而没有荧光信号强度的显著丢失。若要延长储存时间,需将盖玻片密封以防干燥同时﹣20℃储存。

信号计数评估玻片

用以下标准评估:探针信号强度:信号应明亮,清晰,可计。信号应为明亮紧凑的椭圆形或线性弥散的椭圆形。背景:黑暗,无荧光颗粒,无朦胧。交叉杂交/目标特异性:探针应只在目标上杂交和显影(X染色体着丝点或Y染色体的Yq12)需评估中期分裂相以发现交叉杂交和非目标序列。至少有98%的细胞应表现1个或更多信号。

(参看以下信号计数指南)

问题解决指南,处理新鲜玻片。

选择最佳视野和可计数的细胞核

用25×物镜扫视杂交区域,观察标本分布。挑选标本分布稀疏,无间期与中期分裂相重叠处,视野内可见间期或中期分裂相。避免细胞密集,重叠,或单个核的核边界不清。避免丛密细胞区。只计数信号清晰的细胞。计数

用40×或63×物镜,选定视野的左上区,从左至右,计数每个可计数中期分裂相细胞(计数>20个)的信号数或每个可计数间期细胞核(计数>500个)边界内的信号数。计数200个间期细胞核后若有5%以上无杂交信号则杂交失败。