16SrRNA基因技术在环境科学领域中的应用

?综　述?

收稿日期:2003204210

作者简介:乐毅全(1962-),男,浙江宁波人,现就读于同济大学环境工

程专业博士研究生,讲师。

16S rRNA 基因技术在环境科学领域中的应用

乐毅全,顾国维

(同济大学污染控制与资源化国家重点实验室,上海　200092)

摘要:随着分子生物学的发展,16S rRNA 基因技术被逐渐应用到环境科学领域中。目前在环境保护和治理中,该技术主要被

用于鉴定污染物的生物降解菌和分析环境样品中的微生物群落多样性,由于它不必将微生物培养分离出来,也就避免了在培养过程中可能出现的微生物丢失的情况。本文对16S rRNA 基因技术及其在环境科学领域中的应用现状和发展作了一简要介绍,并对16S rRNA 基因技术存在的不足进行了讨论。关　键　词:16S rRNA 基因序列;DNA 扩增;多样性分析

中图分类号:Q 938 文献标识码:A 文章编号:100123644(2003)0620001204

The Application of 16S r RNA G ene T echnology on E nvironmental Sciences

L E Y i 2quan ,GU Guo 2wei

(N ational Key L aboratory of Pollution Cont rol and Resources Reuse ,Tongji U niversity ,S hanghai 200092,China )

Abstract :With the development of molecular biology ,the 16S rRNA gene technique has been gradually used in environmental sci 2

ences.Now ,this technique has been mainly applied to identify the pollutant -biodegradation bacteria and to analyse the diversity of mi 2croorganism community in environmental samples.Because it is unnecessary to culture the microorganisms by traditional methods ,it can avoid the situation of losing the microorganisms during the culture.In this paper ,it briefly introduces that the development and the use of 16S rRNA gene technique on environmental sciences.The disadvantage of 16S rRNA gene technique is also discussed.

K ey w ords :16S rRNA gene sequence ;DNA amplification ;diversity analysis

1　微生物体内的16S rRNA 基因及其应

用

核糖体存在于每个合成蛋白质的细胞中,在原核微生物中,核糖体是分散在细胞质中的亚微颗粒,细菌的核糖体由三种相对分子量不同的rRNA 组成,分别为5S rRNA 、16S rRNA 和23S rRNA 。其中16S rRNA 的长度在1475-1544核苷酸之间,含有少量修饰碱基,16S rRNA 的结构十分保守。

Pace 等[1]在20世纪80年代首先利用rRNA 基因(rDNA )来确定环境中的微生物,通过对5S rRNA 基因的序列分析来研究微生物的生态和进化,由于5S rRNA 基因相对较小(约120个核苷酸),携带的信息较少,而随后开展的16S rRNA 基因序列可以携带更多的信息,效率更高。

以16S rRNA 基因为基础,结合DNA 扩增(PCR )技术,近年来发展出一种新的分子生物学手段,即通过对16S rRNA 基因的DNA 序列分析,可以分析细菌的种类信息,并且已经逐渐成为微生物分类和鉴定中非常重要而且有用的指标和手段。目前在生物学上,有关16S rRNA 基因的工作很多,集中在以下两个方面:111　对未知生物的分类鉴定

相对于传统的微生物形态、生理生化指标,DNA 由于其稳定性和保守性,逐渐为人们所关注,随着生物学研究手段的发展,把生物的DNA 信息作为生物分类鉴定的指标已经成为可能,如G +C %、DNA 杂交、DNA -rRNA 杂交和16S rRNA 碱基顺序分析等。

rRNA 由于含量大,已成为细菌系统分类学研究中最常用的方法,其中16S rDNA 序列的相对稳定而又高度保守,可以为细菌鉴定提供相对稳定可靠的信息。目前,已有10000种以上的细菌的16S rDNA 序列被报道,并且每年以很快的速度补充到G enebank 中。利用特异的引物对未知的来自细菌的DNA 样品

进行PCR扩增,构建16S rDNA基因文库,通过测序,再与已知的16S rDNA序列进行同源性比较,就可以对未知细菌进行鉴定。

112　系统发育(亲缘关系)的研究

根据16S rDNA序列的相似性,可以构建细菌各个种属的系统发育树,比较细菌种属之间亲源关系的远近,为研究细菌的系统发育提供有力的证据。

如链霉菌是一大类重要的放线菌群,在自然界分布广泛,但长期来,其分类主要依据表型特征,造成混乱。而分子生物学方法为改变这种状况带来可能。Rashidian等人(1999)[2]以16S rRNA基因全序列作为分子指针对青色链霉菌(S1craneys)种群进行系统进化分析,指出了前人在分类上的错误;我国的徐平等人[3]用包含16S rRNA基因V-2高变区在内的120bp长核苷酸序列,对300多株已知该区段序列的链霉菌进行分析,得到较为完整的系统进化树。

在其他种类的细菌分类研究中,16S rRNA基因分析,同样得到广泛的应用。东秀珠等[4]用16S rD2 NA的同源性揭示了双歧杆菌与有关细菌的关系。赵庆新等[5]研究了鲤鱼科8种鱼中9种肠道菌群的分布,并利用从G enBank中调取的这9种肠道细菌菌属的43个种或亚种的16S rDNA序列构建NJ树和MP树,来研究它们的系统演化关系。另外,根瘤菌的系统发育研究中,16S rDNA的基因测序,也成为重要的手段[6～8]。

16S rRNA基因技术,同样在微生物多样性的分析中得到广泛应用。如将该技术与ARDRA(Ampli2 fied rDNA Restriction Analysis)技术结合,依据原核生物rDNA的保守性,将扩增的rDNA进行酶切,然后通过酶切图谱来分析菌间的多样性,该法无需分纯试样,简便、高效,是一种很有发展前途的方法[9-10]。应用该方法对非豆科植物共生的结瘤固氮放线菌Frankia菌的多样性进行研究,从酶切图谱上可以看出在Frankia菌间存在极其丰富的遗传多样性[11]。

2　16S rRNA基因技术在环境科学领域中的应用

在环境科学研究工作中,在很多情况下,我们希望了解环境中存在的微生物,包括其种类、组成及在环境中的变化动态。而传统的以培养为基础的微生物分离鉴定技术,在这方面存在很大的局限,不仅工作量大,而且在环境中有许多微生物至今无法被培养出来。因此,对于自然界各种生境中的微生物种类的信息,我们所知甚少,而这些信息对于环境保护和治理又是十分重要的。如何尽可能多地了解环境中的微生物信息,甚至是全部的信息,成为一个当前环境科学研究中的一个难点。而16S rRNA基因技术的出现,可以有效地解决上述难题,因此,16S rRNA基因技术正在被广泛应用到对环境样品中微生物的研究。

目前在环境科学领域中,16S rRNA基因技术的应用主要有以下两个方面:

211　鉴定生物降解菌

在环境保护和治理中,我们需要得到在环境中对污染物质起降解作用的微生物种类信息,这就需要对生物降解菌进行鉴定,由于有些微生物难以培养,传统的依赖于分离培养方法得到的微生物种类信息就有可能是不完全的。

Greiselbrecht等(1996)用该技术对来自海洋沉积物的萘降解菌N3-PA321进行鉴定,发现它与模式菌Cyclolqsticus pugetii亲缘关系最近[12]。陈亚丽等人(2002)利用16S rDNA序列分析,对分离自土壤的甲基对硫磷降解菌进行鉴定,结合生理生化特性,鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp1WB C-3)[13]。刘涛等(2002)从炼油厂废水中分离得到苯酚高效降解菌L68菌株,从形态、生理生化以及16S rDNA同源性等指标分析鉴定其为B urkhol deria cepacia(洋葱柏克霍尔德氏菌)[14]。

212　研究某一特定环境中微生物的区系组成,进而了解其种群动态,研究微生物的多样性

在环境保护研究工作中,我们需要用细菌的多样性来指示环境污染,或者是探索环境污染与细菌群落动态变化的关系等,这些都需要得到环境微生物群落的结构和功能的多样性信息,其中包括微生物在基因层次上的多样性和在种类组成上的多样性,也就是要对环境中微生物的群落结构进行多样性分析,利用微生物的16S rDNA信息,我们可以不经过分离培养微生物,而直接从环境中提取DNA,经过PCR扩增后,通过对16S rDNA的序列分析,而对环境中存在的微生物群落作出分析。

PCR-RFL P、PAPD等方法也被经常用于对混合环境样品中的微生物的群落结构分析。这些方法的敏感性更高,可以在群落水平上提供可信的基因型的信息。但对于复杂的微生物群落进行DNA分析时,分辨率过高的方法会使得到的信息量太大,不利于分析。从目前情况来看,D GGE或DNA复性的方法,在区

别不同种群的初步调查以及数量上占优势的微生物群落的鉴定中是十分有用的。

用16S rRNA对环境样品中的微生物多样性进行分析,可以采取不同的策略,目前采用的主要方法有:方法一:从环境样品中提取微生物总DNA,经过PCR扩增16S rRNA基因后,对扩增产物进行变性梯度凝胶电泳(D GGE)或温度梯度凝胶电泳(TGGE)分析,直接观察其多样性;

方法二:提取DNA和经PCR扩增后,对扩增产物用限制性内切酶进行切割并电泳,然后用标记探针杂交,从而可以进行RFL P分析,用以分析微生物RFL P的多样性;

方法三:提取微生物总DNA后,建立DNA文库,用16S rRNA基因探针筛选DNA文库中的rDNA 克隆,进行测序和比较,用以揭示微生物序列的多样性;

方法四:从环境样品中分离微生物菌落,对各单菌落分离微生物总DNA,以16S rRNA基因探针进行杂交,用于研究微生物种的多样性。

上述第四种方法仍然需要对微生物进行传统的分离培养,其他几种方法则不必对微生物进行培养分离。事实上,在实际操作中,上述四种方法可根据研究的需要进行调整,从而衍生出分析16S rRNA基因多样性的其他方法。无论采取哪种方法,16S rRNA基因序列水平的多样性为研究环境中微生物的多样性和分析其群落结构提供了全新的方法[15]。

Murray(1996)等用PCR-D GGE的方法对San -Francisco湾和Tomales湾的浮游细菌群落组成进行分析,证实正是它们在细菌种群上的差异,导致两个海湾在多环芳烃代谢能力上的差异[16]。李志刚等(2001)对水环境中存在的细菌进行群落结构分析[17]。戴欣等(2001,2002)对海洋沉积物中的细菌类群分析[18,19]。黄立南等人(2002)采用16S rRNA-ARDRA手段,对垃圾填埋场的渗滤液中的古细菌群落进行分析,来了解垃圾填埋场内处于高有机负荷及严格厌氧条件下的古细菌群落的结构及其多样性[20]。陈灏等(2002)对不同土壤中存在的微生物不经培养,将抽提的总DNA中的微生物的16S rDNA V3序列信息进行PCR扩增和D GGE等,进行测序和生物信息学研究后,对农田微生物的分布做了初步研究[21]。

对于特定的环境污染治理装置中的微生物群落组成多样性,同样可以采用16S rRNA基因分析的方法进行研究[22～24]。3　16S rRNA基因技术的发展前景与存在的不足之处

作为一种全新的手段,16S rRNA基因技术与PCR、D GGE等技术结合,其最大的优点是可以不经过分离培养微生物,克服了培养技术的限制,可以对环境样品进行客观的分析,可以得到在原始样品中存在的微生物不同种群的数量和种类分布信息,精确地揭示微生物种类和多样性信息。

随着分子生物学的发展,新的提取和分析手段不断出现,16S rRNA技术也在不断发展之中。

311　结合其他rDNA片段的分析

在原核生物中,由于16S rDNA序列的高度保守性,对于相近种或同一种内不同菌株之间的鉴别分辨力较差。16S-23S rDNA间区(Intergenic Spacer Re2 gion,ISR)是指位于16S rRNA基因和23S rRNA基因之间的间隔区域。与16S和23S rRNA基因比较, IGS区域具有更高的变异性,表现出长度和序列上的多态性,没有特定的功能,进化速率比16S rDNA大10多倍,。近年来已逐渐用于微生物种以下水平的鉴定、分类,通过对PCR产物的RFL P分析,可以达到鉴别菌种的目的,该方法具有快速、简单、准确及重复性好等的优点,成为细菌分类与鉴定的的热点[25,26]。

茅云翔等(2001)把16S rRNA基因与16S-23S rRNA转录单元内间隔区序列分析应用到节旋藻和螺旋藻分类鉴定中,得到很好的结果[27]。

312　结合其他分子生物学分析手段

将16S rRNA基因研究技术与分子生物学的其他技术手段相结合,可以有效地提高检测的精度,简化实验步骤,并且可以克服一些实验中存在的困难,这方面的发展可以说是日新月异。如在16S rRNA基因研究中应用荧光定量PCR方法,将荧光素直接加入PCR反应管中,可以直接探测PCR反应过程中荧光信号的变化以获得定量的结果,不需要PCR后处理或电泳检测,该方法可以克服PCR反应过程中因为污染造成假阳性等弊病[28,29]。

以荧光标记的rRNA靶探针与流式细胞仪结合也可以对混合样品的微生物种群进行自动分析。而采用荧光原位杂交的方法,可以做到对单个微生物细胞进行鉴定,极大地提高检测的灵敏度。

313　16S rRNA基因技术存在的不足之处

作为一种实验技术手段,16S rRNA基因技术并

不是万能的,它同样存在一些先天不足,特别是当把它应用到环境保护和治理领域中时,我们必须看到它所存在的不足,这些缺点限制了它在环境科学领域中的应用。

目前看来,16S rRNA基因技术在环境科学领域中的应用,主要受到以下几个方面因素的限制:

(1)需要较高的代价,16S rRNA基因技术需要较昂贵的仪器设备和药品配套,对实验人员要求有较好的分子生物学基础,这一点在许多一般的环境治理实验室中可能是无法满足的;

(2)16S rRNA基因技术本身在操作过程中,存在一些缺陷,如有可能发生基因丢失的情况,从环境样品中抽提的DNA的质量是成功的一个关键步骤,提取效率的低下或样品中其他物质的干扰,都会使实验结果发生偏差。

(3)16S rRNA基因技术在环境保护领域中应用所面临的最大的问题是,我们虽然可以获知环境中微生物存在的信息,却无法得到我们所检测的微生物菌株,这为后面在生产实际中应用带来困难,这也是16S rRNA 基因技术不如传统的微生物分离培养方法的地方。

4　结 语

虽然存在种种不足,但这并不妨碍16S rRNA基因技术成为在环境科学领域中成为一种新的十分有用的技术手段,因为它毕竟能够使我们对在环境中存在的微生物信息能够有一个全面而细致的了解。而且随着分子生物学技术的进一步发展,有的问题也是有可能得到解决的,如我们通过16S rRNA基因技术了解在环境中存在的某些微生物种类,它们具有一些特殊的功能基因,可以考虑到将该基因分离出来,并克隆到其他微生物中,这样就可以解决我们得不到微生物菌株的问题。

总之,16S rRNA基因技术的发展方兴未艾,有望在分析环境生物多样性、揭示污染的生物学效应和环境质量评价等环境科学研究领域得到广泛的应用。

参考文献:

[1]　Pace N R,Stahl D A,Lane D J,Olsen GJ1The analysis of natural micro2

bial populations by ribosomal RNA sequence[J]1Advanced in Microbial E2 cology,1986,(9):1255.

[2]　Rashidian E Q,Payne G,Ward A G1A Phylogenetic analysis of the S trep2

tomyces cyaneus species-group[A]111th International Symposium on the Biology of Actinomycetes Abstracts[C].Heraklion,GRT,1999.164. [3]　徐　平,张利平,余利岩.应用16S rRNA基因V-2高变区序列进

行链霉菌分子分类[J].生物多样性,2001,9(2):1292137.

[4]　东秀珠,沈德龙,辛玉华.16S rDNA同源性所揭示的双歧杆菌与有

关细菌的亲缘关系[J].生物多样性,2000,8(2):1462152.

[5]　赵庆新,谭远德.利用肠道菌群的分布和16S DNA序列研究鲤科肠

道菌系统演化关系[J].遗传,2002,24(4):4472454.

[6]　李　颖,白　雨,陈文新.沙坡头地区根瘤菌DNA同源性及

16S rDNA全序列[J].微生物学报,1999,39(2):95299.

[7]　汪恩涛,曲春枫,等.16S rRNA基因测序确定根瘤菌的系统发育

[J].高技术通讯,1995,5(11):55257.

[8]　彭桂香,陈文新.16S rDNA-RFL P分析新疆快生大豆根瘤菌的分

类地位[J].微生物学通报,2000,27(4):2372241.

[9]　Vaneechoutte M,R Roseau,et al1Rapid identification of bacteria of the

Comamonadaceae with amplified ribosomal DNA-restriction analysis (ARDRA)[J]1FEMS Microbial1Lett1,1992,93(2):2272234.

[10]　Weidner S,W Arnold,et al1Diversity of Uncultured Microorganisms As2

sociated with the Seagrass Halophila stipulacea estimated by Restriction Fragment length Polymorphism Analysis of PCR-Amplified16S rRNA

G enes[J]1Appl1Environ1Microbiol1,1996,62(3):7662771.

[11]　刘　忠,关少慧,等.应用ARDRA技术研究Frankia菌多样性[J].

微生物学杂志,2001,21(1):20223.

[12]　Greselbrecht A D,Herwig R P,Deming J W,et al1Enumeration and

phylogenetic analysis of polycyclic aromatic hydrocarbon-degraing marine bacteria from Puget Sound Sediments[J]1Appl1Environ1Microbiol1, 1996,62(9):334423349.

[13]　陈亚丽,张先恩,刘　虹,等.甲基对硫磷降解菌假单胞菌WBC-3

的筛选及其降解性能的研究[J].微生物学报,2002,42(4):4902 497.

[14]　刘　涛,刘正学,等.苯酚高效降解菌L68菌株的分离及分类鉴定

[J].山东大学学报(理学版),2002,37(4):3692372.

[15]　杨永华,姚　健,分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用

[J].生物多样性,2000,8(3):3372342.

[16]　Murray A E,Hollibaugh J T,Orrego O1Phylogenetic compositions of

bacterioplankton from two California esturies compared by denaturing gra2 dient gel electrophoresis of16S rDNA fragments[J]1 Appl1Environ1Microbiol1,1996,62(7):267622680.

[17]　李志刚,杨官品,朱艳红.水环境细菌16S rDNA限制性片段长度

多型性及群落结构分析[J].水生生物学报,2001,25(2):1112115.

[18]　戴　欣,周　惠,蔡创华,等.海洋沉积物中特有细菌类群的初步

探讨[J].中山大学学报,2001,40(6):51254.

[19]　戴　欣,周　惠,陈月琴,等.中国南海南沙海区沉积物中细菌类

16S rDNA多样性的初步研究[J].自然科学进展,2002,12(5): 4792484.

[20]　黄立南,周　惠,陈月琴,等.垃圾填埋场渗滤液中古细菌16S

rRNA基因的ARDRA分析[J].生态学报,2002,22(7):10852 1090.

[21]　陈　灏,唐小树,林　洁,等.不经培养的农田土壤微生物种群构

成及系统分类的初步研究[J].微生物学报,2002,42(4):4782483.

[22]　G odon J J,Zumstein E,Dabert P,et al1Molecular microbial diversit y of

an anaerobic digestor as determined by small-subunit rDNA sequence analysis[J]1Appl1Environ1Microbiol1,1997,63(7):280222813.

(下转第16页)

少塑料的添加剂类EH的危害。多食用绿色食品,尽量少食或不吃罐头食品、方便面,市场上加工过的半成品食品有的经过漂白、杀菌等处理,也应尽量少买。不食生海鱼,尽量不食近海鱼类及鱼的内脏,防止通过食物链浓缩而积聚在海鱼体内的EH进入人体。服装和被褥尽量使用天然纺织产品,对抗菌纺织品产品要清洗去掉异味再使用。室内装修材料要选用有国家安全标准的绿色环保产品,不要长时间呆在新装修的房间里。不要私自焚烧垃圾,特别是塑料和发泡材料,避免产生二恶英。少用人工合成的激素类药物;慎用化学合成化妆品。

参考文献:

[1]　尤力群.环境激素及其危害[J].化学教学,2000,(8):22224.

[2]　江田汉,杨晓明,赖玉平.环境技术问题浅析[J].中国环境管理,

2001,(1):43244.

[3]　孔昌俊.环境激素对人类健康的影响[J].辽宁城乡环境科技,2000,

20(6):124.

[4]　王毓秀,张利民.化学农药与环境激素[J].农村生态环境,1999,15

(4):37241.

[5]　李京东,肖素荣.环境激素—危险的环境污染物[J].生物学通报,

2001,36(9):17218.

[6]　日本环境厅.环境≈ 战略计划[N].SPEED’98,1998205.

[7]　张　虹.终极杀手—环境激素[J].大自然探索,2000,(1):41243.

[8]　任　仁.环境激素种类和污染途径[J].大学化学,2001,16(5):282

32.

[9]　吴平华.环境激素浅说[J].生物学杂志,1999,16(6):46.

[10]　Munson L,Calzada N,K ennedy S,Sorensen T B.Luteinized ovarian cysts

in Mediterranean striped dolphins[J].Journal of Wildlife Diseases,1998,34

(3):6562660.

[11]　Brown R J,Conradi M,Depledge M H.Long2term exposure to4-non2

ylphenol affects sexual differentiation and growth of the amphipod Corophi2

um volutator(Pallas,1766)[J].Science of the Total Environment,1999,

223:77288.[12]　夏星辉,杨居荣,许嘉琳.环境激素污染研究进展[J].上海环境科

学,2001,20(2):56258.

[13]　Dodson S I,Merritt C M,et al.Low exposure concentration of atrazine in2

crease mail production in Daphnia pukicaria[J].Environ.Toxicol.Chem., 1999,18(7):156821573.

[14]　Z ou E,Fingerman M.Effects of estogenic xenobiotics on molting of the wa2

ter flea[J].Daphnia magna.Ecotoxicol.Environ.Sal.,1997,38(3):2812 285.

[15]　赵劲松,袁　星,于书霞.环境激素对水蚤的影响[J].环境污染与

防治,2001,23(6):3142316.

[16]　Purdom C E,Hardiman P A,Bye V J,et al.Estrogenic effects of effluents

from sewage treatments works[J].Chem.Ecol.,1994,(8):2752285. [17]　Howell W M,Black D A,Bortone S A.Abnormal expression of secondary

sex characters in a population of mosquitofish,Gambusia af f inis hotbrook2 i,evidence for environmentally induced masculinization[J].Copeia,1980,

(4):6762681.

[18]　赵劲松,袁　星.环境激素对鱼的影响[J].环境科学研究,2001,14

(3):12216.

[19]　方昌阁,张才乔,等.环境激素生殖毒性作用的研究进展[J].国外

畜牧科技,2000,27(2):31234.

[20]　Leatherland J.Endocrine and reproductive function in Great Lakes salmon

[A].Chemically induced alterations in sexual and functional development:

The wildlife/human connection[C].New Jersy:Princeton Scientific Pub2 lishing Co.Inc.,1992.1292145.

[21]　Tong Zhou,J udith S W,Henry B J A,et al.Thyroidal status of mumm2i2

chogs(Fundulus heteroditus)from a polluted versus a reference habitat[J].

Environ.Toxicol.Chem.,1999,18:281722823.

[22]　崔丽英,肖美丽,刘仙娜.环境激素污染与无公害蔬菜[J].环境保

护,2001,(7):43244.

[23]　郝明德,刘晓宏.环境激素与环境保护型农业[J].农业现代化研

究,1999,20(4):2292232.

[24]　香山不二雄.环境≈ 问题とはか[J].化学同人,1998,(11):

12215.

[25]　Wolff MS.Toniolo PG,Lee Ew,et al.Blood levels of organoshlorine re2

sidues and risk of breast cancer[J].J Natl Cacer Inst,1993,85(8):6482 652.

(上接第4页)

[23]　Skeiguchi Y,Kamagata Y,Syutsubo K,et al1Phylogenetic div2ersi2

ty of mesophilic and thermophilic granular sludges determined by16S rRNA gene analysis[J]1Microbiol1,1998,144(9):265522665. [24]　Wu J H,Liu W T,Tseng I C,et al1Characterization of microbial

consortia in a terephthalate-dedrading anaerobic granular sludge sy2 stem[J]1Microbiol1,2001,147(2):3732382.

[25]　Leblond-Bourget N,Philippe H,Mangin I,Decaris B.16S rRNA

and16S to23S internal transcribed spacer sequence analyses reveal in2 ter2and in2tra2spacific Bifidobacterium phylogeny[J]1International

Journal of Systematic Bacteriology,1996,46(1):2082218.

[26]　焦振泉,刘秀梅.细菌分类与鉴定的新热点:16S-23S rDNA间区

[J].微生物学通报,2001,28(1):85289.

[27]　茅云翔,杨官品,张宝红,等.16S rRNA基因与16S-23S rRNA转

录单元内间隔区序列分析及其在节旋藻和螺旋藻分类鉴定中的应用[J].高技术通讯,2001,11(6):12218.

[28]　Hiratsuka M1Rapid detection of CYP2C9alleles by real time flu orescence

PCR based SY BR G reen[J]1Mol1G enet1Metab1,1999,68(3):3572362. [29]　沈永才,袁佩娜.16S rRNA荧光定量PCR法检测双歧杆菌[J].中

国微生态学杂志,2001,13(2):66272.

基因工程及其应用教学设计

第2节基因工程及其应用 孝义三中高一生物组张文 一、教材内容分析 基因工程是现代四大生物工程之一。《基因工程及其应用》是人教版高中生物必修2第6章第2节内容。本节内容主要包括三个方面，分两课时讲授。第1课时简要介绍“基因工程的原理”，第2课时介绍“基因工程的应用”及“转基因生物和转基因食品安全性”。本节内容是对前面所学育种内容的补充，是即贴近生活又远离生活的微观内容。由于在选修3中还有基因工程的介绍，因此本节的要求相对简单一些。 二、学情分析 对于基因操作的工具和基本步骤，内容抽象和复杂，学生接触少，会出现掌握不好，甚至理解错误的情况。虽然经过必修1的学习，学生的生物基础知识较扎实，思维的目的性、连续性和逻辑性已初步建立。但基因工程一节对学生来说难点较多，如果处理不好，会变成简单的死记硬背。因此在教学过程中，尽量通过生活化打比喻的方式和模型建构活动及采用多媒体动画形象化教学，并在教师引导下适时加强学生解决问题和运用图解等生物学语言归纳结论等方面的能力。切记不可讲的太多。 三、教学目标 1、简述基因工程的基本概念； 2、简述基因工程的基本工具； 3、简述基因工程的基本操作步骤； 4、通过基因工程的简介，鼓励学生积极探索新知和科学创新，树立一分为二的辩证唯物主义思想； 四、教学重点、难点分析 教学重点：基因工程的基本原理（概念、工具、操作步骤） 教学难点：基因工程的基本原理 五、教学思路 本节课主要解决如下几个问题：1）什么是基因工程？2）基因工程的主要原理是什么？3）基因工程的操作过程如何？4）基因工程有哪些方面的应用？如何看待转基因食品？由于本节内容和前面的育种内容联系比较紧密，因此可以让学生回顾前面几种育种方法的成果，再通过情景展现传统育种方法所不能达到的地方，进而引出基因工程，通过列举生活中的转基因成果让学生知道基因工程就在我们身边。而后通过与学生们所熟知的器官移植做对比，让学生理解基因工程的本质和操作过程。通过对转基因食品的讨论让学生树立辩证唯物主义观念。 六．教学策略及教学媒体 根据激趣原则，通过展示色彩绚丽的转基因生物图片入手，引出基因工程的概念，采取“引导—互动—探究”模式，即采用师生互动探究式教学，借助老师生活化打比喻和多媒体动画并安排学生制作模型活动从而使抽象的课程内容具体化，直观化和形象化。 七、教学设计流程图第1课时“基因工程的原理”

中国转基因技术的应用现状及展望

中国转基因技术的应用现状及展望 摘要：针对国内外研究转基因的现状，简要综述了转基因技术的发展概况，我国在转基因技术上的发展概况以及所取得的成就，并且针对转基因技术可能存在的不利因素，叙述了我国转基因技术的安全管理情况，提出了对发展我国转基因技术的建议，阐述未来农业转基因技术的发展趋势和保障措施。 关键词：转基因技术；现状；展望 Application Status and Prospect of China Transgenic Abstract: Be directed to status of gene transfer on domestic and overseas, reviewed briefly the development of transgenic technology, In the development of transgenic technology in our country as well as the achievements, and unfavorable factors may exist for transgenic technology, describes the safety management of our transgenic technology, suggestions for the development of the transgenic technology. Further, the development trend and the safeguards of the transgenic biotechnology in Chinese agriculture were described. Keywords: transgenic; status quo; expectation 21世纪是生物技术的世纪，生物技术在农业领域中的运用将为农业生产带来新的革命。转基因技术，是指运用科学手段，将基因片段转入特定生物中，并最终获取具有特定遗传性状个体的技术[1]。转基因技术通过在细胞和分子水平上对基因进行操作，打破物种间遗传物质转移交换通常具有的天然屏障，实现农作物目标性状的定向改良，是生物技术领域发展最快的前沿技术之一[2]。自从人类耕种作物以来，我们的祖先就从未停止过作物的遗传改良。过去的几千年里农作物改良的方式主要是对自然突变产生的优良基因和重组体的选择和利用，通过随机和自然的方式来积累优良基因。因此，可以认为转基因技术是与传统技术一脉相承的，其本质都是通过获得优良基因进行遗传改良。 1转基因技术的发展概况 1974年，波兰遗传学家斯吉巴尔斯基[3]称为合成生物学概念的就是基因重组技术，1978年，诺贝尔医生奖颁给发现DNA限制酶[4]的纳森斯、亚伯与史密斯，

第八章分子生物学常用技术的原理及其应用及人类基因组学

第八章分子生物学常用技术的原理及其应用及人类基因组学 测试题 一、名词解释 1．分子杂交 2．Southernblotting 3．Northernblotting 4．Westernblotting 5．dotblotting 6．DNA芯片技术 7．PCR 8．功能性克隆 9．转基因技术 二、填空题 1．Southernblotting用于研究、Northernblotting用于研究，Westernblotting用于研究。 2．PCR的基本反应步骤包括、和三步。 3.在PCR反应体系中，除了DNA模板外，还需加入、、和。 4．Sange法测序的基本步骤包括、、和。 5．目前克隆致病相关基因的主要策略有、、。 6．血友病第Ⅷ因子基因的首次克隆成功所采用的克隆策略是，而DMD致病基因的克隆所采用的克隆策略是。 三、选择题 A型题 1.经电泳分离后将RNA转移到硝酸纤维素(NC)膜上的技术是： A．SouthernblottingB．Northernblotting

C．WesternblottingD．dotblotting E．insituhybridization 2.不经电泳分离直接将样品点在NC膜上的技术是 A．SouthernblottingB．Northernblotting C．WesternblottingD．Dotblotting E．insituhybridization 3.经电泳分离后将蛋白质转移到NC膜上的技术是 A．SouthernblottingB.Northernblotting C．WesternblottingD．dotblotting E．insituhybridization 4.经电泳后将DNA转移至NC膜上的技术是A．SouthernblottingB．Northernblotting C．WesternblottingD．Easternblotting E．insituhybridization 5.PCR的特点不包括 A．时间短，只需数小时B．扩增产物量大 C.只需微量模板D．用途非常广泛 E.底物必须标记 6．用于PCR的DNA聚合酶必须 A．耐热B．耐高压C.耐酸D．耐碱E.耐低温7．PCR反应过程中，模板DNA变性所需温度一般是A．95?CB．85?CC．75?CD．65?CE．55?C 8．PCR反应过程中，退火温度一般是 A．72?CB．85?CC．75?CD．65?CE．55?C 9.PCR反应过程中，引物延伸所需温度一般是A．95?CB.82?CC．72?CD．62?CE．55?C

转基因作物商业化的现状对粮食安全的影响及启示

转基因作物商业化的现状对粮食安全的影响及启示2008年的粮食危机使转基因生物技术再次成为争论的焦点，关于转基因作物的争论己从生物安全、生态和健康等领域转移到粮食安全、知识产权等领域的讨论。部分转基因作物支持者认为，转基因作物对全球粮食安全将发挥重要作用，而反对者认为，对于解决未来的粮食安全问题，目前的转基因作物意义不大。转基因作物发端于美国的私人部门，目前，发达国家主导着全球的转基因生物技术和知识产业格局，拥有这个领域众多的知识产权，我国转基因作物的研发和商业化将不可避免涉及到众多知识产权问题，转基因作物的商业化种植可能加速外资对我国种业的控制，进而危及我国的粮食安全。目前，跨国种业渗透、控制包括我国在内的海外种业的态势日益严峻。2008年的“粮食危机”从一定程度上为跨国种业巨头向包括我国在内的发展中国家销售转基因作物品种提供了机遇。 一、全球转基因作物商业化种植态势 卜）转基因作物商业化种植的面积、市场份额快速扩张，农业生产市场化程度提高 国际农业生物技术应用服务组织qSAAA）2009年的报告显示，2008年全球转基因作物种植面积达1.25亿公顷，种植转基因作物的国家达到25个。从地域分布来看，转基因作物主要分布在美国、阿根廷和巴西三个国家，欧洲的转基因作物的种植面积很少。ISAAAQ009）报告显示，2008年美国、阿根廷、巴西转基因作物种植面积分别为6250、

2100、1580万公顷，分别占全球转基因作物种植面积的50%、 16.8%、12.6%，合计起来三个国家的转基因作物种植面积占全球的79.4%。2008年，欧盟27国中有7个国家种植了很少量的转基因Bt玉米。 从转基因作物品种来看，自1996年转基因作物商业化种植以来，全球主要转基因作物品种为大豆、玉米、棉花、油菜四种作物。2008年全球转基因大豆（HT大豆）种植面积为6580万公顷（占全球转基因作物种植面积的53%）、转基因玉米Bt玉米、HT玉米、Bt／HT玉米），种植面积为3730万公顷（占30%）、转基因棉花Bt棉花、HT棉花、Bt ／HT棉花）种植面积为1550万公顷（占12%）、转基因油菜qT油菜）种植面积为590万公顷（占5%）。 从种子市场份额来看，根据国际种子联盟Q008）的报告，全球商品种子的市值规模大约为365亿美元，而全球转基因作物品种销售额为75亿美元，据此粗略测算，转基因种子销售额占全球商品种子销售额的20.5%。自1996年以来，转基因作物种子销售额呈快速增长态势观表1）。 转基因品种的采用正影响着农民留种的耕作习惯。转基因品种的采用要求农民每一生产季都从市场上购买种子，农户对种子供应商的依赖将会加剧，农业生产的市场化程度、对技术的依赖程度将进一步提高。同时，种业的集中、作物品种和特性的单一会加剧农业生产的系统性风险，农业生物资源的生物多样性也受到影响。

基因工程技术的现状和前景发展

基因工程技术的现状和前景发展 摘要 从20世纪70年代初发展起来的基因工程技术，经过30多年来的进步与发展，已成为生物技术的核心内容。许多科学家预言，生物学将成为21世纪最重要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。 基因工程应用于植物方面 农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。由于植物病毒分子生物学的发展，植物抗病基因工程也也已全面展开。自从发现烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因导入烟草中，在转基因植株上明显延迟发病时间或减轻病害的症状，通过导入植物病毒外壳蛋白来提高植物抗病毒的能力，已用多种植物病毒进行了试验。?在利用基因工程手段增强植物对细菌和真菌病的抗性方面，也已取得很大进展。植物对逆境的抗性一直是植物生物学家关心的问题。由于植物生理学家、遗传学家和分子生物学家协同作战，耐涝、耐盐碱、耐旱和耐冷的转基因作物新品种(系)也已获得成功。植物的抗寒性对其生长发育尤为重要。科学家发现极地的鱼体内有一些特殊蛋白可以抑制冰晶的增长，从而免受低温的冻害并正常地生活在寒冷的极地中。将这种抗冻蛋白基因从鱼基因组中分离出来，导入植物体可获得转基因植物，目前这种基因已被转入番茄和黄瓜中。?随着生活水平的提高，人们越来越关注口味、口感、营养成分、欣赏价值等品质性状。实践证明，利用基因工程可以有效地改善植物的品质，而且越来越多的基因工程植物进入了商品化生产领域，近几年利用基因工程改良作物品质也取得了不少进展，如美国国际植物研究所的科学家们从大豆中获取蛋白质合成基因，成功地导入到马铃薯中，培育出高蛋白马铃薯品种，其蛋白质含量接近大豆，**提高了营养价值，得到了农场主及消费者的普遍欢迎。在花色、花香、花姿等性状的改良上也作了大量的研究。? 基因工程应用于医药方面 目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核甘酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。?目前，应用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中试，并进入临床验证阶段；专门用于治疗肿瘤的“肿瘤基因导弹”也将在不久完成研制，它可有目的地寻找并杀死肿瘤，将使癌症的治愈成为可能。由中国、美国、德国三国科学家及中外六家研究机构参与研制的专门用于治疗乙肝、慢迁肝、慢活肝、丙肝、肝硬化的体细胞基因生物注射剂，最终解决了从剪切、分离到吞食肝细胞内肝炎病毒，修复、促进肝细胞再生的全过程。经4年临床试验已在全国面向肝炎患者。此项基因学研究成果在国际治肝领域中，是继干扰素等药物之后的一项具有革命性转变的重大医学成果。 基因工程应用于环保方面

6.2基因工程及其应用学案

课型：新授主备：同备审批: 7/13/2013 第6章从杂交育种到基因工程 第2节基因工程 【学习目标】1.简述基因工程的基本原理 2.举例说出基因工程在农业、医药等领域的应用 3.关注转基因生物和转基因食品的安全性 【学习重点】1. 基因工程的基本原理 【学习难点】基因工程的基本原理 【学习过程】 一、基因工程的基本原理 （一）、基因工程的概念 基因工程又叫做或。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的。 【思考】 为什么不同生物的基因可以相互转移？转基因生物是否产生了新基因和新型蛋白质？ （二）、基因工程的工具 基因的“剪刀”—— 一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在的切点上切割DNA分子。【思考】 要获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？ 被同一种限制酶切断的几个DNA是否具有相同的黏性末端？ 【练一练】试写出下列序列受EcoRI限制酶作用后的黏性末端 基因的“针线”—— “缝合”__________和_________交替连接而构成的DNA骨架上的缺口。 【思考】DNA连接酶连接的是两个脱氧核苷酸分子的什么部位？

基因的运载体目前常用的运载体有________、________和______________等。 质粒存在于中,是拟核或细胞核外能够________的______________分子。 （三）、基因工程的操作步骤 目的基因、目的基因与结合、将目的基因、目的基因的和 【思考】 目的基因和质粒为什么要用同一种限制酶切割？限制酶和DNA连接酶作用的位点相同吗？用DNA连接酶讲目的基因与运载体结合时，有其他不同的结合情况吗（两两结合时）？ 二、基因工程的应用 1、基因工程与作物育种 人们培育出的转基因作物和转基因动物主要有 ___________________________ ___ _____ ____ ____________________________________ __ 2、基因工程与药物研制 转基因药物有：________、________、________、________、________、________、________、________、________。 三、转基因生物和转基因食品的安全性 两种观点：__________________________________和_______________________________ ［课堂小结］ 【自我检测】 1．不属于基因工程方法生产的药物是（） A.干扰素 B.白细胞介素 C.青霉素 D.乙肝疫苗 2．质粒是基因工程最常用的运载体，它的主要特点是（） ①能自主复制②不能自主复制③结构很小④蛋白质⑤环状RNA分子 ⑥环状DNA ⑦能“友好”地“借居”

转基因农作物与粮食安全的关联分析

龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/5a16358754.html, 转基因农作物与粮食安全的关联分析 作者：薄晓峰 来源：《科技与创新》2016年第06期 摘要：随着科学技术水平的提升，我国的人口数量随之出现爆发性增长。虽然遗传育种 学在不断进步，农业科学家培养出了更多的优良品种，但粮食问题仍然存在。我国对粮食需求的刚性增长使人们更加关注粮食生产的数量和质量。20世纪末，生物技术取得了重大突破， 转基因食品逐渐地进入了人们的生活。转基因技术是对传统技术的发展和补充，两者的结合可极大地提高动植物品种改良的效率。 关键词：转基因技术；棉花；播种面积；农产品 中图分类号：F326.11 文献标识码：A DOI：10.15913/https://www.wendangku.net/doc/5a16358754.html,ki.kjycx.2016.06.005 人类社会的文明是从农耕时期开始的。最初，栽种植物是人类一万三千年来最伟大的成果，也是人们由狩猎生活进入定居生活的开端。人类学会种植植物后，一直在探索和改良种植方法，以满足自身对农产品的需求。自90年代以来，转基因食品不断出现在人们的餐桌上，人们在不断争论转基因食品是否安全，很少谈论转基因农作物与转基因食品安全性的关系。本文就该问题的内在关联进行了初步分析，以期正确认识转基因农作物。 1 粮食问题的本质 粮食供应是任何一个政府面都可能面临的最紧迫的问题之一。该问题属于历史性问题，因此，我国政府提出了“粮食供给95%自给自足”的目标。我国的耕地面积仅占全球的7%，但却要为全球22%的人口提供粮食。1994年，时任美国世界观察研究所所长的莱斯特·布朗出版了《谁来养活中国》，其中的观点是值得我们思考的。 新一轮全国土地利用变更调查结果显示，我国耕地总面积约为1.22×108 hm2。2008年，我国耕地面积净减少约19 333 hm2。根据全国31个省区市抽样调查的结果，2010年全国粮食播种面积为1.09×108 hm2，比上一年扩大了8.86×105 hm2，增长了0.8%；2010年，全国粮食总产量约为5.46×108 t，比上一年增加了约1.56×107 t，增产2.9%. 《中华人民共和国2012年国民经济和社会发展统计公报》指出，2012年末全国人口总数约为13.5亿人，比上一年增加了669万人。我国人口占世界总人口的比例持续下降，1976年为23%，2009年为19.5%，据估计，2050年将下降到15%左右。 2010年，我国人均粮食占有量为409.9 kg，肉禽蛋奶的人均消耗量109 kg。按照每消耗1 kg肉禽蛋奶消耗2.2 kg粮食计算，2010年我国人均肉禽蛋奶消耗时附带的粮食消耗量为239.8 kg，剩余粮食仅为170.1 kg。如果农村居民的肉禽蛋奶消耗量从29 kg增加到194 kg，则需要

基因工程及其应用完整版

基因工程及其应用集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]

第2节基因工程及其应用（第1课时） 知识链接及考试地位 本知识与“DNA分子的结构与复制”、“基因突变和基因重组”、“DNA重组技术的基本工具”、“基因工程的基本操作程序”等内容相联系，考试过程中常设计基因工程的原理、基本工具等基础知识，多以个别填空或选择题的形式呈现。 知识回顾 1、DNA分子的结构特点是什么？ 2、什么是基因重组？ 学习目标 1、简述基因工程的诞生。 2、简述基因工程的原理及技术。要明确基因工程操作的基本步骤和最基本的工具。 重难点 1．教学重点 基因工程的基本原理。 2．教学难点 基因工程的基本原理 新知探究 传统育种的方法一般只能在生物中进行，很难将一种生物的优良性状移植到生物身上。基因工程的出现使人类有可能按照自己的意愿地改变生物，培育出。 一、基因工程的原理 基因工程又叫做或。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以，然后放到另一种生物细胞里，地改造生物的遗传性状。基因工程是在DNA上进行的水平的设计施工，基因的剪刀是指，简称限制酶。其作用特点是一种限制酶只能识别一种序列。基因的针线是指。目前常用的运载体有、和等。质粒存在于许多以及等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的小型分子。 基因工程的操作步骤是：、目的基因与运载体结合，目的基因导入受体细胞、目的基因的和。 二、基因工程的原理、操作对象各是什么？ 三、限制性内切酶的分布、特点、作用部位和作用结果如何？ 四、作为基因的运载体，需具备哪些条件？ 五、DNA连接酶的作用对象、位置和结果如何？ 六、基因工程的优点是什么？

动物转基因技术及其应用

动物转基因技术及其应用 摘自（作者：幸宇云任军江西农业大学来源：《百名专家谈转基因》） 转基因是指利用现代分子生物学技术，将某些生物的基因导入到其他物种中，由于导入基 因的表达，引起这些物种性状发生可遗传的变化。转基因动物就是利用转基因技术获得的、具 有正常表达和可稳定遗传外源基因的动物。自1982年第一只转基因动物——一只因导入大鼠 生长激素基因而使生长速度倍增的转基因鼠诞生以来，各种转基因动物，如鱼、兔、猪、牛、 羊等先后问世，1997年，举世轰动的“多莉”克隆羊的诞生使转基因克隆动物成为现实，转 基因动物研究得到了进一步发展。 生产转基因动物的方法有很多，如：显微注射法、精子载体法、逆转录病毒载体法、胚胎 干细胞介导法、体细胞克隆介导法、人工染色体介导的基因转移法等，这些方法各有其优缺点，在转基因动物生产中有着不同程度的应用。 显微注射法是动物转基因技术中最早使用的方法。1982年，美国人Gordon就是利用这种 方法获得了名噪一时的转基因鼠。其基本原理是在显微镜下直接将目的基因注射到受精卵细胞 的原核内，在目的基因与胚胎基因组融合后进行体外培养，最后移植给受体母畜“借腹怀胎”。这种方法的优点是：可靠性高，重复性好，目的基因的整合效率相对较高，导入基因片段的大 小和类型不受限制，转基因在世代之间可以稳定遗传。该方法也有其缺点，主要体现在导入基 因整合的随机性和不可见性，这样会导致基因表达不稳定及可能出现不希望的插入突变。该方 法成功的范例很多，如：美国科学家Hammer等在1985年获得一批转基因兔、绵羊和猪；荷兰 科学家KrimPenfort等于1991年获得了转基因牛；1985年，我国朱作言院士等成功获得了世 界上首例转基因鱼；由中国农业大学李宁院士领导的课题组于2008年获得了一头导入人CD20 抗体基因的转基因奶牛——贝贝。 有的学者另辟蹊径，创立了精子载体转基因法。该方法是将精子与目的DNA进行预培养后，使精子具有携带目的基因进入卵子的能力，精子与卵子结合后，该基因被整合到受精卵的DNA 中。同显微注射法相比，该方法有几个明显的优点：无需显微注射操作，不会对胚胎造成损伤，整合率高，成本很低，不需要对动物进行胚胎移植手术处理等。但该方法成功率不高、效果不 稳定，有待科研人员进一步探索和改进。与显微注射法相比，该方法成功的例子不多。1989 年意大利Lavitrano等首次报道利用精子载体法获得转基因鼠；1996年意大利Sperandio科 研小组报道了采用该方法生产转基因牛和猪。 谈到病毒，人们往往面容失色，殊不知病毒在科学上有很多妙用。逆转录病毒是一种RNA 病毒，在转基因技术中有着独特的应用。人们将目的基因结合到逆转录病毒上，通过病毒感染 可将目的基因插入到宿主基因组中去。该方法具有可同时感染大量胚胎、不需要昂贵的显微注 射设备等优点，但也存在插入外源DNA大小有限、外源基因易发生重排和丢失、逆转录病毒的 序列可能干扰转基因表达等缺点。应用该方法，美国人Salter等（1987）生产出转基因鸡； 德国学者Hofmann等获得绿色荧光蛋白转基因猪（2003），随后又生产出转基因牛（2005）； 来自冷泉港实验室的Michael获得能够发荧光的山羊（2006）。 胚胎干细胞是生命体中保留的未成熟细胞，具有再分化形成其他细胞和组织器官的潜力， 被称为“万能细胞”。利用胚胎干细胞生产转基因动物的原理是将外源基因导入分离好的胚胎 干细胞，然后将转基因的胚胎干细胞注射于受体动物胚胎后，参与宿主的胚胎融合形成嵌合体，从而得到转基因动物。这一方法的优点是可以对胚胎干细胞进行特定选择。缺点是目前只有小 鼠干细胞系比较成熟，而家畜干细胞系还未完全建立，有不少问题尚待解决。 体细胞克隆介导的转基因是动物转基因技术中的“高级版本”。说到体细胞克隆，很多人都会想到一位“动物明星”——多莉羊，它是于1997年由英国Wilmut等获得的杰作。转基因 克隆技术是转基因技术和动物克隆技术的有机结合，其基本原理是将目的基因导入动物体细胞

基因测序技术的优缺点及应用

基因测序技术的优缺点及应用 随着人类基因组计划的完成,人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。与此同时,分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善,使得基因检测技术得到了迅猛发展,基因检测效率不断提高。从最初第一代以 Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术,到 2005 年,以Illumina 公司的 Solexa技术和 ABI 公司的 SOLiD 技术为标志的新一代测序 (next-generation sequencing,NGS) 的相继出现,测序效率明显提升,时间明显缩短,费用明显降低,基因检测手段有了革命性的变化。其技术正向着大规模、工业化的方向发展,极大地提高了基因检测的检出率,并扩展了疾病在基因水平的研究范围。2009 年 3 月,约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过 NGS外显子测序技术,发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2,标志着 NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。同年,《Nature》发表了采用 NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。此后,通过 NGS 技术,与遗传相关的致病基因不断被发现,NGS 技术已成为里程碑式的进步。2010 年,《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。 近两年,基因检测成为临床诊断和科学研究的热点,得到了突飞猛进和日新月异的发展,越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。同时,基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域,其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。目前,基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。 本文介绍了几种 DNA 水平基因检测常见的方法,比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用,对指导研究生和临床医生课外学习,推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。 1、第一代测序 1.1 Sanger 测序采用的是直接测序法。1977年,Frederick Sanger 等发明了双脱氧链末端终止法,这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。2001 年,Allan Maxam 和 Walter Gibert 发明了 Sanger 测序法,并在此后的 10 年里成为基因检测的金标准。其基本原理即双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate,ddNTP) 缺乏PCR 延伸所需的 3'-OH,因此每当 DNA 链加入分子 ddNTP,延伸便终止。每一次 DNA 测序是由 4个独立的反应组成,将模板、引物和 4 种含有不同的放射性同位素标记的核苷酸的ddNTP 分别与DNA 聚合酶混合形成长短不一的片段,大量起始点相同、终止点不同的 DNA 片段存在于反应体系中,具有单个碱基差别的 DNA 序列可以被聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离出来,得到放射性同位素自显影条带。依据电泳条带读取DNA 双链的碱基序列。 人类基因组的测序正是基于该技术完成的。Sanger 测序这种直接测序方法具有高度的准确性和简单、快捷等特点。目前,依然对于一些临床上小样本遗传疾病基因的鉴定具有很高的实用价值。例如,临床上采用 Sanger 直接测序 FGFR 2 基因证实单基因 Apert 综合征和直接测序 TCOF1 基因可以检出多达 90% 的

转基因动物应用前景

转基因动物的应用前景 冯彦东，马小军，李越，马志辉，肖海元，马永刚，马聪 甘肃农业大学动物科学技术学院甘肃兰州 (730070) 摘要：本文较为全面的综述了各种转基因动物技术的方法，以及提高转基因效率的方法；指出了目前研究中存在的问题，并对其发展前景进行了展望。 关键词：转基因动物、基因、方法、应用、前景 科学家预言，21世纪是生命科学的世纪，生物技术产业已成为科学家和企业家开发的热点。转基因动物技术是21世纪发展最为迅速的生物高新技术之一，是建立在细胞遗传学、分子遗传学、胚胎发育学和DNA重组技术基础之上的生物工程技术。转基因技术就是利用工程技术的实验手段将特定外源基因导入受体细胞中，由此整合到受体细胞的染色体上，并使外源基因得到表达和遗传的生物技术。携带外源基因并能表达和遗传的支物称为转基因动物。转基因技术是新兴的生物技术，具有广阔的应用前景。目前利用转基因技术获得的主要是粮食作物，其中转基因植物及产品已进入商品化生产阶段。转基因动物的研究尚处于实验室研究阶段，获得转基因动物技术难度较大。但它是一种通过对基因的操作，在RNA、蛋白质、形态学或生理学等水平直接观察基因在活体内的活动情况，并观察其表达产物所引起的表型效应的四维实验体系，其应用已广泛渗透于分子生物学、发育生物学、免疫学、制药及畜牧育种等各个研究领域中，既具有深远的理论价值，又有重大的应用价值。据统计，全球已有以转基因动物技术为核心的公司43家，并将成为21世纪生物技术领域的支柱产业。1998年全球动物生物技术产品总销售额估计为6.2亿美元，预计到2010年仅在农业领域总销售额将达到110亿美元，其中75亿美元来自转基因动物品种。而利用转基因动物制作生物反应器生产药品物和功能蛋白的销售市场预计可达500亿美元。毫无疑问，转基因动物正在改变着生物医药、农业生产、环境保护、生物材料，甚至是整个生命科学研究与发展面貌。利用转基因动物技术，既可加快家畜品种的改良速度，提高肉、奶、蛋的产量和品质，又可生产珍贵的药物蛋白，为大量患者造福。可以说转基因动物技术对于人们千百年来追求的丰衣足食，延年益寿两大目标都会做出具大的贡献。[1，2，3，4，5，6，7] 1 转基因动物的制作方法 1.1 显微注射法 是由美国人Gordon于1980年首次发明。显微注射法的制作过程是将SV40的TK基因整合的质粒以显微注射法注入到小鼠受精卵原核中,首次成功地培育出转基因小鼠。其基本原理是通过显微镜注射将外源基因直接注射到受精卵的雄原核内,将外源基因整合到DNA中,发育成转基因动物。其优点是直接对基因进行操作,整合率较高.缺点是技术难度高,成功率低。[3，8，15，18] 1.2 逆转录病毒传染法 此法的研究是1974年Janenissh等将SV40DNA注入小鼠囊胚腔中，获得转基因小鼠。其原理是利用逆转录病毒的LTRs区域具有的转录启动子活性这一特点，将外源基因连接到LTRs的下部进行重组后，再使之包装成为高滴度的病毒颗粒，直接感染受精卵或注入囊胚中，携带外源基因的反转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。逆转录病毒法的优点是操作简单，外源基因的整合率高，动物病毒所具有的启动子不但可以引发一些选择标记基因的表达，还能引发所导入的外源基因的表达，缺点是逆转录病毒载体容量有限，并且外源基因

对转基因技术的态度

对转基因技术的态度 相信大家都在很多电影里看到过各种怪兽，它们长相怪异，个头巨大，几乎刀枪不如，有时候，它们成为人类的朋友，但更多时候，他们是人类的敌人，人们用各种现代化武器也难以消灭它们。电影很精彩，但是这些怪兽怎么出现的，有时候是外星物种，有时候则是一些变异，而这些变异有些就来自于某些科学家在做转基因研究是出现的失误。 目前市面上各种转基因蔬菜，水果，粮食等等，五花八门，但是又有另一种说法，转基因食品对健康有害，于是乎转基因食品与非转基因食品在超市的柜台上打起了擂台。但是转基因技术到底是好还是不好，这还是个值得商讨的问题。而我对转基因技术持一种不否认但是需要严肃考虑的态度。不是说转基因技术不好，但是它应该应用于哪些方面，应该怎样应用，这是需要严肃考虑的，不然很可能酿出滔天大祸。 说到转基因技术就不得不提到基因工程。基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 很多人对转基因食品的印象一般都是巨大的个头，曾经在某植物园见过一次能结两万个辣椒的辣椒树，真的是树一般的存在，看起来着实有些吓人。人们对转基因的了解或许也仅仅从食品这些与我们的生活密切相关的东西上有些了解，但是转基因技术也不仅仅只在食品方面有应用。 目前，转基因作物正在脱下神话的外衣。美国科学家表示：转基因作物远没有当初想象的那么美妙，更没有转基因技术公司所承诺的那么神灵。美国国家科学院的报告用16年的实践事实和统计数据明确说明，长期种植转基因作物会给农业经济带来无法纠正弥补的副作用。随着超级杂草，超级虫的出现，很显然的表现出对于转基因技术过于冒进的使用，也会带来一定的灾难。随着世界人口的增长，原始的农业生产速度是在一定程度上逐渐跟不上人类对粮食的需求，于是研究转基因粮食的工作变得似乎很有必要。但是随着这项工作的发展，很多问题也在逐渐出现。 转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术。转基因生物以植物、动物和微生物为多，其中植物是最普遍的。 目前，我国正在研究和开发的各种转基因生物物种已超过100种，涉及动物、植物、微生物基因200多个。我国至今还没有允许生产转基因食物，只是开始进口了大豆、玉米等几种转基因食物，进行加工，不允许种植。转基因的安全性目前还没有明确的定论。 从危害来看，转基因作物可能产生新的病毒疾病，转基因作物对非目标生物的危害，破坏生物多样性，转基因作物对生态系统及生态过程的影响。目前我们对转基因的危险有多大都还不能确定，就开始推广转基因显然是不行的，还有就是我国完全掌握的具有自主知识产权的品种有吗?有多少？要是推广他国掌握核心技术的品种，那我们还没有发言自主权，对粮食安全的威胁是可想而知的。有人不是说过“谁控制了粮食，谁就控制了全人类”。

转基因技术在农业上的利弊分析

转基因的认知 转基因（tr-ansgene）技术是指所有通过基因工程手段构建、导入受体生物细胞并稳定整合到该受体细胞基因组中的外源基因的技术。人们对植物、动物进行遗传转化的最终目的是从转基因在受体植物、动物基因组中得到稳定整合并在当代及其子代中得到有效、稳定的表达。转基因这项前沿生物工程技术，近年来有望进入大面积生产应用. 由于其可以大大降低农业生产成本，提高作物单位面积产量、改变品种品质，所以它将对农业未来的发展作出变革性贡献。 经济的发展和人口的增加促使农艺学家不但要在有限的耕地上生产出高产、稳产的农产品，还要研究如何在其食用口味、营养成分以及外在性状等方面提高产品品质。转基因技术的兴起，在很大程度上解决了这些矛盾。目前已培育出玉米、水稻、烟草等29种重要农作物的抗病毒、抗虫、抗除草剂、营养品质大幅度提高的转基因植株。在诸多的农业增产措施中，采用转基因技术进行作物良种繁育的方法占到30％～40％。 培育转基因动物的用途在于：(1)研究基因功能和调控机理；(2)作为人类疾病研究的动物模型；(3)培育高产、抗病家畜或能够为人类提供移植用器官供体动物；(4)作为生物反应器来生产工业和医学所需的珍贵活性蛋白。在农业生产上动物转基因技术的应用是具有很大潜力的，包括提高乳生产的产量和改变乳成分，饲料利用率，胴体品质，抗病力，繁殖力，生产效率以及为生物研究和制造业而改变细胞和组织的特点，转基因技术有着非常广阔的实际应用前景。 目前，全世界进入田间试验的转基因植物已超过500种，从基因工程农作物大田试验的种类上看，试验次数最多的是抗除草剂类的基因工程作物，其次是抗虫类的基因工程作物，其三是品质改良、抗病毒和抗真菌类的工程作物。已进入大田试验的基因工程农作物品种有玉米、马铃薯、番茄、大豆、棉花、瓜类、油菜、烟草、甜菜等，同时还有水稻、小麦、葡萄、甘蔗、核桃、苹果、花生、甘蓝等进入中型或小规模大田试验，并已有多种基因工程农作物成为商品，进入市场。 我国的转基因发展 我国上海世华植物基因工程有限公司研究成功的一项世界首创的高科技产品——动物角蛋白种基因棉花于1999年诞生。这使得传统意义上的棉花纤维中，首次有了兔毛（或羊毛）的品质。由于培育出抗病、抗虫害的转基因植物，可避免使用化学农药，因此转基因技术在环境保护方面也具有重要的意义。 人们的态度 各各国政府、学术界和消费者对由于基因插入所可能带来的新的食用安全性问题给予了关注.为加强转基因食品的安全管理,许多国家都立法加强转基因食品安全的管理,我国农业部颁布了<农业转基因生物进口安全管理办法>和<农业转基因生物标识管理办法>[转基因作物及其产品的食用安全性除了与一般食品所共有的问题外,还有其独特的安全性问题,因用传统的食品安全性评价程序和方法来评价转基因食品的安全性不太合适.国政府、学术界和消费者对由于基因插入所可能带来的新的食用安全性问题给予了关注.为加强转基因食品的安全管理,许多国家都立法加强转基因食品安全的管理,我国农业部颁布了<农业转基因生物进口安全管理办法>和<农业转基因生物标识管理办法>[2,3],转基因作物及其产品的食用安全性除了与一般食品所共有的问题外,还有其独特的安全性问题,因用传统的食品安全性评价程序和方法来评价转基因食品的安全性不太合适. 不利 据报道，科学家研究发现，有些转基因生物产品可能含有有毒物质和过敏源，会对人体健康产生不利影响，严重的甚至可以致癌或导致某些遗传疾病。尽管到目前为止还没有有说

转基因技术及其应用

转基因技术及其应用 转基因动物 转基因动物是指用实验导入的方法将外源基因在染色体基因内稳定整合并能稳定表达的一类动物。1974年，Jaenisch应用显微注射法，在世界上首次成功地获得了SV40DNA转基因小鼠。到目前为止，人们已经成功地获得了转基因鼠、鸡、山羊、猪、绵羊、牛、蛙以及多种转基因鱼。 转基因动物技术 原核显微注射法 逆转录病毒载体法 胚胎干细胞介导法 精子介导法 转基因技术的应用 在基础理论方面的应用由于外源动物基因可在转基因动物细胞中整合、表达，并制约于受体基因背景的调控，因此，可把转基因本身当作一个理想的功能标记，进而在理论实践方面得到应用： 可以对基因的结构和功能进行研究，Jacob和Kollaid等用两种不同的基因的局部片段组合成融合基因，做转基因工作，观察了这些异常的外源基因在宿主动物中的表达情况，并进行了有意义的探讨。 可以进行组织表达特异性研究，Fukamizu等用含有转录起点上游3Kb，下游1.2Kb的人肾素基因构建转基因小鼠。 还可以研究发育过程的特异性表达。将不同的外源基因转入宿主动物受精卵或早期胚胎干细胞，可观察研究目的基因在胚胎不同发育阶段的特异性表达、闭关及调控机理。应用于动物生产 在医学领域中的应用 建立诊断和治疗人类疾病的动物模型 生产可用于人体器官移植的动物器官异源器官移植可能是解决世界范围内普遍存在. 器官短缺的有效途径，目前对器官供体动物研究较多的是猪。猪作为人类器官移植的供体动物有以下一些优势：妊娠期短，产仔数多，后代生长快，而且不存在伦理方面的问题。更重要的是猪的不同发育时期的器官，诸如心脏、肾等与不同年龄的人的器官在大小上比较接近，极有可能代替病人的某些器官。 美:能发红光的转基因鱼 在美国得克萨斯州，一种能发红色荧光的

DNA技术的应用

DNA技术的应用 20世纪50年代，DNA双螺旋结构被阐明，揭开了生命科学的新篇章，开创了科学技术的新时代。随后，遗传的分子机理――DNA复制、遗传密码、遗传信息传递的中心法则、作为遗传的基本单位和细胞工程蓝图的基因以及基因表达的调控相继被认识。至此，人们已完全认识到掌握所有生物命运的东西就是DNA和它所包含的基因，生物的进化过程和生命过程的不同，就是因为DNA和基因运作轨迹不同所致。 知道DNA的重大作用和价值后，生命科学家首先想到能否在某些与人类利益密切相关的方面打破自然遗传的铁律，让患病者的基因改邪归正以达治病目的，把不同来源的基因片段进行“嫁接”以产生新品种和新品质……于是，一个充满了诱惑力的科学幻想奇迹般地成为现实。这是发生在20世纪70年代初的事情。 实现这一科学奇迹的科技手段就是DNA重组技术。1972年，美国科学家保罗?伯格首次成功地重组了世界上第一批DNA分子，标志着DNA重组技术――基因工程 如今，DNA作为生物体的遗传物质，人类对DNA的研究越来越深，了解越来越多，DNA技术应用也越来越广泛，如基因工程，环境检测，环境净化，农业，畜牧业，食品业，药品和基因治疗，克隆等，这些应用也在不同的领域上造福着人类。在将来，DNA技术也必定会有更加广泛的应用。

既然DNA决定生物体的遗传，决定生物体的形状，从理论来讲，将DNA重组，将会改变生物的性状。那么，假如将DNA技术中的基因工程、克隆结合起来，就有可能会创造出不曾存在的生物体，也就是所谓的“生化技术”。 试想，将一个人的体细胞像克隆绵羊多利一样，制造出一个“受精卵”，再通过基因工程，将这个“受精卵”的DNA 重组、改造，形成一个胚胎并进行培育。一段时间后，一个崭新的生物体——“生化人”就会诞生：长有翅膀可以在空中飞翔、长有鱼鳃鱼鳍可以在水里游泳、长有跳蚤一样的弹跳蛋白可以跳得更高更远、长有鹰一般锐利的眼球可以望到千里之外……若再加上大脑移植技术，这个身体就属于你了，你也就会成为“超人”或者是其他更高的称号。不仅如此，你可以借助这个身体做许多正义的事：打击罪犯、保护国家、维护和平…… 这一切看上去似乎很美好，然而，真要达到这样的技术，对于现在来说也是很难的：该怎样选取基、该将细胞放在一个什么样的环境里培养、将胚胎培养多久、在大脑移植过程中是否会出现器官排斥、原先的大脑能否操控新的身体等等。 不仅如此，正如人们现在所考虑的克隆人是否会违反伦理道德等因素一样，培养一个“生化人”将会带来同样的甚至是更多的纷争：这个“生化人”是人类还是其他物种、在