固定化漆酶对染料酸性紫43的脱色和降解
第37卷第6期 2007年12月
工业微生物
Industrial M icrobiology
Vol.37No.6 Dec.2007
基金项目:南京林业大学十五人才基金(No:163030007)。
作者简介:赵林果(1965~),男,副教授,博士研究生,研究方向为生物化工。E-mail:lg.zhao@https://www.wendangku.net/doc/5915791512.html, T el:025-********。
固定化漆酶对染料酸性紫43的脱色和降解
赵林果, 季永新, 李 强, 唐 莹
(南京林业大学化学工程学院,南京210037)
摘 要 采用自制复合型载体丙烯酸酯类聚合物固定的漆酶对染料酸性紫43进行脱色处理。研究了固定化酶的用量、底物浓度、温度、pH 对其降解效果的影响。结果表明,固定化漆酶脱色降解酸性紫43的适宜条件为:酶用量12.5U/mL,染料浓度150mg/L,反应的温度范围在45~55e ,pH 值范围在4.5~5.0。在上述条件下降解4h,染料酸性紫43脱色率能达到98.5%。重复分批使用固定化漆酶处理染料酸性紫43,在使用8批次后,脱色率仍然能保持在90%以上,其催化效率得到了很大提高。
关键词:固定化漆酶; 酸性紫43; 脱色; 降解条件; 优化 我国年产染料量15万吨,其中大约有10%~15%的染料直接随废水排入环境中。而染料具有高度的稳定性,并且许多染料是由一些致癌物质合成[1],因此,高色度的染料废水是最难处理但又必须要处理的工业废水之一。由于采用物理或化学方法处理的效果不太明显,而且费用较高,所以众多学者把研究焦点集中在微生物对染料废水的降解上[2~3]。 漆酶是一种含有多个铜离子的多酚氧化酶,能催化多种芳香族化合物的降解[4]
。在染料和印染废水处理中具有重要的应用价值[5~6]。但游离漆酶的生产成本较高,对外界的物理和化学因素比较敏感,并且不能重复利用,从而限制了漆酶的有效使用。近年来,国内外对真菌漆酶的固定化方法及固定化酶的性质进行了比较深入的研究[7~8]
。其中,
一些学者在应用方面,已开始利用固定化漆酶来处
理染料和印染废水
[9]
,并证实了固定化漆酶比游离
漆酶具有显著的优越性。本文以印染工业中常用的染料酸性紫43为底物,研究了利用自制复合型载体丙烯酸酯类聚合物固定的漆酶降解该种染料的适宜条件。试验结果为固定化漆酶处理印染废水的深入研究打下了基础。
1 材料与方法
1.1 染料酸性紫43溶液
染料酸性紫43(Acid Violet 43,C 21H 14NNaO 6S,CAS 号:4430-18-6,分子量431.89)为紫黑色粉末,易溶于水,水溶液呈深紫色。其结构为:
使用时,先配制1%酸性紫43溶液。即准确称取0.1g 酸性紫43溶于0.05mol/L 的柠檬酸缓冲溶液中(pH 3~6)。将该溶液置于棕色试剂瓶中,放入冰箱保存备用。1.2 丙烯酸酯类聚合物制备
以浓度为40%的CaCl 2水溶液为水相,以单体及正庚烷构成有机相。其中,单体包括40%甲基丙烯酸缩水甘油酯、30%邻二乙烯基苯和30%甲基丙烯酸甲酯,正庚烷用量为单体总量的3倍。制备时,在装有搅拌器、球型冷凝管、温度计的四口烧瓶中,先加入一定体积的CaCl 2水溶液及15%(相对于单体用量)的活性炭,升温至45e 后,按油水比为3.5B 1的比例加入一定体积的上述有机相混合物,并以0.6%(单体用量)偶氮二异丁腈为引发剂进行悬浮聚合反应:55e 反应1h,70e 反应3h,80~85e
反应4h。所得固体进行抽滤,然后用热水洗涤三次,用丙酮洗涤两次,再用水洗涤一至两次,晾干或进行真空干燥后制得灰黑色固体。其颗粒大小约为40~60目。
1.3漆酶的制备
由南京林业大学化工学院微生物技术实验室制备。以彩绒革盖菌(Coriolus versicolor)为菌种,采用麸皮为碳源、酒石酸铵为氮源的高碳高氮(H CHN)培养基,在初始pH值6.0、温度30e、转速150r/min的条件下培养7d。产酶结束后,离心,上清液即为漆酶的粗酶液。
1.4漆酶的固定化
称取适量的自制复合型载体丙烯酸酯类聚合物与一定量的酶液(漆酶用量为100U/mL,相对于混合液总体积)及0.05mol/L、pH 5.0的NaAc-HAc 缓冲溶液混合,在30e、120r/min条件下固定反应24h。抽滤,用0.05mol/L、pH5.0的NaAc-HAc 缓冲溶液洗涤载体,直到没有游离酶被洗出时为止。将制备的固定化漆酶放入4e冰箱中保存。经测定,固定化漆酶的活力为500U/g。
1.5固定化漆酶脱色降解酸性紫43溶液
降解条件:取1%酸性紫43溶液0.3mL,用0.05mol/L、pH5.0的NaAc-HAc缓冲溶液定容至20mL,加入适量的固定化酶后置于自制的带过滤装置的反应器中,在50e、100r/min的恒温振荡器中进行脱色降解。定时取样,利用分光光度计测定反应体系的吸光值。在重复分批降解试验中,每批次降解时间为4h。每次降解结束后,滤去所有液体并留样分析。然后用适量的缓冲溶液洗涤留在容器中的固定化酶,再次加入相同浓度和体积的酸性紫43溶液,并在相同的条件下进行新一轮的降解试验。
样品波长扫描:采用岛津UV-2450紫外/可见分光光度计检测,扫描范围在200~700nm。
脱色率的计算:(1)对染料进行波长扫描,确定最大吸收波长为573nm。(2)根据染料的一组标准浓度与各自吸光值A573的大小绘制标准曲线。
(3)将样品稀释到吸光值与染料浓度成线性的范围内,用分光光度计测量该样品的吸光值A573,然后根据标准方程计算出样品中所含的染料浓度,再乘以稀释倍数,即为该样品中染料的含量M。(4)脱色率=(1-M后/M前)@100%。其中,M前:脱色反应前溶液中染料的含量(mg),M后:经脱色反应一段时间后溶液中染料的含量(mg)。
1.6固定化漆酶活力测定[10]
以2,2.-连氮-二-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(简称ABTS)为底物,酶液用1mL蒸馏水和一定质量的固定化酶来代替,在50e、pH值5.0的条件下测定反应过程的前5min内反应液在420nm处吸光值的增加量(E420=36000L/mol#cm)。定义每分钟氧化1L mol ABTS所需的酶量为一个酶活单位(U)。
2结果与讨论
2.1固定化漆酶用量对染料脱色率的影响
分别取0.5g、0.4g、0.3g、0.2g、0.1g固定化漆酶(固定化漆酶活力为500U/g)加入到20mL底物浓度为150mg/L的酸性紫43染料中,使反应体系中酶活分别为12.5U/mL、10U/mL、7.5U/ mL、5U/mL、2.5U/mL。降解反应在50e、pH值5.0、100r/m in的条件下进行,结果如图1所示。从图中可知,该染料比较容易被漆酶降解。0.5h时,酶用量为12.5U/mL、10U/mL、7.5U/mL、5U/ mL、
2.5U/mL的固定化漆酶对染料酸性紫43
的脱色率图1固定化漆酶用量对染料脱色率的影响
第6期工业微生物第37卷
就分别达到68.9%、63.7%、56.8%、50.1%、40.2%,而且随着酶解时间的延长,染料的脱色率不断增大。但固定化酶用量不同,其脱色率的增加幅度存在明显差异。1h 后,酶用量为12.5U/mL 、10U/mL 的脱色率仍以较快的速度增加,到4h 时,降解已比较充分,它们的脱色率分别增加到95.4%和93.2%;而酶用量为7.5U /mL 、5U/mL 、2.5U /mL 的脱色率增加速度变得缓慢,到4h 时,它们的脱色率分别为80.2%、74.5%、69.3%。显然,酶用量越大,脱色率越高,脱色速度也越快。在上述酶解条件下,当酶用量为12.5U/mL 时,酶解4h 就能达到很好的脱色效果。
图2 不同用量固定化酶脱色降解
酸性紫43波长扫描图谱
A,空白对照;B,C,D,E,F 的酶用量分别为12.5U/mL 、10U/mL 、7.5U /mL 、5U/mL 、2.5U/mL
用岛津UV -2450紫外/可见分光光度计分别检测不同用量的固定化漆酶降解酸性紫43染料4h 后的样品,结果如图2所示。从图中可知,空白样品A 有两个明显的特征吸收峰。当不同用量的固定化酶脱色降解酸性紫43时,这两个特征吸收峰都有不同程度的减弱。其中固定化酶用量为12.5U/mL 时,两个特征吸收峰基本消失,只是在573nm 处还有微弱的一个平峰存在。而随着固定化酶用量的减少,其特征吸收峰的吸光值越来越大,固定化酶用量为2.5U/m L,两个特征吸收峰变化值最小,说明染料未能被很好降解。
2.2 染料浓度对固定化漆酶脱色降解酸性紫43的影响
取酶用量为12.5U/m L 的固定化酶分别加入到20mL 底物浓度为50mg/L 、100mg/L 、150mg/L 、200mg/L 、250m g/L 的酸性紫43染料中,在50e 、pH 5.0、100r/min 的条件下进行脱色降解,定时取样检测脱色率,结果如图3所示。从图中可知,酶用量一定的情况下,底物浓度低于150mg/L 时,其降解率几乎相同,但大于150mg/L 时,染料浓度越高,其降解率越低。相反,当底物浓度低于200mg /L 时,染料的降解量则随着初始浓度的增大而增大,但高于这一浓度,其降解量几乎不再增加。综合考虑染料的降解率和降解量,底物浓度为150mg /L
比较适宜。
图3
染料浓度对脱色率的影响
2.3 pH 值对固定化漆酶脱色降解酸性紫43的影响
调节底物溶液(浓度为150mg/L 的酸性紫43染料)的pH 值分别为3.0、4.0、4.5、5.0、6.0,均加入酶用量为12.5U /mL 的固定化酶,置于50e 、100r/m in 的条件下进行脱色降解。定时取样检测脱色率,结果如图4所示。
由图4可以看出,不同pH 值下,固定化酶的催化效率不同。当溶液的pH 值为3.0时,在检测的
整个过程中,脱色率一直处于最低的水平,8h 时脱色率才达到59.3%。pH 值为4.5的降解效果与pH 值为5.0的基本一致,而且脱色率最高,4h 时它们的脱色率就分别达到93.3%和95.4%。同时
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赵林果,等:固定化漆酶对染料酸性紫43的脱色和降解
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发现,pH 值为6.0时,固定化漆酶脱色能力迅速下降。所以,固定化漆酶降解酸性紫43较适宜的pH 值在4.5~5.0
。
图4 pH 值对固定化漆酶脱色降解
酸性紫43
的影响
2.4 温度对固定化漆酶脱色降解酸性紫43的影
响
图5 温度对固定化漆酶脱色降解
酸性紫43的影响
在其它条件均相同的条件下,将固定化漆酶降解染料的温度分别设定为25e 、30e 、35e 、40e 、45e 、50e 、55e 、60e 、65e 、70e 、75e ,降解4h 后取样检测其脱色率,结果见图5。从图中可知,在较低温度下,脱色率随着温度的升高而增大,在55e 时达到最大值。同时,固定化酶适宜的降解温度范围比较宽,在45~55e 的脱色率均较高。但超
过55e ,脱色率显著下降。所以,固定化漆酶降解酸性紫43的适宜温度可控制在45~55e 。2.5 固定化漆酶的最大循环次数
取酶用量为12.5U/m L 的固定化酶和20mL 底物浓度为150mg/L 的酸性紫43染料置于自制的带过滤装置的反应器中,在50e ,100r/min 的恒温振荡器中进行脱色降解。每批次降解时间为4h 。每次降解结束后,滤去所有液体并留样分析。然后用适量的缓冲溶液洗涤留在容器中的固定化酶,再次加入相同浓度和体积的酸性紫43溶液,并在相同的条件下进行新一轮的降解试验。如此进行重复酶解13轮,结果如图6所示。结果表明,分批重复8轮,脱色率还能保持在90%以上,但超过十轮,脱色率显著下降。到第十二轮和第十三轮,脱色率分别下降到50%和30%。该结果从图7中得到了进一步的证实。图中A 、B 、C 、D 曲线分别为空白对照、第十三批次、第十二批次、第一批次降解后的样品。显然,第一批次降解后,底物的两个特征吸收峰完全消失,而第十二批次、第十三批次降解后,仍具有较强的特征吸收峰。说明此时固定化漆酶已不适合再次重复使用了,要保持降解率在90%以上,分批重复使用次数应为8
次。
图6 固定化酶重复分批降解
酸性紫43试验结果
2.6 讨论
到目前为止,漆酶在染料降解方面的应用研究大都采用游离漆酶,利用固定化漆酶的研究报道很少。而且,在现有的研究中采用的载体及固定方式
不同,降解的染料对象也不同,但固定化漆酶处理染料废水的显著优越性已成为共识,并且从国内外相
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工 业 微 生 物
第37卷
关研究报道中也得到了证实。如Pilar Reyes 等[7]将一种粗毛革孔菌所产的漆酶固定在活化的琼脂糖上,可降解38种实验染料中的26种,而游离的漆酶只能降解13种,并且脱色速率加快,经十次反复使用,固定化漆酶活力仍可保持起始酶活的85%;Lu Lei 等[11]以藻酸盐和壳聚糖为载体在适宜的条件下固定了漆酶,其固定率达到46.9%,使用该固定化酶对染料Alizarin Red 进行脱色,2h 内脱色率达到图7 固定化酶分批重复降解酸性紫43部分样品波长扫描图谱
A,空白对照;B,C,D 分别为第13,12,1批次样品
40%左右,三次循环后固定化漆酶活力能保持35.7%。另一方面,在利用合成高分子树脂材料的载体中,聚丙烯酸酯类树脂的机械性能优越,其颗粒度、孔径、比表面积等参数都可根据应用要求在合成时进行调控,因而可以适应不同生物酶的固定化要求。如Bianchid ]等[12利用丙烯酸树脂固定化青霉素酰化酶;王艳芳等
[13]
合成了聚乙二醇二丙烯酸酯
交联聚合物并对脂肪酶进行了固定。但国内外还未见丙烯酸酯类聚合物固定化漆酶的研究报道。上述研究表明,利用自制的丙烯酸酯类聚合物为载体的固定化漆酶对染料酸性紫43具有很好的脱色作用。在适宜的条件下,单批降解4h,染料酸性紫43的脱色率高达98.5%,重复使用八次后,脱色率仍然能保持在90%以上。所以,通过开发新型的固定化材料、研究固定化漆酶及其降解目的底物的适宜条件,能较好地解决游离漆酶在应用中存在的使用
效率低和使用成本高的问题。此外,本研究为扩大降解染料的种类和进一步优化降解工艺及模式打下了基础,也为生物处理染料或印染废水的实际应用提供了新方法。
3 结论
3.1 采用自制复合型载体丙烯酸酯类聚合物固定的漆酶脱色降解染料酸性紫43的适宜条件为:酶用量为12.5U /mL,染料浓度为150mg/L,反应的温度范围在45~55e ,pH 值范围在
4.5~
5.0。在上述条件下降解4h,染料酸性紫43脱色率高达98.5%。
3.2 使用固定化漆酶重复分批处理染料酸性紫43,在使用8次后,脱色率仍然能保持在90%以上,其催化效率得到了很大的提高。
参
考
文
献
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Decolorization and degradation of acid violet43by immobilized laccase
ZHAO L in-guo,JI Yong-xin,L I Qiang,T ANG Y ing
(College of Chemical Engineering Nanjing Forestry U ni versity,Nanjing210037,Ch in a)
Abstract Research on the decolorization and degradat ion of acid violet43by laccase immobilized on a new kind of ac rylic c opolymer were st udied.T he effec t s of dosage of immobilized laccase,concent rat ion of acid violet43,reaction temperature and pH value on the c atalyt ical degradat ion were disc ussed in detail.The results indicated that t he opt imum c ondit ions for dec olorizing and degrading acid violet43by immobilized laccase were as follows:the dosage of immobilized laccase w as12.5U/mL,the conc entration of acid violet43was150mg/L,the react ion t emperature was bet ween45e and55e,and the pH value w as bet ween4.5and5.0.U nder the above opt imum condition,t he decolorization rate of acid violet could reach98.5%.The repeated bat ch decolorization of acid violet43,carried out by immobilized laccase, showed that the decolorization rate still remained over90%after8cycles of operat ion.T hus the cat alytic efficiency of laccase was greatly improved by immobilizat ion.
Key words immobilized laccase;acid violet43;decolorizat ion;degrading condition;opt imizat ion
CNK I中国知识资源总库编号:CAJ-SR2007Z W D1863
中国学术期刊综合引证年度报告(2007)
(p2007Chinese Academic Journal Comprehensive Citation Annual Report)
期刊名称:工业微生物标准刊号:ISSN1001-6678CN31-1438/Q
主办单位:上海市工业微生物研究所
类目名称:环境与生命\生命\昆虫与微生物(ZK1.2.4)
计量指标统计表:
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响因子
即年
指标
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2007年9月30日
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