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分子生态学实验步骤及原理总结

(一)基因组DNA提取

上海博彩生物科技有限公司:3S DNA Isolation Kit for Environmental Samples V2.2 3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒V2.2

DNA抽提方法

使用仪器:灭菌锅,无菌操作台,移液枪,漩涡振荡器,台式离心机,水浴锅,分光光度计或者琼脂糖电泳槽

灭菌物品:枪头,1.5ml,2ml离心管

一、污泥样品前处理

样品在处理前首先要混匀,使其中的悬浮物质分布均匀。

取约l0mL污水样品,加入灭菌离心管,400Orpm、离心20min,收集沉淀,加约4倍体积的TENP buffer(50mMTirs,20mM EDTA,100mM NaCl,0.01g/mL PVP,pHl0),加玻璃珠(d:l mm)充分匀化(解絮凝)。4000rpm,离心20min,弃上清(重复两次,直至上清液较澄清)。加约4倍体积的PBS buffer(8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4溶于lL 水、pH7.4),旋涡混匀,4000rpm,离心20min,收集沉淀(重复两次)

二、基因组DNA提取

1.样品准备:100mg样品用200ul Solution SUS 将样品浸泡、悬浮,使样品软化分散开。

2.加入400ul Solution L YS,300mg石英砂,盖上离心管盖,在漩涡振荡器上高速剧烈振荡,

10-30min或更长时间。

3.用台式离心机,12000rpm,室温离心5min。

4.将上清液完全转移到无菌1.5ml离心管中,加入120ul Solution BID,盖上离心管盖,上

下颠倒混匀。将溶液用1ml TIP全部转移到3S柱内,柱子放入2ml离心管中,不盖离心管盖,室温放置2min以上。

5.盖上离心管盖,12000rpm,室温离心1min。

6.取下3S柱,弃去离心管中的废液。将柱子放回同一根离心管中,加入600ul Wash Solution,

10000rpm,室温离心1min。

7.重复6一次。

8.取下3S柱,弃去离心管中的全部废液。将柱子放回同一根离心管中,10000rpm,室温

离心2min,以除去残留的Wash Solution。

9.洗脱:在柱子中央加入100ul TE,将柱子放入新的干净1.5ml离心管中,室温放置2min。

12000rpm,室温离心1min。收集管中的液体即为基因组DNA。根据用途,样品可以4℃或-20℃保存。为提高洗脱效率,可以将TE预热到37-55℃。如果样品中基因组DNA含量很低,用30ul TE洗脱可以提高洗脱液的样品浓度,但产率有所下降。重复该洗脱步骤一次,可以提高产率20%左右。

三、提取DNA的质量检测

(1)DNA纯度和浓度检测

用紫外分光光度计测定DNA样品在波长230,260,280nm处的吸光光度值。

DNA纯度的定性检测:

通过A260/A280及A260/A230的比值可以检测所提DNA是否纯。通常纯DNA

样品A26O/A280≈1.8,A260/A230>2。若A260/A280>l.9,可能有RNA污染;若

A260/A280

杂质。

DNA浓度的计算:

浓度(µg/mL)=A260*50*稀释倍数;

注:1OD值相当于50 µg/mL双螺旋DNA。

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