不同来源肠球菌对氟苯尼考的耐药特点及传播机制的研究
不同来源肠球菌对氟苯尼考的耐药特点及传播机制的研究
中文摘要
目的
本文对从浙江、河南、山西、山东和四川等地的多个养殖场分离的肠球菌进行了氟苯尼考耐药性和耐药基因分析，并对其中一株肠球菌进行了全基因组测序，分析携带的fexA、fexB和optrA的遗传环境，特别是其相关的可移动元件。研究动物来源的肠球菌对氟苯尼考的耐药情况，探讨抗性基因相关可移动遗传元件及水平转移的分子机制，为动物感染性疾病的预防和治疗提供帮助，本文为以后肠球菌的多重耐药研究提供了实验依据。
方法
1.于2016年间，从浙江、河南、山西、山东和四川等地的多个养殖场采集牛、鸡、猪的新鲜粪便标本，将样本稀释后分别涂布在含和不含氟苯尼考的LB 固体培养基上，培养后挑取形态各异的单菌落对进行分离纯化；
2.以生化、16S rRNA基因测序方法确定细菌种属；
3.采用琼脂稀释法对不同来源肠球菌进行氟苯尼考、氯霉素、四环素、头孢噻呋钠、恩诺沙星5种抗生素的药物敏感性试验，分析不同来源肠球菌的耐药情况；
4.以细菌基因组为模板，采用PCR扩增的方法筛查氟苯尼考耐药基因(pexA，fexA，fexB，optrA，cfr，floR)阳性肠球菌，了解肠球菌中氟苯尼考耐药基因的分布情况；
5.以optrA阳性的肠球菌为样本进行脉冲场凝胶电泳，分析optrA阳性的肠球菌间的同源性，观察optrA阳性菌株的克隆关系；
6.挑取一株屎肠球菌P47提取基因组后进行全基因组测序，使用生物信息学软件进行序列拼接和ORFs注释。定位氟苯尼考耐药基因，分析其侧翼区域及相关可移动遗传元件。
7.以P47菌株基因组为模板，利用大肠杆菌-肠球菌穿梭载体pAM401，对optrA基因进行克隆，并送测序，将测序结果与原始菌株相应基因序列进行比对验证。用琼脂稀释法对克隆菌株进行药物敏感性实验，验证optrA基因是否具有耐药性功能。
8.以粪肠球菌JH2-2为受体菌，P47为供体菌，用滤膜法进行接合转移试验。提取接合子质粒，用PCR验证质粒是否携带耐药基因，同时用琼脂稀释法对接
合子进行氟苯尼考、利奈唑胺、利福平等药物的MIC值测定。
9.采用S1核酸酶脉冲场凝胶电泳（S1-PFGE）对P47原始菌和接合子进行分离，确定接合子质粒个数及耐药基因定位是否准确。
结果
1.本实验共分离到351株细菌，经过革兰染色、生化鉴定和16S rRNA基因测序鉴定，共分离到肠球菌25株，其中5株粪肠球菌，占肠球菌的20%，20株屎肠球菌，占肠球菌的80%。
2.25株肠球菌对氯霉素耐药（MIC≥32μg/mL）的菌株有17株，耐药率为68%，对氟苯尼考耐药的菌株有18株，耐药率为72%。
3.筛出16株阳性菌株携带的阳性目的基因共34个：携带单个耐药基因的只有1株，仅携带有fexB基因；共同携带fexA和optrA有8株，共同携带fexB 和optrA有4株，共同携带fexA、fexB和optrA有1株，共同携带fexB、optrA 和cfr基因的有1株。共同携带fexA、optrA和cfr基因的有1株。
4.PFGE结果显示大部分条带分子量在20-700kb，条带数目在15-22条左右，可分为13个PFGE型，其中两株菌相似度在90%以上。
5.P47全基因组测序拼接结果显示，含有三个成环质粒，大小分别为180kb、61kb和28kb。其中fexA和optrA基因位于61kb大小的质粒，fexB基因位于28kb 大小的质粒上，且上、下游都有IS1216插入序列。
6.成功克隆optrA基因，测序结果显示与首次发现的optrA基因存在三个氨基酸的变异，分别为Lys3Glu，Tyr176Asp，Thr481Pro。药敏结果显示含重组质粒的重组子对氟苯尼考、利奈唑胺的MIC均比仅含载体的受体菌提高了8倍、2倍。
7.P47滤膜法接合转移试验结果显示成功获得接合子1株，药敏结果表明接合子获得了氟苯尼考、利奈唑胺、利福平和夫西地酸的多重耐药。
8.P47原始菌和接合子S1-PFGE结果显示可接合转移质粒只有一个，PCR 验证其携带有optrA和fexA基因。
结论
1.动物来源的肠球菌对氟苯尼考均具有一定程度的耐药，主要分子机制与肠球菌携带fexA、fexB、optrA和cfr基因有关；
2.PFGE结果有两株来源于同一养殖场的肠球菌相似度>90%，可认为是同一个PFGE型，说明该养殖场内含有optrA基因的菌株可能存在克隆传播现象。
3.OptrA氨基酸序列存在突变位点（Lys3Glu，Tyr176Asp，Thr481Pro），克隆转化及药敏试验显示具有突变位点的OptrA仍具有对氟苯尼考、恶唑烷酮的耐药，说明这些突变位点与基因的耐药性功能无明显关系。
4.通过对fexB、fexA和optrA基因上下游序列分析，发现均携带由插入序列IS1216构成的转座子，并且携带fexA和optrA基因的质粒可进行接合转移，这些数据表明了耐药基因可通过转座或接合的方式发生水平转移造成耐药性的播散。
关键词
肠球菌；氟苯尼考；耐药性；optrA；传播机制