黑曲霉原生质体诱变及其产纤维素酶条件研究
黑曲霉原生质体诱变及其产纤维素酶条件研究
游庆红，尹秀莲
（淮阴工学院生命科学与化学工程学院，江苏
淮安
223001）
摘要：采用紫外、硫酸二乙酯及复合诱变3种方法对黑曲霉原生质体进行诱变育种，以提高其酶活。结果表明，采用复合诱变效果最好，复合诱变所得菌株的酶活比出发菌株大幅度提高；应用单因素实验优化突变菌株的产酶条件，其最佳产酶条件培养基为：5%蔗糖、1.4%蛋白胨、0.2%磷酸二氢钾、0.05%硫酸镁，在250mL 摇瓶中装液60mL ，10%接种量、29℃下200r/min 培养96h ，酶活达到最大。关键词：微生物；原生质体；诱变；酶活；单因素实验；黑曲霉中图分类号：Q93-3；Q813；Q55；TQ925
文献标识码：A
文章编号：1001－9286（2010）04－0034－04
Study on Protoplast Induced Mutation of Aspergillus
niger and Its Cellulase-producing Conditions
YOU Qing-hong and YIN Xiu-lian
（College of Life Sciences and Chemical Engineering,Huaiyin Institute of Technology,Huaian,Jiangsu 223001,China ）
Abstract :Mutation breeding of protoplast of Aspergillus niger was performed by UV,DES and UV +DES respectively to increase the enzyme ac-tivity of the mutant strains.The results showed that complex mutation (UV+DES)had achieved the best effects (the enzyme activity of the mutant strain improved greatly than that of starting strain).The cellulase-producing conditions of the mutant strain were optimized by single factor experi-ment and the best technical conditions were summed up as follows:culture medium composed of 5%sucrose,1.4%peptone,0.2%KH 2PO 4and 0.05%MgSO 4,60mL liquid filling in 250mL flask,10%inoculation quantity,culture temperature was at 29℃,and fermentation time was 96h at 200rpm.
Key words :microbe;protoplast;mutation;enzyme activity;single factor experiments;Aspergillus niger
基金项目：淮阴工学院青年科学基金项目（HGC0918）。收稿日期：2010－01－25
作者简介：
游庆红（1976-），男，博士，讲师，研究方向为生物化工及生物制药。纤维素类物质是自然界中最丰富的一种可再生资源和能源，如果能利用纤维素酶将天然纤维素降解为可利用的低聚糖，再进一步转化为生物乙醇等物质，对解决当前世界所面临的能源危机和环境污染问题具有深远的意义[1]。据报道，产生纤维素酶的微生物大多是木霉属菌株,而利用黑曲霉生产纤维素酶的报道较少[2]。本文选择黑曲霉作为出发菌株，通过紫外线、硫酸二乙酯对其原生质体进行复合诱变育种，并对其产酶条件进行了优化，以期进一步提高其纤维素酶活力，弥补木霉属菌株的不足。
1材料与方法1.1
材料
黑曲霉30786，购自中国农业微生物菌种保藏中
心；生物传感器（SBA -40型），购自山东省科学院；渗透压稳定剂：0.8mol/L 氯化钾溶液；硫酸二乙酯(DES)溶液：2mL DES 溶于8mL 95%vol 乙醇，备用。
无菌复合酶液：将一定量的纤维素酶、蜗牛酶及溶菌酶溶于渗透压稳定剂，充分振荡溶解后，8000r /min 离心
15min ，用0.22μm 滤膜过滤除菌；配制成0.5%纤维素
酶+0.5%蜗牛酶+1.0%溶菌酶的混合酶液。
PDA 培养基：20%马铃薯，2%蔗糖，2%琼脂，pH 自
然。
再生固体培养基：0.2%酵母提取物，0.5%蛋白胨，
0.2%氯化钠，1%淀粉，1.7%琼脂，加入0.8mol/L 氯化钾溶液作为高渗透压稳定剂，pH5.8。
发酵产酶培养基：1%蛋白胨，0.2%磷酸二氢钾，
0.05%硫酸镁，3%蔗糖，自来水配制，pH 自然。
筛选培养基
[2]
：0.10%磷酸二氢钾，1.0%硫酸铵，
0.025%硫酸镁，1.00%羧甲基纤维素钠，0.25%去氧胆
酸钠，0.02%刚果红，2.00%琼脂，pH 值自然。1.2实验方法
1.2.1纤维素酶活力测定方法[3]
取pH5.0的1%柠檬酸羧甲基纤维素钠缓冲液1.0mL，加入酶液0.5mL，40℃水浴30min。在此条件下，1h由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U/mL)；用生物传感器测定还原糖含量。
1.2.2原生质体的制备与再生
取培养24h摇瓶种子液1mL，置于10mL无菌复合酶液30℃酶解3h，镜检，取适量原生质体悬液涂布于原生质体再生培养基，30℃培养3d，计算再生率。
原生质体再生率=（再生菌落数／原生质体数）×100% 1.2.3原生质体诱变处理
1.2.3.1紫外线诱变(UV)
将适量原生质体悬液置于无菌培养皿中，置于15W 紫外灯下，距离10cm照射不同时间，红灯保护下吸取原生质体悬液1mL，涂布于再生培养基平板上。取未经紫外线处理的原生质体悬液1mL，同样涂布于平板做对照，置于培养箱中30℃恒温培养3d计数，计算致死率。
1.2.3.2硫酸二乙酯(DES)诱变
取2mL原生质体悬液，适当稀释后加入10mL渗透压稳定剂置于无菌三角瓶中，再加入DES乙醇溶液0.2mL，分别振荡处理不同时间，加入0.5mL25%的硫代硫酸钠溶液终止反应，并涂平板，取未经DES处理的原生质体悬液涂平板做对照，置于培养箱中30℃培养3d后计数，并计算致死率。
1.2.3.3UV+DES复合诱变
按上述方法用DES处理原生质体一定时间，再紫外诱变处理一段时间，复合诱变后于再生培养基涂平板，并做对照，置于培养箱中30℃恒温培养3d后计数，并计算致死率。
1.2.3.4致死率的计算
诱变存活率=（诱变后原生质体再生菌落数／未诱变的原生质体再生菌落数）×100%
诱变致死率=1-诱变存活率
1.2.3.5突变株的筛选[4]
选取纤维素水解圈与菌落直径之比大于1.5的菌落接种于斜面培养基上，培养4～5d接种到发酵培养基中，28℃培养120h测酶活，将每一轮诱变所筛选到的最高酶活突变株，作为下一轮诱变的出发菌株。
1.2.4诱变菌株产纤维素酶条件研究
以发酵产酶培养基为基础，将1.2.3.5筛选获得的突变菌株作为出发菌株，250mL摇瓶装液若干，29℃下200r/min振荡培养96h。
2结果与分析
2.1原生质体的再生和诱变2.1.1原生质体的再生
将原生质体接种到再生培养基上，30℃培养3d后，经计算其再生率为25.9%。
2.1.2原生质体的诱变
2.1.2.1紫外线照射对原生质体的诱变致死效应
紫外线照射时间对原生质体致死率的影响结果见表1。
由表1可知，UV照射时间对原生质体致死率有很大影响，当用UV处理150s时致死率达到78.7%，因此选择150s为最佳处理时间。
2.1.2.2硫酸二乙酯诱变对黑曲霉原生质体的致死效应利用硫酸二乙酯作为诱变剂对黑曲霉原生质体进行处理，其致死效果见表2。
由表2可知，当用DES处理50min时，致死率达到79.2%，因此50min为最佳处理时间。
2.1.2.3UV+DES复合诱变对黑曲霉原生质体的致死效应
利用UV与DES复合进行诱变，考察复合诱变对黑曲霉原生质体的致死情况，结果见表3。
用DES处理40min后，采用紫外诱变。由表3可以看出，当用UV+DES处理50s时，致死率达到82.1%。因此，当采用DES处理40min后，再采用50s紫外诱变为最佳处理方式。
2.2原生质体诱变菌株的筛选
将突变株初筛后所获得的正向突变菌株共28个菌株，分别取用以上3种诱变方法中所获得的正向突变菌株各2个菌株，将这6支菌株编号，经紫外线诱变的2株编号为A1、A2，经硫酸二乙酯诱变的编号为B1、B2，经紫外线+硫酸乙酯诱变的编号为C1、C2，各自接种到液体产酶培养基中，在30℃、200r/min条件下摇瓶培养4d 后，测其酶活，并进行比较，结果见表4。以未诱变菌株做
s
0 50 100 150 200 250
(%) 0 51 62 78 88 97
图1不同蔗糖浓度对黑曲霉产纤维素酶酶活的影响图2不同蛋白胨浓度对黑曲霉产纤维素酶酶活的影响图3不同培养基装量对黑曲霉产纤维素酶酶活的影响
空白实验，测得其酶活为9.8U/mL。
经过二轮复筛后得到4株菌保留正突变性状，同时可以看出，UV+DES复合诱变效果要优于其他2种方式。
2.3传代实验
从复筛后获得的4株菌中选择酶活较好的C1和C2菌株进行传代实验，结果见表5。
由表5可以看出，诱变菌株传代3次产酶性能仍较稳定，而其酶活分别比出发菌株有较大的提高，说明诱变效果较好。
2.4培养基组成及产纤维素酶单因素试验
以发酵产酶培养基为基础，依次考察不同碳源浓度、氮源浓度、培养基装液量、接种量对黑曲霉产纤维素酶的影响。
2.4.1蔗糖浓度对黑曲霉产纤维素酶酶活的影响
固定其他条件，分别以2%、3%、4%、5%和6%的蔗糖浓度考察其对纤维素酶酶活的影响，设蔗糖浓度为3%时相对酶活为100%，结果见图1。
由图1可知，蔗糖浓度对纤维素酶酶活有较大影响，当蔗糖浓度为2%～5%时，酶活逐步增大，蔗糖浓度为5%时相对酶活达最大值（130%），之后随着蔗糖浓度增大急速下降。2.4.2蛋白胨浓度对黑曲霉产纤维素酶酶活的影响
以2.4.1优化结果为基础，考察不同蛋白胨浓度对菌株产纤维素酶酶活的影响，设蛋白胨浓度为1%时相对酶活为100%，结果见图2。
由图2可知，当蛋白胨浓度为0.8%～1.4%时，酶活急剧增大，之后酶活逐渐减少，因此，蛋白胨浓度应取
1.4%。
2.4.3培养基装量对黑曲霉产纤维素酶酶活的影响
对于好氧发酵来说，培养基装液量影响通风和搅拌效果，进而会对溶解氧产生巨大的影响，从而影响发酵产酶过程。以2.4.2优化结果为基础，考察在250mL摇瓶中装入不同量培养基，考察装液量对产酶的影响，设装液量50mL时，相对酶活为100%，结果见图3。
由图3可知，培养基装液量在30～60mL时，相对酶活大大增加，装液量在60mL时酶活达到120%，之后随着装液量增大，酶活快速下降。
2.4.4接种量对黑曲霉产纤维素酶酶活的影响
接种量对微生物发酵过程有很大影响，以2.4.3优化结果为基础，分别以3%、5%、8%、10%、12%和15%的接种量考察其对纤维素酶酶活的影响，设接种量8%时相对酶活为100%，结果见图4。
由图4可知，随着接种量的增大，相对酶活逐步增加，在接种量为10%时，相对酶活达132%，这可能是由
图4
接种量对黑曲霉产纤维素酶酶活的影响
于增大接种量，减少了黑曲霉发酵过程中菌体生长的延迟期，进而增加了酶活，之后随着接种量的再次增大，酶活渐渐降低。
3结论
3.1
采用UV 、DES 和UV +DES 3种不同诱变方式对原
生质体进行诱变。结果表明，UV +DES 复合诱变效果较好，共获得28株正突变菌株；选取其中较好的6株进行
稳定性实验，结果获得了2株稳定遗传菌株，其最高酶活可高达17.8U /mL ，而出发菌株的酶活仅为9.8U /mL ，大幅度提高了诱变菌株的酶活。
3.2通过单因素实验对黑曲霉产纤维素酶的培养基组
成及摇瓶发酵工艺进行了初步探讨，发现产酶培养基最佳组成为：1.4%蛋白胨，0.2%磷酸二氢钾，0.001%硫酸亚铁，0.05%硫酸镁，5%蔗糖，pH 自然；250mL 摇瓶发酵最佳工艺为：摇瓶装液量60mL 、接种量10%、29℃下
200r/min 培养96h 。参考文献：
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2008,（5）：29-33.
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[4]
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贵州省酿酒工业协会2010年会员代表大会在贵阳召开
本刊讯：贵州省酿酒工业协会2010年会员代表大会于3月15日在贵阳召开。出席本次大会的领导有贵州省人大副主
任傅传耀、贵州省政协副主席陈海峰、老同志谢养惠、省九三学社副主委赵维娜等，参加会议的还有省内120家白酒企业的领导以及新闻媒体单位。
大会开始，贵州省酿酒工业协会副理事长龙超亚作了酒协的工作报告。龙超亚副理事长分别就全省酒业经济指标运行情况、行业发展宏观政策、企业改组改制、企业科技创新能力、协会工作等方面进行了详实的回顾；对目前贵州省酿酒行业的发展态势进行了分析。总体上，近年来贵州酒业仍然保持持续、健康、稳定的发展态势，产业发展环境得到进一步的改善，行业效益增加明显，产品质量得到提高，贵州酿酒工业正在继续沿着健康有序的方向发展。全省规模以上白酒企业产量从2002年的10.94万千升增至2008年的18.35万千升，销售收入从2002年的26.91亿元增至2009年的138.89亿元，实现税金从2003年的7.88亿元增至2009年的30.9亿元，实现利润从2002年的6.25亿元增至2009年的66.3亿元。此外，贵州啤酒产量从2003年的12万吨增至2009年的27.54万千升，销售收入从2003年的2.47亿元增至2009年的4.64亿元。
会上，贵州省酿酒工业协会理事长季克良作了讲话，季克良首先对酒协工作取得的成绩以及协会理事会和秘书处成立以来的工作作了肯定，同时对今后酒协的工作提出两点建议和要求：一是会员单位要全力支持省酒协工作，积极参加协会召开的会议和举办的活动，多提建议，增加交流，按时足额交纳会费；二是协会秘书处要加强自身建设，提高办事效率。
最后，贵州省经信委主任班程农对协会及其会员为贵州白酒发展所作出的突出贡献表示感谢，也对省委、省人大、省政府、省政协以及省直有关部门及其在座的有关专家，对扶持贵州酒业所付出的心血表示敬意。讲话中，班主任对贵州工业发展、贵州酒业发展的基本思路作了简要介绍。班程农主任还对酒协今后的工作提出了要求：希望酒协积极配合经信委完成“十二五”白酒产业规划；希望
协会和会员单位积极配合省政府、
省经信委共同打造贵州白酒三大基地（黔北基地、黔南基地、黔东基地）建设；希望协会在企业人才建设、促进加大资源整合、标准体系建设完善等方面做出更大的贡献；协会要加强对外交流和合作。最后，班主任提出希望大家共同努力，为贵州经济发展作出更大的贡献。
会议还对贵州省酿酒工业协会的常务理事、理事和秘书处人员进行了调整，对贵州省酿酒工业协会《会费的收取和管理规定》进行了修改。（孙悟）-------------------------------------------------
会议现场
拟南芥原生质体制备转化方法整理
溶液配制 1、纤维素酶解液：
2、PEG4000溶液（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100μl PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）
3、W5 溶液 4、MM G溶液
5、WI溶液 拟南芥原生质体制备转化方法整理 一、土培室播种种植的拟南芥。 二、生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。 三、剪取中部生长良好的叶片用刀片切成0.5 -1 mm宽的叶条。 四、将切好叶条掷入预先配置好的酶解液中（每5-10 ml酶解液大约需10-20片叶子）。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。
五、用真空泵于黑暗中抽30分钟。（此时可配制PEG4000溶液，200和1000 ul 枪头去尖使操作时吸打缓和。） 六、在室温中无须摇动继续黑暗条件下酶解至少3个小时。当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来。（此时预冷一定量W5溶液） 七、显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50 um。 八、在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。 九、先用W5溶液润湿35-75 um的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。 十、用30毫升的圆底离心管100g，1-2分钟离心沉淀原生质体。尽量去除上清然后用10ml 冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体。 十一、在冰上静至原生质体30分钟。 以下操作在室温23℃下进行
十二、100g离心八至十分钟使原生质体沉淀在管底。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。然后用适量MMG溶液（1m）重悬原生质体，使之最终浓度在2X105个/ml。 十三、加入10 ul DNA（10-20微克约5-10kb的质粒DNA）至2ml离心管中。 十四、加入100 ul原生质体（2x104个），轻柔混合。 十五、加入110 ul PEG溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化6-10个样品）。 十六、诱导转化混合物5-15分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更高转化时间）。 十七、室温下用400-440 ul W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。 十八、室温下用台式离心机100g离心2分钟然后去除上清。再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g离心两分钟去上清。
纤维素酶的作用机理及进展的研究
纤维素酶的作用机理及进展的研究 摘要：纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中，本文论述了纤维素酶的性质，重点介绍了纤维素酶的作用机理、应用及其研究进展，并对其研究前景做了展望。关键词：纤维素酶；纤维素；作用机理； 0引言 纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，已被国内外业内人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。 纤维素占植物干重的35%-50%[1],是世界上分布最广、含量最丰富的碳水化合物。对人类而言，它又是自然界中最大的可再生物质。纤维素的利用和转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义[2]。 1 纤维素酶的性质 纤维素酶是一种重要的酶产品，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶活力。纤维素酶是四级结构，,产生纤维素酶的菌种容易退化，导致产酶能力降低。由于纤维素酶难以提纯，实际应用时一般还含有半纤维素酶和其他相关的酶，如淀粉酶（amylase）、蛋白酶（Protease）等。 纤维素酶的断键机制与溶菌酶一样，遵循双置换机制。纤维素与酶相互作用中，是酶被底物分子所吸附，然后进行酶解催化，酶的活性较低，仅为淀粉酶的1/100[3] 纤维素酶对底物分子的分解，必须先发生吸附作用。纤维素酶的吸附不仅与自身性质有关，也与底物密切相关，但纤维素酶的吸附机制总体并未弄清，仍需进一步研究[4]。 2 纤维素酶的作用原理 （1）、纤维素酶在提高纤维素、半纤维素分解的同时，可促进植物细胞壁的溶解使更多的植物细胞内溶物溶解出来并能将不易消化的大分子多糖、蛋白质和脂类降解成小分子物质有利于动物胃肠道的消化吸收。 （2）、纤维素酶制剂可激活内源酶的分泌，补充内源酶的不足，并对内源酶进行调整，保证动物正常的消化吸收功能，起到防病，促生长的作用。 （3）、消除抗营养因子，促进生物健康生长。半纤维素和果胶部分溶于水后会产生粘性溶液，增加消化物的粘度，对内源酶造成障碍，而添加纤维素酶可降低粘度，增加内源酶的扩散，提高酶与养分接触面积，促进饲料的良好消化。 （4）、纤维素酶制剂本身是一种由蛋白酶、淀粉酶、果胶酶和纤维素酶等组成的多酶复合物，在这种多酶复合体系中一种酶的产物可以成为另一种酶的底物，从而使消化道内的消化作用得以顺利进行。也就是说纤维素酶除直接降解纤维素，促进其分解为易被动物所消化吸收的低分子化合物外，还和其他酶共同作用提高奶牛对饲料营养物质的分解和消化。
高产纤维素酶黑曲霉菌株的化学诱变选育
湖北农业科学2009年（责任编辑郑威） mineral forming elements ［C ］．Amsterdam ：Elsevier ，1979． 253－292．［6］ NEALSON K H．The microbial manganese cycle ［A ］． KRUMBEIN W E．Microbial geochemistry ［C ］．Oxford ：Blackwell Scientific Publications ，1983．191－221．［7］ TEBO B M ，BARGAR J R ，CLEMENT B G ，et al．Bio-genic manganese oxides ：properties and mechanisms of forma-tion ［J ］．Annu．Rev．Eath．Planet Sci ，2004，32：287－328． ［8］田美娟，邵宗泽．深海抗锰细菌的分离鉴定［J ］．厦门大学学报 （自然科学版），2006，45（2）：272－276． ［9］ SOLOMON E I ，SUNDARAM U M ，MACHONKIN T E．Multicopper oxidases and oxygenases ［J ］． Chem Rev ， 1996，96：2563－2605． ［10］ TONER B ，FAKRA S ，VILLALOBOS M ，et al．Spatially Resolved Characterization of Biogenic Manganese Oxide Pro-duction within a Bacterial Biofilm ［J ］．Appl Environ Micro-biol ，2005，71（3）：1300－1310． 第48卷第1期 2009年1月 湖北农业科学 H ubei A gricultural S ciences Vol．48No.1 Jan ．，2009 收稿日期：2008－10－18 基金项目：鲁东大学基金项目（20053305） 作者简介：冯培勇（1977－），男，山东日照人，硕士，主要从事微生物产酶的研究工作，（电话）132********（电子信箱）fengpeiyong2004＠yahoo．com．cn 。 纤维素是广泛存在于自然界中的一种由许多葡萄糖基组成的大分子物质，可被存在于微生物中的纤维素酶所降解。纤维素酶指的是降解纤维素酶生成葡萄糖的一组酶的总称。目前认为，完全降解纤维素至少需要3种功能不同且互补的纤维素酶组分，即内切葡聚糖酶（C1酶或EG ）、外切葡聚糖酶（Cx 酶或CBH ）、β－葡萄糖苷酶（简称βG ）［1］。纤维素酶的应用随着工业的发展而日趋广泛，不仅能用于生产葡萄糖、酿酒、饲料工业、纺织行业、环卫污物的处理、农产品加工及生物工程等方面［2］，而且可用于服装加工行业［3］。由于野生型菌种的纤维素酶 活力不高，因此，利用各种诱变手段选育高产纤维素酶生产菌一直是国内外研究的热点。本研究通过化学诱变剂NTG 、硫酸二乙酯和LiCl 对一株黑曲霉菌株进诱变，获得了纤维素酶活性显著提高且遗传性状稳定的突变株。 1 材料与方法 1．1材料 1．1．1出发菌株黑曲霉（Aspergillus niger F1）， 本实验室分离保存。 1．1．2 培养基 ①斜面培养基（PDA 培养基）：马铃 高产纤维素酶黑曲霉菌株的化学诱变选育 冯培勇，宿红艳，张 丽，王艳华 （鲁东大学生命科学学院，山东烟台 264025） 摘要：以1株黑曲霉（Aspergillus niger F1）为出发菌株，经过亚硝基胍、硫酸二乙酯和氯化锂诱变处理，选育出1株纤维素酶高产菌株L1。在适宜条件下，其产CMCase 活力为出发菌株的150．2％。关键词：纤维素酶；化学诱变；黑曲霉中图分类号：Q933 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2009）01－0088-03 Breeding of High-Yield Cellulase Aspergillus niger Mutated by Chemicals FENG Pei－yong ，SU Hong－yan ，ZHANG li ，WANG Yan－hua （College of Life Science ，Ludong University Yantai 264025，Shandong ，China ） Abstract ：A strain ，Aspergillus niger F1，was used as starting strain and mutated by NTG ，DES and LiCl．The strain named L1was bred which could produce high－yield cellulase．Under suitable conditions ，its CMCase activity was 150．2％of the starting strain． Key words ：cellulase ；chemical mutatation ；Aspergillus niger !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
细胞原生质体的制备
细胞原生质体的制备 —植物原生质体分离和活性鉴定 一、实验目的 1.学习植物细胞原生质体分离纯化的方法。 2.了解原生质体活性鉴定的原理。 3.了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理及其过程 二、实验原理 去掉植物细胞壁的方法可以是机械的人工操作，也可以利用酶解法。较早利用机械法制备原生质体的 酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜，必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。其次，还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。 测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法，FAD 本身无荧光，无极性，可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后，由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜，因此有活力的细胞能产生荧光，无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。 PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间
冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗．使原生质体融合得以完成。 PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。 原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是最关键的环节。 三、实验用品 1．材料：绿豆，烟草幼苗叶片，油菜或菠菜或烟草等。 2．试剂： 酶解液(绿豆)：1%(W/V) 纤维素酶，1% (W/V)果胶酶，0.7mol/L 甘露醇;10mmol/L CaCl，2.2H2O，0.7mmol/L KH2PO4，pH 6.8～ 7.0。 13%CPW洗涤液(绿豆)：27.2mg/L KH2PO4，101.0 mg/L KNO3，
植物原生质体的分离及融合
植物原生质体的分离及融合 生93沈睿2009012372同组：古梦婷 实验日期：2011年11月2日 一．实验原理 1.原生质体分离 原生质体指包被在植物细胞壁内的生活物质。细胞壁的主要成分是纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶和果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁，得到原生质体。 2.原生质体融和 诱导原生质体融合的方法有多种，譬如物理法（电场刺激，激光，显微操作等）、化学法（聚乙二醇结合高钙高pH法）和生物法（仙台病毒法等）。本实验用PEG诱导原生质体融和。 PEG是聚乙二醇的英文缩写，相对分子质量在200-6000之间的均可用作细胞融合剂，20-50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连。PEG诱导融合的机理可能是由于其含有醚键而具负极性，与水、蛋白质、碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键。当PEG分子足够长时，可作为相邻原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子。Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。高钙、高pH洗液清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。普遍认为PEG分子能改变各类细胞细胞膜的结构，由于两细胞相接处质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，两细胞接触点处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组。 PEG法诱导的优点是取材方便、操作简易、效率高且效果稳定，缺点是对细胞有毒性。二．实验步骤 1.原生质体的制备 （1）将新鲜的剑兰（唐菖蒲）花瓣洗干净，用吸水纸吸干表面水分；将小平皿洗净，用蒸馏水冲洗后晾干或擦干。 （2）向小平皿中加入适量酶液，用尖头镊剥取剑兰花瓣的上、下表皮，27o C恒温振荡1h 左右。 （3）镜检细胞的酶解情况，若酶解效果不佳，可延长酶解时间，并用吸管吹吸。 （4）将酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，去除未被酶解的大块组织，用洗涤液冲洗平皿若干次，收集冲洗的液体。 （5）配平后，在700rpm下离心5min，弃去上清液；加洗涤液约3ml，吹打均匀，700rpm、5min重复离心一次，彻底去除酶液。 （6）加200μl洗涤液，悬浮原生质体。 （7）镜检原生质形态和浓度，看看是否有碎片；如碎片较多，利用蔗糖溶液漂浮1-2次。（8）蔗糖漂浮方法： 取部分原生质体悬浮液，加入洗涤液定容至1ml。用注射器吸取20%蔗糖溶液，装上长针头后小心插入盛有原生质体悬浊液的离心管底部，缓缓、轻柔地将蔗糖溶液挤出。由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面。配平后在700rpm下离心5min。用装有长针头的注射器小心吹吸底部沉淀，连同底部碎片一起将底层蔗糖溶液吸出，再小心除去上清液，得到纯净完整的原生质体。 2.PEG融和
黑曲霉生产纤维素酶工艺设计
黑曲霉生产纤维素酶工艺设计 1. 维素酶 1.1 纤维素酶的组分 纤维素酶是水解纤维素及其衍生物生成葡萄糖的一组酶的总称，是由多种水解酶组成的一个复杂酶系。纤维素酶是起协同作用的多组分酶系，国内外多数根据纤维素酶的底物及作用的位点和释放的产物将其分为三类:（1）葡聚糖内切酶(endo-l，4-D-glueanase，EC3.2.1.4)来自真菌的简称EG，又称CMC一Na酶;来自细菌的简称Lne)。这类酶不能水解结晶纤维素如棉花和微晶纤维素等，主要作用于纤维素内部的非结晶区和一些可溶性的底物如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素，随机降解β-1，4糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素、纤维二糖和葡萄糖, 其分子量大小约23-146KD。(2) 葡聚糖外切酶(exo-1，4-β-D-glucanase，来自真菌简称CBH;来自细菌简称Cex)。作用于纤维素线状分子末端，分解1，4-β-D糖苷键，每次从底物的非还原端切下一个纤维二糖分子，故又称纤维二糖水解酶，可以水解无定形纤维素和微晶纤维素，对棉花有微弱的作用分子量约38-118KD。(3)β-葡萄糖苷酶(β-D一glucosidase，简称BG)纤维素大分子首先在GE酶和CBH酶的作用下降解为纤维二糖，再由BG酶水解成二个葡萄糖分子。其分子量约为76KD。 1.2纤维素酶的作用机制 目前对纤维素酶的分子机制大致有3种假说:改进的Cl一Cx假说、顺序作用假说和竞争吸收模型。它们都认为，纤维素酶降解纤维素时，先吸附到纤维素表面，然后其中的内切酶在葡聚糖链的随机位点水解底物产生寡聚糖，外切酶从葡聚糖链的还原或非还原端进行水解产生纤维二糖，β-葡萄糖苷酶水解纤维素二糖为葡萄糖。在纤维素溶解糖化过程中内切酶和外切酶的比值会显著地影响纤维素溶解活力，而且在纤维素糖化过程中β-葡萄糖普酶组分的加入会使这种协同作用大大加强[1]，应该注意的是，这种协同作用不仅作用顺序不是绝对的，而且各酶的功能也不是简单、固定的。研究表明，GE和CHB都能引起纤维素的分散和脱纤维化(沿纤维素的经度轴方向分层，形成更薄更细的亚纤维)，这样纤维素的结晶结构被打乱，导致变形，使纤维素酶能深入纤维素分子界面之间，
原生质体制备
1.影响原生质体数量和活力的因素 （1）细胞壁降解酶的种类和组合 不同植物种类或同一植物种的不同器官以及它们的培养细胞，由于它们的细胞壁结构组成不同，分解细胞壁所需的酶类也不同。例如，叶片及其培养细胞用纤维素酶和果胶酶，根尖细胞以果胶酶为主附加纤维素酶或粗制纤维素酶（Driselase酶），花粉母细胞和四分体期小孢子用蜗牛酶和胼胝质酶，成熟花粉用果胶酶和纤维素醇。 （2）渗造压稳定剂 用酶法降解细胞壁前，为防止原生质体的破坏，一般需先用高渗液处理细胞，使细胞处于微弱的质壁分离状态，有利于完整原生质体的释放。这种高渗液称为渗透压稳定剂。常用的滲透压稳定剂有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类（KCI、MgSO4.7H2O）等。在降解细胞壁时，渗透压稳定剂往往和酶制剂混合使用。滲透压稳定剂中，用得最多的是甘露醇，常用于烟草、胡萝ト、柑橘、蚕豆原生质体制备；蔗糖常用于烟草、月季等；山梨醇常用于油菜原生质体制备。滲透压稳定剂种类及浓度的选择应根据植物种类而异，例如胡萝ト用0.56mol ／L甘露醇，月季用14％蔗糖，柑橘用0.8mol／L甘露醇，蚕豆用0.7mol／L甘露醇，烟草的四分体用7％熊糖，烟草的成熟花粉用13％甘露醇。 （3）质膜稳定剂 质膜稳定剂可以增加完整原生质体数量、防止质膜破坏，促进原生质体胞壁再生和细胞分裂形成细胞团。如在分离烟草原生质体时，在酶液中加人入葡聚糖硫酸钾，一旦洗净确液进行培养，原生质体很快长壁并持续细胞分裂形成细胞团。而未加葡聚糖硫酸钾的对照，原生质体经一周培养即解体。常用的原生质膜稳定剂有葡聚糖硫酸钾、MES、氯化钙、磷酸二氢钾等。 （4）pH的影响 分离原生质体时，酶液的pH是值得注意的问题。因为降解酶的活力和细胞活力最适pH是不一致的低pH时（＜4.5），酶的活力强，原生质体分离速度快，但细胞活力差，破坏的细胞较多；pH偏高时，酶活力差，原生质体分离速度慢，完整的原生质体数目较多。分离原生质体时，酶液的pH因植物种类不同而有差异，如胡萝ト为5.5、月季为5.5～6.0、烟草为5.4～5.8、柑橘为5.6、蚕豆为5.6～5.7。 （5）温度影响 制备生质体时，一般在26土1℃条件下酶解。 （6）植物材料的生理状态 一般应选择植物体细胞分裂旺盛的部分进行取材。采用那些颗粒细小、疏松易碎的胚性愈伤组织和由其建立的胚性悬浮细胞系，更容易获得高质量的原生质体。要得到良好的供体材料，必要时应对材料进行预处理及预培养。 2.植物原生质体的纯化 材料经过一段时间的酶解后，需要将酶解混合物中破碎的原生质体、未去壁的细胞、细胞器及其他碎片去除出去。纯化原生质体的常用方法有过滤、离心、飘浮法，在实际操作中一般联合运用这三种方法。 1）过滤法用滤网过滤酶解混合物，滤去未被酶解的细胞、细胞团及组织块 2）离心法利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于离心管底部。 3）飘浮法采用比原生质体比重大的高渗溶液（如蔗糖、Ficoll溶液），使原生质体漂浮在溶液表面。
纤维素酶的应用
纤维素酶的应用 1 在动物饲料中的应用 纤维素酶的应用开始于上世纪80年代早期，首先应用于动物饲料中。它的营养作用机理主要在于以下几个方面。 1）毁植物细胞壁,释放胞内养分。植物细胞内的营养物质由植物细胞壁包裹,植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶组成。纤维素酶可在半纤维素酶、果胶酶等协同作用下破坏细胞壁,使细胞内容物释放出来以利于进一步降解提高吸收率,同时也增加了非淀粉多糖的消化进而改善了高纤维饲料的利用率。 2）补充动物内源酶的不足,剌激内源酶的分泌。虽然草食动物能通过体内的微生物合成部分纤维素酶,但酶量有限,使粗纤维的消化吸收受到一定限制,而补充纤维素酶制剂则可明显提高对纤维素的利用率。对鸡、猪等单胃动物而言,其体内缺乏内源性纤维素酶,补充纤维素酶可以弥补这一缺陷,提高对纤维素的消化利用能力。同时,添加纤维素酶后,动物消化道酶系的组成、酶分泌量及活性可以得到改善,并改善消化道环境,增加酸度,激活胃蛋白酶。因此,畜禽日粮中添加纤维素酶对幼龄动物及病态和应激状态下的成年畜禽尤为重要,因为此时动物消化酶分泌量明显下降,添加纤维素酶效果会更为显著。 3）缓解或消除饲料抗营养因子的影响。果胶、半纤维素、β- 葡聚糖及戊聚糖能部分溶解于水中并产生粘性,增加了动物胃肠道内容物的粘度,对内源酶来说是一个屏障,降低了营养物质的消化吸收。而补充纤维素酶后,能在半纤维素酶、果胶酶、β- 葡聚糖酶等的协同下将纤维素、半纤维素、果胶、戊聚糖等大分子物质降解为单糖和寡糖,从而降低粘稠度,促进内源酶的扩散,增加养分的消化吸收。 4）促进小肠对营养物质的吸收。纤维素酶具有维持小肠绒毛形态完整,促进营养物质吸收的功能。 在实际生产中通常将纤维素酶与半纤维素酶、果胶酶、β- 葡聚糖酶等组成复合酶制剂用于
植物原生质体培养方法
植物原生质体培养方法 1 植物原生质体培养的简史 植物细胞原生质体, 在植物学上指植物细胞通过质壁分离后, 可以和细胞壁分开的那部分细胞物质。原生质体分离纯化后, 须在适当的培养基上应用适当的培养方法, 才能再生细胞壁, 并启动细胞持续分裂, 直至形成细胞团、长成愈伤组织或胚状体、分化和发育成苗, 最终再生完整植株。其中, 选择合适的培养方法始终是原生质体培养中最基础也是最关键的一环。 植物原生质体培养方法起源于植物单细胞培养方法。早在1902 年,Haberlant 通过实验就预言: 体外培养单个细胞可通过其分裂得到培养组织。直到1954 年, 植物单细胞培养才获得成功。M uir 将培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上而得到了它们的单细胞克隆, 并建立了看护培养的方法。悬滴培养由De Ropp1954 年开创, 1960 年Jones 等完善了这一技术, 并建立了微室培养的方法。同年, Cock ing 应用酶法分离原生质获得了成功, 从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。随着多种适用于原生质体分离的商品酶的出现, 原生质体的培养方法也得到了不断的改进, 现在常用的液体浅层培养、双层培养法、琼脂糖包埋法、琼脂岛培养法以及使用条件培养基或饲喂培养等技术, 使原生质体培养获得了极大的成功。 2 原生质体培养方法 2. 1 液体培养法 2. 1. 1 液体浅层培养(L iquid th in culture) 这是目前较常用的原生质体培养方法, 一般适用于容易分裂的原生质体, 将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层, 封口进行培养。这种方法操作简单, 对原生质体损伤较小, 且易于添加新鲜培养物。用这种方法, J.T rmeouillaax 等成功地培养长春花冠瘿组织的激素自养型的原生质体单细胞克隆; H isato Kunitake 等也在改良的M S 培养基上培育了Eustom a g rend if lorum (龙胆科, 原产美国) 原生质体再生植株。但这种方法也常使原生质体分布不均匀, 发育的原生质体之间产生粘连而影响其进一步的生长和发育, 尤其是难以定点观察单个原生质体的命运。王吉吉之等认为液体浅层培养在培养过程中, 应经常轻轻晃动培养基, 以增强通气, 促进愈伤组织形成。 2. 1. 2 微滴培养(D rop let culture) 微滴培养是由液体浅层培养发展起来的一种方法, 它克服了后者局部密度过高和原生质体粘聚的缺点。此方法是将0. 1m l 或更少的原生质体悬浮液用滴管滴于培养皿底部, 封口后进行培养。为避免微滴蒸发, 可将培养器皿置于湿润的环境中, 或在微滴上覆盖矿物油。此法适用于融合体及单个原生质体培养, 尤其适用于较多组合的实验。为了比较黄瓜两个品系在不同的植板密度以及在不同的激素水平下原生质体生长情况, Z. K. Punja 等选用了此方法获得很好的效果; 同样, S. V essabutr 等培养百脉根时也比较了不同预处理、不同酶液组合对原生质体培养的影响。 2. 2 固体培养—— 琼脂糖平板法(A grose beadmethed) 固体培养作为凝固剂的物质可以是琼脂、琼脂糖或Gellan gum , 近来很多实验证明, 琼脂糖尤其是低熔点的琼脂糖是一种良好的培养基凝固剂, 并且具有促进原生质体细胞分裂的作用。琼脂糖平板法是将原生质体纯化后悬浮在液体培养基中, 然后与热融并冷却到45℃的琼脂糖按一定比例混合, 轻轻摇动使原生质体均匀分布, 凝固后封口培养。由于原生质体彼此分开并固定了位置, 就避免了细胞间有害代谢产物的影响, 既便于定点观察, 又有利于追踪原生质体再生细胞的发育过程。Z. K. Punja 等证明琼脂平板法比微滴培养及液体浅层培养具有更高的植板率; 甘霖等也得出同样结论。但此种方法对操作技术要求比较严格, 尤其是温度一定要适宜; 添加低渗透压的培养基和转移再生愈伤组织也比较繁琐, 而且培养的原生质体极易褐变死亡。 2. 3 液体2固体结合培养 2. 3. 1 双层培养法(A grose2liquid doublelayer) 这种方法即在培养皿的底部先铺一薄层含或不含原生质体或细胞的固体培养基,
纤维素酶的水解机制和作用条件
纤维素酶的水解机制和作用条件 纤维素酶对大家来说已经不陌生，现在已经广泛应用在工业生产过程中，纤维素酶在植物提取和饲料中的功能是其他产品所无法替代的。然而纤维素酶在其发展过程中经历了漫长的过程，随着越来越多的生物学家对其进行研究，纤维素酶的水解过程才逐渐被人们掌握。下面详细介绍纤维素酶的研究过程和其水解机制。 1 纤维素酶的研究过程 在自然界中,绝大多数的纤维素是由微生物通过分泌纤维素酶来进行降解的。早在l850年,Mifscherlich己经观察到微生物分解纤维素现象。但纤维素酶的研究则是从1906年Seilliere在蜗牛消化液中发现了分解天然纤维素的酶,以后才逐渐开始的。1912年 Pringsheim 从耐热性纤维素细菌中分离出纤维素酶。1933年Grassman分辨出了一种真菌纤维素酶的两个组分。1954年,美国陆军 Natick实验室开始研究军用纤维素材料微生物降解的防护问题,后来发现纤维素经微生物降解后,可产生经济、丰富的生产原料,并且有望解决自然界不断产生的固体废物问题,于是纤维素酶得到了广泛的关注。 2 纤维素酶的水解机制 关于纤维素酶水解的机制至今仍无完全统一的认识,目前普遍接受的理论主要为协同理论。该理论认为,纤维素的酶水解过程是由C1酶、Cx酶、β-葡萄糖苷酶系统作用的结果,水解过程为:先是Cx酶作用于纤维素分子非结晶区内部的β-1, 4糖苷键,形成短链的β-寡聚糖;C1酶作用于β-寡聚糖分子的非还原末端,以二糖为单位进行切割产生纤维二糖;接着,部分降解的纤维素进一步由C1酶和 Cx酶协同作用,分解生成纤维二糖、纤维三糖等低聚糖;最后由β-葡萄糖苷酶作用分解为葡萄糖。纤维二糖对CBH和EG有强烈抑制作用,β-葡萄糖苷酶 BG将纤维二糖和纤维三糖水解为葡萄糖,从反应混合物中除去抑制。
水稻原生质体制备及转化方法
原生质体制备及转化 1.去皮的日本晴种子在75%的酒精中消毒1 min。然后用 2.5%的次氯酸钠消毒20 min。用无菌水洗至少5次，然后在1/2 MS培养基上，12 h光照（大约150umol m-1 s-1）十二小时黑暗，26 ℃培养7-10天，提前一天烧好去尖的黄蓝枪头备用。 2.取40-60棵水稻幼苗的茎和叶鞘的绿色组织。 3.将一捆水稻植株（大概10棵幼苗）用剃刀一起切成大约0.5 mm的小段。 4.将小片段立刻放进0.6 M的甘露醇中，黑暗中放置10 min。 5.用100目钢制滤网去掉甘露醇，将小片段放在加入15mL酶液的25mL锥形瓶中， （1.5% Cellulase RS，0.75% Macerozyme R-10，0.6 M甘露醇，pH5.7的10mM MES，10mM CaCl2，0.1% BSA），28℃摇床中轻轻摇晃（50rpm），黑暗孵育4-6 h。 6.此时配置40%的PEG4000，酶消化后，分三次加入等体积15mL的W5溶液（154 mM NaCl，125mM CaCl2,5 mM KCl，pH 5.7的2mM MES）。用手充分摇晃10s。 7.用400目钢制滤网过滤得到原生质体在圆底管中。 8.80g离心（升降速度设为1档）5min，缓慢吸走上清液。 9.沿壁缓慢加入4mL W5溶液，轻轻悬浮，再离心80g，5min，弃上清 10.沿壁缓慢加入4mL Mmg溶液，离心80g，5min，弃上清 11.再加Mmg溶液，补至每个样品100μl原生质体 12.分装2mL离心管，每100μl原生质体，加入20μl质粒和120μl新鲜制备的 40%的PEG4000，混匀 13.28℃避光静置转化20--25min 14.加1.5 mL W5溶液混匀，80g离心3min，弃上清。 15.重复步骤14 16.加2mL W5溶液重悬，轻轻混匀，移到细胞培养板，锡箔纸包裹避光28℃避 光静置培养15-20小时 17.培养完成后，将培养板中沉淀的原生质体轻轻混匀，吸到2 mL离心管中，80g 离心3min，弃上清，保留100μl上清液 18.共聚焦显微镜观察拍照 配制溶液方法：
【文献综述】纤维素酶的概述
文献综述 生物工程 纤维素酶的概述 【摘要】纤维素作为地球上分布广，含量丰富的碳水化合物，它的降解是自然界碳素循环的中心环节。纤维素的利用和转化对于解决目前世界能源危机，粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。本文就纤维素酶的应用进行一个简要的概述。 【关键词】纤维素酶；纤维素酶的实际应用：应用前景 1. 纤维素的概况 1.2 纤维素酶的分类 纤维素酶的组成比较复杂,通常所说的碱性纤维素酶是具有3～10 种或更多组分构成的多组分酶。根据其作用方式一般又可将纤维素酶分为3 类: 外切β- 1, 4-葡聚糖苷酶( 简称CBH) 、内切β-1, 4- 葡聚糖苷酶( 简称EG)和β- 1, 4- 葡萄糖苷酶( 简称BG) [1]。在这3 种酶的协同作用下,纤维素最终被分解成葡萄糖。到目前为止, 还没有能够在碱性条件下分解天然纤维素的纤维素酶。碱性纤维素酶是一种单组分或多组分的酶, 只具有内切β- 1, 4- 葡聚糖苷酶( 又称CMC酶) 的活性, 有的还与中性CMC 酶组分共存[2]。 1.3 纤维素酶的作用机理 纤维素酶在提高纤维素、半纤维素分解的同时, 可促进植物细胞壁的溶解使更多的植物细胞内溶物溶解出来并能将不易消化的大分子多糖、蛋白质和脂类降解成小分子物质, 有利于动物胃肠道的消化吸收[3]。同时, 纤维素酶制剂可激活内源酶的分泌, 补充内源酶的不足, 并对内源酶进行调整, 保证动物正常的消化吸收功能, 起到防病、促生长的作用, 消除抗营养因子,促进生物健康生长。半纤维素和果胶部分溶于水后会产生粘性溶液, 增加消化物的粘度, 对内源酶造成障碍, 而添加纤维素酶可降低粘度, 增加内源酶的扩散, 提高酶与养分接触面积, 促进饲料的良好消化。而纤维素酶制剂本身是一种由蛋白酶、淀粉酶、果胶酶和纤维素酶等组成的多酶复合物, 在这种多酶复合体系中一种酶的产物可以成为另一种酶的底物, 从而使消化道内的消化作用得以顺利进行[4]。也就是说纤维素酶除直接降解纤维素, 促进其分解为易被动物所消化吸收的低分子化合物外, 还和其他酶共同作用提高奶牛对饲料营养物质的分解和消化[5] 2. 纤维素酶的一些历史及研究成果 在吴琳,景晓辉,黄俊生[3]的产纤维素酶菌株的分离，筛选和酶活性测定中，他们利用“采样—培养—分离单菌落—初筛—复筛—测OD值”的方法筛选出分解纤维素能力较强的菌株。[结果]经反复培养和划线分离从80份样品中初选出35株具有分解纤维素能力的菌株。其中10株由白转绿,长势较
黑曲霉发酵生产纤维素酶实验1
黑曲霉发酵生产纤维素酶实验 一、实验目的 1、了解纤维素酶的生产工艺和原理 2、掌握液体发酵和固体发酵工艺 3、学会DNS法测定还原糖含量的方法和原理 二、实验原理 纤维素酶可以用于一切含纤维素的生物质的降解，具有广阔的应用前景。高产纤维素酶的微生物主要有木霉属、曲霉属、根霉属，黑曲霉所产的纤维素酶中β-葡萄糖苷酶活力高，能避免酶解产物纤维二糖的阻遏作用，而且安全无毒，故而成为生产纤维素酶的主要菌种之一。纤维素酶是诱导酶，故发酵生产时需有纤维素物质作诱导剂。 以羧甲基纤维素钠作底物，用发酵所得纤维素酶对底物进行酶解，测定酶解液中的还原糖含量（以葡萄糖计），可以计算酶活力高低。还原糖与DNS反应形成棕色物质，颜色深浅与糖含量成正比。 三、材料与试剂配制 1、生产菌种：黑曲霉 2、斜面（活化）培养基：酵母膏0.4%，蛋白胨0.6%，可溶性淀粉1%，葡萄糖0.9%，马玲薯浸出液7%，琼脂2%，陈海水（或人工海水）配制，pH7.0-7.4。 3、人工海水：NaCl = 24 g/L ;MgSO4·7H2O = 7.0 g/L ;NH4NO3= 1 g/L ;KCl = 0.7 g/ L ; NaH 2PO 4 = 2.0 g/ L ;Na 2 HPO 4 =3.0 g/ L ,pH7.4。 4、微量元素液：FeSO4·7H2O 5.0mg/L，MnSO4·H2O 1.6mg/L， ZnSO 4· 7H 2 O 1.4mg/L，CoCl 2 2.0mg/L，加蒸馏水200ml使之溶解。 5、液体发酵产酶培养基：麸皮作碳源 3 g，氯化铵或硫酸铵作无机氮源1 g，蛋白胨0.05g作有机氮源，人工海水100 ml（含1%微量元素液），自然pH值。 6、固体发酵产酶培养基：麸皮：稻草粉=2：1作碳源5 g，人工海水
植物组织培养 第十章 原生质体培养
第十章原生质体培养 ?教学目的与要求： ?深入了解植物细胞结构功能与细胞全能性表达的关系，掌握原生质体的分离以 及培养过程中渗透压和激素的调控原理与技术。 第一节、原生质体研究概况 一、原生质体的概念 ?原生质体(p r o t o p l a s t)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露 细胞。 二、原生质体研究进展 ?据统计，目前已有49个科，146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再 生植株（1993）。其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。 三、原生质体研究的意义 ?1、除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，同时叶为制造新杂种开辟 了道路。2、原生质体可摄入外源D N A，细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。3、获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。 第二节、原生质体的制备 1、用于分离原生质体的材料准备 ?无菌试管苗叶片 ?上胚轴和子叶 ?培养细胞 2、酶处理 ?原生质体分离常用的商品酶 ?纤维素酶类 ?果胶酶类 ?半纤维素酶 酶溶剂及其渗透压 ?酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。 ?渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。 ?酶浓度及酶解时间 ?酶解时间 ?酶浓度酶解温度 3、原生质体的收集和纯化 ?飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、P e r c o l l、F i c o l l。 ?P e r c o l l是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20m o s m／k g H2O), 粘度也很小，可形成高达1.3g／m l密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于P e r c o l l 扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，P e r c o l l不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。
纤维素酶的结构与功能综述
研究生课程作业（综述）题目：纤维素酶的结构与功能 食品学院食品工程专业 学号 学生姓名 课程食品酶学 指导教师 二〇一三年十二月
纤维素酶的结构与功能 摘要：人类的生命活动离不开酶，生物体的一切新陈代谢活动都离不开酶，并且工业酶产业正在迅速发展。本文简单阐述了酶的结构与功能，重点以纤维素酶为例子，阐述它的来源、结构、分类、催化机制以及在各行业的应用，并对纤维素酶的发展前景作了一定展望。 关键词：纤维素酶结构家族功能 The structure and function of cellulase Abstract:Human's life activities is dependent on the enzyme,and all the metabolic activity of organisms cannot leave the enzyme, and industrial enzyme industry is developing rapidly.This article simply expounds the structure and function of enzymes.The key to cellulose enzyme as an example,expounds its source,structure, classification,catalytic mechanism and application in various industries,and lastly expect the development prospect of cellulase. Keywords: cellulase structure family function 1
黑曲霉产纤维素酶液体发酵
黑曲霉产纤维素酶液体发酵 工艺优化和控制 纤维素酶是生物降解含β-1,4 糖苷键的纤维素生成葡萄糖的一类复合酶的总称。纤维素酶也是具有纤维素降解能力酶的总称，纤维素酶系包括3 种水解酶，即内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，只有各组分酶共同作用才能将纤维素彻底水解为葡萄糖[1-2]。纤维素酶已经广泛应用于酿造果汁与蔬菜加工，粮食工、食品、饲料、造纸、中草药有效成分的提取，以及纺织工业、采油工程、废水处理以及能源制造等各个方面[3-8]。目前用于生产纤维素酶的微生物大多属于丝状真菌，研究较多的有木霉属、曲霉属、根霉属和漆斑霉属，其中曲霉是公认产纤维素酶最高的菌种之一[9]。而黑曲霉是公认安全(GRAS)的微生物，用其生产酶制剂安全、可靠，不产生毒素，而且生长快、发酵周期短，具有明显的优越性，可望用于食品和医药等领域。植物纤维是再生的生物资源，笔者是以植物纤维为碳源，对黑曲霉（A. niger）生产纤维素酶条件进行研究，为利用植物纤维素工业化生产纤维素酶提供技术参数。故希望通过对黑曲霉A3 产纤维素酶的液体发酵产酶条件的优化，以获得酶的高产量，为纤维素酶的生产应用奠定基础。 1．材料与方法 1.1 菌种 黑曲霉A3(Aspergillus niger A3)：当地采取。 1.2 培养基及培养条件 1.2.1 营养盐液Mandels 氏营养盐液[3]，再加入NaNO3 4.0 g/L。 1.2.2 斜面培养基(1)菌种保藏培养基(g/L)：麸皮5，蛋白胨1，琼脂20，用 营养盐液配制；(2)产孢子培养基：PDA 培养基。 1.2.3 发酵产酶基础培养基产纤维素酶基础培养基(g/L)[4]：玉米芯80，用改良Mandels 氏营养盐液配制，250 mL 三角瓶30 mL 装液量，起始pH5.5～6.0。 上述所有培养基均在1.0×105 Pa、121 ℃灭菌30 min。 1.2.4 斜面培养将接种后的斜面于28 ℃培养4～5 d。 1.2.5 摇瓶发酵产酶培养将培养好的新鲜产孢子斜面上的孢子制备成孢子悬 液，接种3 mL(1.2×108 个孢子)到发酵培养基中，于28 ℃、200 r/min 振荡 培养。
植物原生质体培养
原生质体的培养 1. 原生质体的分离与纯化 原生质体培养的意义 (1)再生植株由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体； ②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。 原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。 (2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。 一、原生质体(protoplast)的分离 （一）材料来源 原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。至今从植物体的几乎每一部分都可分离得到原生质体。并且能从烟草、胡萝、矮牵牛、茄子、番茄等70种植物的原生质体再生成完整的植株。此外，原生质体融合，体细胞杂交的技术也得到广泛的应用。 （二）分离方法 1.机械分离法 1982年，Klercker第一次用机械方法从Stratiots aloides中获得原生质体.他们的做法是首先使细胞发生质壁分离,然后切开细胞壁释放出原生质体. 2.酶法分离 (1)酶的种类及特点 构成植物细胞壁的三个主要成分是： ①纤维素酶类：占细胞壁干重的25％至50％不等。 ②半纤维素酶类：平均约占细胞壁干重的53％左右。 ③果胶酶类：一般占细胞壁的5％。分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素 酶和果胶酶。