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细胞周期同步化

在细胞培养过程中,细胞多处于不同的细胞周期时相中,其中有少数细胞在进行有丝分裂活动,其余细胞分别处于G1、S和G2各期。不同时相的细胞对药物干预存在不同反应,会影响实验的重复性,因此,需要获得周期一致性的细胞。利用细胞同步化技术可使细胞大量的处于同一细胞时期,并可获得该时期大量的物质,如细胞中期时的染色体。细胞周期同步化(synchronization)是指为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡,借助某种自然或人为的实验手段,使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相( 除了G0期的细胞)的现象。细胞同步化本质上包括用一定的方法获得一定数量的同步化细胞群和使细胞进入同步化生长的两层含义。

DNA 合成抑制法是通过抑制DNA合成将细胞同步于同一时期的方法。高浓度TdR(胸腺嘧啶核苷)双阻断法是目前常用的抑制DNA 合成的同步化方法。它可逆地抑制DNA 合成,而不影响其他时期细胞的转运,最终可将细胞群阻断在S 期或G1 /S 交界处。其原理是: Td R是细胞DNA 合成不可缺少的前体,但向培养基中加入过量TdR,可形成过量的三磷酸腺苷,后者能反馈抑制其他核苷酸的磷酸化,从而抑制DNA 合成。它将细胞同步于G1 /S期交界处,同步化程度高,适用于任何培养体系,可将几乎所有的细胞同步化,但是容易产生非均衡生长,个别细胞体积增大。TdR双阻断法因为简单易行且可逆,在肿瘤药理方面对细胞周期同步化的实验中得到了广泛的应用。羟基脲、5-氟脱氧尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲蝶呤和高浓度ADR、GDR也属于DNA合成抑制剂,它们与TdR作用相似,均可通过抑制DNA合成达到同步化的目的。

中期阻断法是利用破坏微管的药物将细胞阻断在M期从而得到同一时期细胞的方法,常用的药物有秋水仙素等。秋水仙素通过抑制微管的聚合,进而抑制有丝分裂装置的形成,将细胞阻断于有丝分裂中期然后再释放使细胞达到同步化。中期阻断法非平衡生长问题不明显,但可逆性比较差,当阻断时间过长时,许多细胞产生异常分裂。过去研究中也发现,同步后的细胞的生长能力明显不如撤去阻断剂后得到的S期细胞旺盛。秋水仙胺、Nocodazole也是目前常用的中期阻断剂。

经过同步化之后的细胞可以通过流式细胞术对其周期进行分析。将细胞用PI(碘化丙啶)染液进行染色,使用流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定,可分析细胞周期各时相的百分比。由于细胞的DNA含量在不同时期有显著的差异,因此可以将细胞分成

G1/G0期(1倍),S期(1-2倍)和G2/M期(2倍)。流式细胞仪可以根据DNA含量在不同时间内的变化,从而确定细胞周期的长短,也可以直接标记DNA复制(放射性同位素标记),统计细胞数量与标记细胞的百分比,对细胞周期进行综合分析.

连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程为细胞周期(cell cyc1e)。细胞周期包含四个阶段:①G1期(first gap),又称合成前期,指前一次有丝分裂完成到DNA复制前的一段时期;②S期(synthesis phase),即DNA合成期,为真核细胞分裂(cell pision)间期中进行DNA合成的阶段;③G2期(second gap),为DNA合成后期,指DNA合成结束至有丝分裂开始之间的一个阶段;④M期 (mitosis or pision) ,又称D期,是染色体真正开始分离时期。细胞周期又可分为有丝分裂期(M期)和分裂间期(即G1→S→G2)两个时期。尽管细胞周期中各期的持续时间因不同细胞类型而异,但相对而言M期最短,S期较长。流式细胞仪(flow cytometer;FCM)的工作原理是在样品管中放入待测细胞,在气体的压力下使待测细胞进入充满鞘液的流动室。在细胞流动室里单细胞悬液被鞘流液包绕通过流动室内一定孔径的孔,形成细胞柱。然后通过对流动液体中单列的细胞进行逐一检测,得到单个细胞的光散射和荧光指标,在功能水平上定量分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等的物理、化学特征等多个参数。流式细胞仪不仅可以根据不同时间内DNA含量的变化来确定细胞周期的长短,还可以直接用放射性同位素标记DNA复制,通过统计细胞数目与比较各时相细胞的百分比来检测是否达到预期目的,从而对细胞周期各时相进行综合分析。流式细胞分析法与传统的荧光镜检查相比,具有速度快、精度高、准确性好等优点,已成为当代最先进的细胞定量分析技术。

Hela细胞周期时间为21 h,其中G1期为10 h,S期为7 h,G2期为3 h,M期为1 h。

一、S期同步化方法(胸腺嘧啶核苷双阻断法,两次可让细胞同步化到G1/S期)

胸腺嘧啶核苷(TdR)双阻断法:在处于对数生长期细胞的培养基中首次加入过量的DNA合成抑制剂TdR,能可逆地抑制S期细胞的DNA生成,而不作用其他细胞阶段的运转,导致大多数细胞群被同步化于G1/S期交界处,但仍有部分细胞处于S期范围;移去胸腺嘧啶核苷,细胞再培养一段比S期较长而短于G2、M、G1三期总和的时间,让它们完全越过S 期,但又不使按周期发展最快的细胞进入下一个S期。第二次胸腺嘧啶核苷处理,当细胞继续运转至G1/S交界处时,被过量的胸腺嘧啶核苷抑制而停止。细胞则于G1/S期边界汇集,再次撤掉胸腺嘧啶核苷,加入完全培养基,使细胞继续生长,则细胞同时启动于S 期。5-氟脱氧尿嘧啶、羟基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、高浓度AdR和GdR等DNA合成抑制剂均可抑制DNA合成使细胞同步化,由于高浓度胸腺嘧啶核苷对S期细胞的毒性较小,因此常用胸腺嘧啶核苷双阻断法诱导细胞同步化。其优点是同步化程度高,适用于任何培养体系。几乎可将所有的细胞同步化,缺点是造成非均衡生长,个别细胞体积增大。

二、M期同步化方法(振荡收集法)

该法利用M期细胞变圆易脱落的特点。在处于对数增殖期的单层贴壁细胞(分裂活跃,M 期多)中加入Nocodazole。一段时间后,多数细胞被阻滞与M期,轻轻振荡或拍击培养瓶,M期细胞则与瓶壁脱离,悬浮在培养液中,收集培养液,之后再加入新鲜培养液,按照此法继续收集,可得到一定数目的M期细胞。振荡收集法操作简单,同步化程度高并且细胞不受药物伤害,能够真实反映细胞周期状况,缺点是由于M期较短,被分离出的细胞很少,只能应用于贴壁细胞。收集到的有丝分裂期的细胞可以贮存在冰上,然后处理其余的培养瓶。

三.实验用品

1.材料:Hela细胞。

2.试剂:%胰蛋白酶液、无血清细胞培养液、DAPI试剂、Hank’s液、2mmol/L TdR、70%乙醇(保存于4℃)、RNase-A(10mg/ml,-20℃保存)、PI(650 g/ml,避光保存于-20℃)、PBS (pH 保存于4℃)、秋水仙胺、秋水仙素。

3.器材:培养瓶、移液器、枪头、5ml注射器、试管、离心管、封口膜、微量移液器、Tips、烧杯、废液缸、细胞培养设备、倒置显微镜、台式离心机、水浴、4℃冰箱、二氧化碳培养箱、N2罐、流式细胞仪、超净工作台。

四.实验步骤

(一)S期同步化方法(TdR双阻断法)

(1) 取指数生长期细胞。

(2) 第一次阻断:将对数生长期细胞的培养基换成含2mmol/L的新鲜TdR培养液。

(3) 37℃、5%CO 二氧化碳培养箱中培养12h

(4) 第一次释放:弃去含有胸腺嘧啶核苷的培养基,用Hanks液对贴壁细胞漂洗2~3

次,并更换不含TdR的新鲜培养基,继续培养16h。

(5) 第二次阻断:弃去培养液,再加入浓度为2mmol/LTdR的新鲜培养基,37℃、

5%CO 培养12h。

(6) 第二次释放:重复第(4)步骤,此时的细胞大部分出去G1/S期边界,同步化细

胞随时间推移逐渐进入S期。

(二)M期同步化方法(振荡收集法)

(1) 取生长于占瓶底面积60%~80%的细胞一瓶,轻轻摇晃或拍击培养瓶,使松动细胞

脱落而悬浮在培养液中,并用离心管收集。

(2) 用Hank洗涤2次,漂洗液收集到离心管。

(3) 600rpm离心5分钟,并用培养液将细胞浓度调整为×105个/ml接种于培养瓶。

(三)利用流式细胞术分析细胞周期时相

(1) 将细胞传代培养至指数生长期,吸弃细胞培养上清,用Hanks液洗涤细胞一次,

胰酶消化细胞,完全培养基终止,收集细胞。1200rmp 5min离心,弃去上清。

(2) 4℃预冷的PBS漂洗细胞沉淀2次,1500rmp离心5分钟,收集细胞。

(3) 快速将细胞悬液注入预冷的70%乙醇中,封口膜封口。4℃固定过夜(可长至2

周)。

(4) 1500rmp 离心5分钟去固定液,收集固定细胞,用 PBS使细胞重悬并转至试管中

吹打均匀(防止细胞破碎)。PBS漂洗2次。

(5) 细胞染色液配制:40×加碘化丙啶(PI)母液(2 mg/ml):100×RNA酶A母液

(10 mg/ml):1×PBS =25:10:1000。

(6) 细胞染色:根据细胞量,加入一定体积的细胞染色液(1~)重悬,使上机时细胞

通过率为200~350 Cell/s。

(7) 用300目(孔径40~50 m)的筛网过滤于流式上机管中,上机检测。

(8) 样品分析测定及打印。

(四) 秋水仙素阻抑法

(1)将细胞培养至指数生长期。

(2)加入秋水仙素,使培养基最终浓度为~μg/mL,作用6~7小时。

(3)收集细胞,800rpm离心5~10分钟,弃去上清,沉于管底的细胞即为M期细胞。

(五)N2阻断法

(1)将细胞传代培养至指数生长期。

(2)将培养瓶置于N2罐中并通入适量CO2(约相当于罐中体积的5%)。

(3)关闭N2罐,连接N2管子和压力表,慢慢向罐中充入氮气直到压力为80~90磅/

英寸为止。

(4)将N2装置放在37℃培养箱中10~16小时。次日取出,然后缓缓放出N2(最好放出

窗外)。

(5)取出细胞观察同步化效果,并用振荡法收集细胞于离心管中。

(6)800rpm离心10分钟,收集细胞。

(六)G1期和G2期细胞的获得

1.G2期细胞的获得

根据细胞周期测定的数值,使用胸腺嘧啶核苷双阻断法使细胞同步化于G1/S期交界处后,使细胞释放胸腺嘧啶核苷后继续培养。其培养时间应大于S期时间并小于S期与G2期总和的时间。然后先用振荡收集法使已进入M期的细胞脱落瓶壁,弃去上清培养基;再用胰酶消化,加入新鲜培养基制成细胞悬液,离心收集细胞,即为G2期细胞。

2.G1期细胞的获得

(1)向用胸腺嘧啶核苷双阻断法获得的细胞中加入一定量的培养基,继续培养大于

S+G2+M期小于一个周期的时间即可获得G1期细胞。

(2)向细胞中加入缺乏异亮氨酸的培养基进行培养,培养时间超过一个细胞周期,即可

获得G1期细胞。

细胞周期同步化

Chemical/pharmacol ogical inhibition

of DNA replication/synthe sis or mitotic spindle formation

Lovastatin Inhibition of HMG-CoA

reductase (cholesterol

synthesis) and the

proteasome

Early G1

Mimosine Inhibition

of thymidine,

nucleotide

biosynthesis,

inhibition of

Ctf4/chromatin binding

Late G1;

G1/S

Thymidine

TdR

Excess thymidine-

induced feedback

inhibition of DNA

replication

G1/S

Aphidicolin Inhibition of DNA

polymerase-α and DNA

polymerase-δ

G1/S

Hydroxyurea Inhibition of

ribonucleotide

reductase

G1/S

Colchicine

Colcemide

Inhibition of

microtubule

polymerization

G2/M

Nocodazole Inhibition of

microtubule

polymerization

G2/M

Mitogen or growth factor withdrawal Serum starvation Growth restriction–

induced quiescence

G0/G1

Amino acid

starvation

Growth restriction–

induced quiescence

G0/G1

Density arrest Contact

inhibition

Cell-cell contact–

induced activation of

specific

transcriptional

programs

G1