酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵3(DOC)
酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵
吴英玲 10197020 10生物创新班
摘要：酵母菌喜欢酸性环境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培养酵母菌，然后在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内
4 ℃下保存。用TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的酵母菌。并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行微生物鉴定。采用PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行酒精发酵。
关键词：酵母菌分离鉴定固定化酒精发酵
Abstract: Yeast like acid environment, the use of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and duchenne tubular observation screen high fermentation
ability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation。
前言
酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸
入细胞内，在无氧的条件下，经过体内酶的作用，把单糖分解为二氧化碳和酒精。此作用即酒精发酵。
C6H12O6(葡萄糖)→2 C2H5OH(酒精)+2 CO2↑
在酿酒酵母酒精发酵的生产和应用中，由于细胞破碎和酶纯化等操作往往导致酶活性和稳定性都受影响，从而降低产酒精效率。而利用细胞固定化可以很好的解决这一问题。微生物细胞固定化方法主要有三种：载体结合法，交联法和包埋法，其中固定包埋法是目前比较理想的方法。包埋法就是将微生物细胞均匀地包埋在多孔的水不溶性的紧密结构中，细胞中的酶处于活化状态，因而活性高，活力耐久。目前，利用聚乙烯醇（PVA）—海藻酸盐是包埋法中比较高效的一种，这种方法以PVA-海藻酸钠作为混合溶胶，将酵母细胞固定起来进行酒精发酵，不仅可以使细胞浓度增加，而且可以多次使用，减少了酵母培养增殖所消耗的糖分；操作简单、过程迅速、颗粒不粘连、颗粒强度大大提高，且增加了颗粒的生物活性和稳定性，因此可实现连续化生产，提高酒精生产效率。
1.材料与方法
1.1 材料
1.1.1材料与试剂
成熟葡萄皮、酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂、豆芽、去离子水、PVA 、海藻酸钠、CaCl2、红糖、异丙醇、乙醇、液氮、Taq酶、dNTPs、引物、酵母膏，葡萄糖，(NH4)2SO4，K2HPO4?3H2O，
MgSO4?7H2O、H2SO4 ，1% K2Cr2O7 ，10% NaOH等
1.1.2培养基
乳酸豆芽葡萄糖培养液：豆芽（60 g）、葡萄糖（6 g）, pH 值
4.5 。
YPG培养基（500 ml）：酵母膏（5 g）、蛋白胨（10 g）、葡萄
糖（10 g）、琼脂（10 g）、pH值6.5～6.8。
TTC上层培养基：TTC 0.05 g、葡萄糖0.5 g、琼脂1.5 g、水
l00 ml。
酒精发酵培养液：红糖100 g， (NH4)2SO4 2.0 g，KH2PO4 1.0 g，
pH自然，去离子水定容至1000 ml。
1.1.3 实验器材
酒精计、试管、杜氏小管、移液枪、滴管、显微镜、三角瓶、烘箱、烧杯、PCR仪，电泳仪、、接种环、电磁炉、报纸、橡皮筋等、玻璃棒、三角瓶、培养皿、试管、吸管、移液枪、漏斗、纱布、瓷缸、刮铲、载玻片、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、载玻片、盖玻片
1.2 实验方法
1.2.1 酵母菌的分离与培养
取葡萄皮于90 ml无菌水，放置于摇床150 rpm，摇晃5 min，取出后稍静置。用无菌枪头吸取上清液1 ml接入9 ml的乳酸豆芽葡萄糖培养液中，置28～30℃烘箱中培养48小时。富集后用碘液染色后镜检。然后用接种环在事先灭菌的YPG固体划线并置于28～30 ℃再培养48 h，得到酵母初筛单菌落，观察菌落，用碘液简单染色镜检。
1.2.2 发酵菌株的筛选
向划线分离的YPG培养基上倒入TTC上层培养基，30 ℃下保温(阴暗处)2～3 h。比较各菌株间的颜色深浅，颜色深的菌株呼吸酶活力强，有较强的产酒精能力。选取平板中对应的颜色较深的10株菌，作为二级筛的出发菌株。
选取上述显色较深的酵母菌落，挑取一接种环接入乳酸豆芽葡萄糖培养液中，同时试管内倒置一杜氏小管，培养24 h后，观察杜氏管中产气情况。打开棉塞，嗅闻是否有酒精气味。记录产气及酒精气味情况，并与显色情况进行比较。
1.2.3 发酵菌株的鉴定
进行形态学鉴定：A．菌落形态观察，按普通微生物实验指导书观察所分离的真菌菌落特征。B. 细胞形态学观察，按普通微生物实验指导书简单制片法观察，先低倍镜，后高倍镜观察。
分子生物学鉴定：主要对核糖体小亚基16SrRNA进行PCR扩增鉴定，挑取形态学观察符合酵母特征的菌落作为扩增模版进行PCR，PCR体系(25ul)为：
表一 PCR反应体系
ddH2O
10×PCR buffer（without MgCl2）
MgCl2 (25 mM)
dNTP(10 mM)
5’primer(10 mM)
3’primer(10 mM)
Template（50 -500 ng/μl）
Taq DNA polymerase(5U/μl)
34.6 μl
5 μl
4 μl
1 μl
2 μl
2 μl
1 μl
0.4 μl
Total 50 μl
94℃预变性 5 min
94℃变性 30 sec
52℃退火 30 sec 40个循环
72℃延伸 60 sec
72℃延伸 5 min
4℃保温（到达此温度时停止PCR扩增，将PCR管取出）
将符合要求的样品，按公司测序订单要求填写。测序结果登陆NCBI网站，进行在线比对分析。
1.2.4酿酒酵母细胞PVA-海藻酸钠固定化技术
菌种活化：挑取酵母菌斜面菌种一环，接1环斜面菌苔于装有20mL培养基的150mL三角瓶中活化，置于恒温摇床内，150r/min培养24 h，25 ℃培养30 h。再将其用0.85%生理盐水制成菌悬液，酵母数控制在108个/ml。
固定化：聚乙烯醇PVA-海藻酸钠混合胶于无菌烧杯中加热融化，冷却至45 ℃左右。酵母菌液（预热至35 ℃左右）与聚乙烯醇PVA-海藻酸钠按1: 4比例（v/v）混合均匀后，制备固定化细胞。用注射头直径为2 ml注射器以恒定速度滴到250 ml三角中，瓶中预先盛有50 ml的含2 % CaCl2溶液使形成凝胶珠。然后取60粒凝胶珠加入150 ml无菌葡萄糖培养液中，置25 ℃下发酵4d，测定其酒精含量。
2.结果与分析
2.1 发酵菌株初筛结果
将葡萄皮中的酵母菌进行富集培养后酵母菌生长迅速，在液体培养基中比霉菌生长得快。不同组材料来源不同，结果显示葡萄皮中的酵母菌数量较多。故而在酒精发酵中，酵母菌选择的来源非常重要。在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌，48h后观察菌落。图一菌落呈乳白色，表面湿润、粘稠，易被挑起。图二为高倍镜下观察到的酵母菌，箭头处明显观察到酵母菌的出芽生殖方式，几乎呈链状。图三为平板划线后分离单菌落。
图发酵菌株初筛结果
2.2 TTC法筛选酵母及酵母产气情况
TTC(2，3，5一氯化苯基四氮哇)是一种显色剂，它对酵母的代谢产物发生呈色反应，通过它可以判断酵母中呼吸酶活力的大小，在YPG培养基上覆盖TTC上层培养基培养后出现深红色菌落，说明该菌株产酒精能力较强。酵母进行酒精发酵过程会产生CO2，根据杜氏小管中产气多少可以间接判断酵母发酵能力的强弱。再进一步挑取红色较深的菌落进行产气检验发现杜氏小关中气体较多，进一步说明所筛选的菌株具有较强的发酵能力，可以进行后续操作。图四TTC法筛选正面图，图五为TTC法筛选反面，图六产气检验结果。由第四管看出，CO2仍在不断产生气体，故而在后续操作中用此管中的酵母菌进行操作。
图 TTC法筛选酵母及酵母产气情况
表二酵母菌落显色深浅与杜氏小管中产气多少之间的关系管号颜色产气量
1号粉红++
2号红+++
3号粉红+
4号深红++++
2.3 分子生物学鉴定
挑取发酵能力较强的菌落进行菌落PCR，电泳结果如图七，条
带约为450bp，可以进行测序。测序结果登陆NCBI网站，进行在线
比对分析。该序列与编码Irpex lacteus isolate T2b（Han,G., Feng,X. and Tian,X）的18S rRNA基因的部分序列有57%的相似
度。图八和图九为序列比对结果。(此处仅展示分子生物学鉴定方法)
图菌落PCR结果
图序列比对结果
2.4酿酒酵母细胞PVA-海藻酸钠固定化
打开固定化细胞发酵的三角瓶，与未加凝胶珠的瓶子对比，嗅闻有酒香气，上层溶液有浑浊，凝胶珠形状是完好无损。与其他组实验结果进行比较，从而选出酒精浓度最高一组，进行旋转蒸发获得高浓度酒精。
3.讨论与反思
（1）本实验采用平板分离酵母菌时，培养时间不应该过长，因为长时间培养增加了染霉菌的可能性（图三），并且若需得到纯度较高的酵母菌则需进一步进行平板划线分离酵母菌菌株。因此控制霉菌生长很重要，可采取多步平板划线的方式克服此难关。
（2）富集培养后需对溶液中酵母进行死活统计，从而初步判断此次富集的酵母菌的生存能力是否满足工业酵母生存能力。死活统计的方法有0.l%美蓝染色液染色法，活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌体不着色。
（3）表一中总结出TTC染色后，菌落颜色深浅和产气量的关系，颜色越深，产气量越多，故在后期酒精发酵时应挑取菌落颜色深的，提高酒精产量。
（4）微生物鉴定时需要采取不同的方法进行生物学鉴定，形态学鉴定时有可能出现杂菌，导致观察失误。分子学鉴定也可能产生假阳性，故在鉴定时不同方法之间要相互验证，使结果更具有说服力。
（5）固定化培养酵母进行酒精发酵时，凝胶珠中细胞浓度增加，而且可以多次使用，减少了酵母培养增殖所消耗的糖分；操作简单、过程迅速、颗粒不粘连、颗粒强度大大提高，且增加了颗粒的生物活性和稳定性，因此可实现连续化生产，提高酒精生产效率。但在凝胶珠中，代谢物的积累可能影响酵母的生长繁殖和产酒精量，本人推测这可能与凝胶珠的大小有关系，故针对此处设计实验。
实验设计：
1.PVA-海藻酸钠融化45℃，加4ml酵母菌液滴加至50ml 1%
Ca(NO3)2中，滴加时可选取直径大小不同的针孔，按直径大小设置梯度。
2.无菌水洗涤凝胶珠3次，-20℃冷冻12h、4℃解冻风干、室温
备用。
3.按不同梯度各取100粒凝胶珠加入150 ml无菌葡萄糖培养液
中，置25 ℃下发酵7-9 d。
4.比较各组培养液中酒香程度，上层溶液浑浊情况，凝胶珠形状
完好程度进行比较，从而初步得到凝胶珠大小和产酒精量的关系。
5.进一步进行验证，将各瓶中得酒精用旋转蒸发仪蒸发出，通过
测量酒精量得出最佳凝胶珠大小。
酵母菌的分离筛选方法
酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条 件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明， 菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色， 圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。 含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1.培养基： 葡萄糖 50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L L L MgSO41g/L FeSO4 L 酵母膏 L 孟加拉红 L （富集用） ★乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用蔗 糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱布 过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培养 用）（富集用） ★麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过 滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15波林，氯霉素L 121℃ 20min （分离保存 用） 灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用） ★虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨L 葡萄糖10g/L L L 孟加拉红L 氯霉素L 琼脂15g/L PH自然 （分离纯化用）
★豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L 察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用 蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾L 硫酸镁 L 硫酸亚铁L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然 一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。 实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。 3.筛选：
酵母菌的分离纯化
酵母菌的分离纯化-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN
酵母菌的分离纯化、固定化和酒精发酵 第一部分酵母菌的分离纯化 一、实验目的 应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。 二、实验原理 酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为酵母菌生长迅速，容易分离培养。在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。 三、器材和用品 1、甘蔗、苹果皮、葡萄皮、果园土、菜园土等。 2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。分装三角瓶；试管斜面1支/组 3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为左右，再分装试管9ml2支/组。 4、无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、美兰染液、显微镜、接种环等。 四、实验方法 1、接种：取果皮（不需冲洗）或土壤5克，加入到100ml无菌水中，充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h，可见培养液变浑浊。 2、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1m l，注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h。 3、镜检：用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上，中央滴一滴美兰染液，混合均匀后制成水浸片，在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式，并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因活细胞使美兰染液还原，故菌体不着色。 4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h。 5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分
生物化学实验五 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定
实验五酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 一、目的要求 学习和掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法；了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 二、实验原理 酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 三、器材与试剂 1〉材料 酵母粉。 2〉器材 乳钵、150ml锥形瓶、水浴锅、量筒、吸管、洗耳球、漏斗、滴管、试管、试管架、烧杯、离心机、滤纸、试管夹。 3〉试剂 (1) 0.04mol/L氢氧化钠溶液。 (2)酸性乙醇溶液：将0.3ml浓盐酸加入30ml的乙醇中。 (3)95%乙醇。 (4)乙醚。 (5)
1.5mol/L硫酸溶液。 (6)浓氨水。 (7) 0.1mol/L硝酸银溶液。 (8)三氧化铁-浓盐酸溶液： 将2ml 10%三氧化铁溶液(用FeCl 3·6H 2O配制)加入到400ml浓盐酸中。 (9)苔黑酚乙醇溶液： 溶解6g苔黑酚于100ml 95%乙醇中。 (10)定磷试剂。 a.17%硫酸溶液： 将17ml浓硫酸(比重 1.84)缓缓加入到83ml水中。 b. 2.5%钼酸铵溶液：将2.5g钼酸铵溶于100ml水中。 c.10%抗坏血酸： 将10g抗坏血酸溶于100ml水中，储于棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄色或棕色则失效。 临用时将上述3种溶液与水按比例混合：17%硫酸溶液︰ 2.5%钼酸铵溶液︰10%抗坏血酸︰水=1︰1︰1︰2(体积分数)。
四、实验步骤 1〉RNA提取 将10g酵母悬浮于90ml 0.04mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150ml 锥形瓶中。在沸水浴上加热30min后，冷却。(3000r/min)离心10分钟，将上清液缓缓倾入30ml酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，(3000r/min)离心5分钟。弃去上清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次，每次10ml。乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至漏斗中过滤。沉淀即为粗RNA，可在空气中干燥。作鉴定或测定含量用。 2〉鉴定 取200mg提取的RNA，加入 1.5mol/L硫酸溶液10ml，在沸水浴中加热10min制成水解液并进行组分的鉴定。 (1)嘌呤碱： 取水解液1ml加入过量浓氨水，然后加入约1mL 0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。 (2)核糖： 取一支试管加入水解液1mL、三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液 0.2ml。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。 (3)磷酸： 取一支试管，加入水解液1ml和定磷试剂1ml。在沸水浴中加热10min，观察若溶液变成蓝色，说明有磷酸存在。 五、结果处理
酵母菌酒精发酵实验报告
实验方案 酵母菌酒精发酵的条件研究 学院（部）：生物与化学工程学院 专业：生物工程 学生姓名：鑫 学号：11018150 班级：生物工程二班 指导教师：肖
一、实验目的 1、学会实验的设计和操作过程 2、找到酵母菌发酵时的最优条件 二、培养基和实验方法及材料的确定 1、玉米粉的糖化方法 玉米粉的糖化采用双酶法，其工艺流程如下 玉米粉→加水→液化→糖化→发酵→蒸馏→成品酒精 试验中，发酵培养按照三角瓶100ml培养。本次工做20组是要，共需发酵液20*100=2000ml。培养液按照100g玉米粉、300ml水。所以共需玉米粉700g。 液化：取１００ｇ玉米粉，加入３００ｍＬ的水，液化温度为９０℃，ｐＨ值为５．５，液化时间为３．５ｈ，液化酶的添加量为０．０３５ｇ／１００ ｇ玉米粉 糖化：糖化时的工艺条件为：糖化温度为５８℃，ｐＨ值为４．５，糖化时间为３．５ｈ，糖化酶的添加量为０．３ｇ／１００ｇ玉米粉。 2、活化培养基 本实验在进行实验时采用察氏(czapck)培养基的配制，配方如下表一： 表一 3、扩大培养基 扩大培养仍然用察氏(czapck)培养基，由于要用液体的，所 以将其中的琼脂配料去掉。 4、发酵培养基
糖化液稀释至l0%浓度，添加辅料（硫酸铵0.4%），pH5.5 灭菌 三、培养基的制备及酵母的活化 1、准备酵母母菌一支常温下存放一天，增加菌种的活力。在母菌存放期间制作各时期培养基 2、准备固体培养基（察氏培养基）50ml，做成8支试管斜面，扩大培养基800ml（做扩大培养时使用）。做成8个三角瓶，每瓶200ml。120℃灭菌30min。 3、发酵液的制备 （1）玉米粉的筛选 实验前准备粉碎后的玉米粉700g。 （2）玉米粉的液化 按照100g玉米粉、300ml水的配比对玉米粉进行液化，液化方案上文已经交代。在1000ml烧杯里，或者500ml烧杯分两次，水浴液化。 器材：烧杯500ml两个，玻璃棒一个，水浴锅一个，糖化酶0.225g 步骤：1、将糖化酶，玉米粉，水按照比例配置好在烧杯里。2、将配好的玉米液放于水浴锅中90℃液化3.5h。边液化边搅拌。 （3）玉米粉的糖化 将液化后的玉米液中按照0.3g/100ml加入液化液中。再在水浴锅中，58℃糖化3.5h。 （4）过滤 糖化后的糖化液有可能有没有彻底液化的玉米颗粒，会造成浑浊，这时需要对糖化液进行过滤操作。 操作步骤： 最后与以上培养基一起进行灭菌处理。灭菌时，清洗16支移液管，与培养基一起灭菌。 （5）活化步骤 器材：酒精灯，接种针，母菌，斜面培养基，消毒酒精。 步骤：1、将器材放于实验台上。对双手合桌面进行灭菌。对接种针进行灼烧灭菌。2、在酒精灯旁按照无菌操作步骤在酒精灯火焰旁取
传统酸面团中细菌与酵母菌的分离与鉴定
传统酸面团中细菌与酵母菌的分离与鉴定 刘同杰1，李云1，吴诗榕1，金乐天1，2，张国华1，杨浣漪1，何国庆1 （1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江省食品微生物技术重点实验室，浙江大学馥莉食品研究院，浙江杭州 310058）（2.朝鲜韩德秀平壤轻工业大学，朝鲜平壤） 摘要：为进一步描述我国传统面食发酵剂的理化性质和菌落组成，收集了北方地区6份发酵剂样品，测定了其酸度和菌落总数，并对分离、纯化、初筛后得到的75株细菌和60株酵母菌进行了测序鉴定。结果显示，样品pH值范围为3.73~5.46，总滴定酸度为8.3~19.8 mL；乳酸菌和酵母菌的计数结果分别为8.35±0.07~9.75±0.12 Log cfu/g，6.31±0.22~8.68±0.04 Log cfu/g。鉴定出包括短乳杆菌 （Lactobacillus brevis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和旧金山乳杆菌（Lactobacillus sanfranciscensis）在内的乳酸菌8种；酵母菌4种，其中优势菌为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；其他细菌6种，主要为解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）、地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）和醋杆菌。结果表明，我国传统面食发酵剂菌相复杂，以酵母菌和乳酸菌为主，还包括芽孢杆菌、醋酸杆菌在内的多种其他细菌，甚至可能含有致病菌。通过比较细菌和酵母在不同酸面团样品中的分布，发现不同来源样品的微生物种类组成存在差异。 关键词：酸面团；菌相分析；16S/26S rDNA测序；生物多样性；系统发育树 文章篇号：1673-9078(2014)9-114-120 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2014.09.020 Isolation and Identification of Bacteria and Yeast from Chinese T raditional Sourdough LIU T ong-jie1, LI Yun1, WU Shi-rong1, JIN Le-tian1,2, ZHANG Guo-hua1, YANG Huan-yi1, HE Guo-qing1 (1.College of Biosystems Engineering and Food Science of Zhejiang University, Zhejiang provincial key laboratory of Food Microbiology, Fuli Institute of Food Science of Zhejiang University, Hangzhou 310058, China) (2.DPRK Han Dexiu Pyongyang University of light industry, Pyongyang, DPRK) Abstract: In this study, the physicochemical properties and microbial profile of traditionally fermented sourdough for Chinese steamed bread were examined. Six samples of sourdough were collected from northern China. Acidity and colony counts were measured. After isolation, purification, and preliminary screening, 75 strains of bacteria and 60 strains of yeasts were obtained and identified by DNA sequencing. The pH was between 3.73 and 5.46 and total titratable acid (TTA) values ranged from 8.3 to 19.8 mL. In all the samples, the number oflactic acid bacteria (LAB) and yeasts ranged from 8.35±0.07 to 9.75±0.12 Log cfu/g and 6.31±0.22 to 8.68±0.04 Log cfu/g, respectively. Eight LAB species, including Lactobacillus brevis, L. plantarum, and L. sanfranciscensis, and six other bacterial species, including Bacillusamyloliquefaciens, Bacilluslicheniformis, and three species of Acetobacter, were identified. Among the four identified yeasts, the dominant species was Saccharomyces cerevisiae. The results indicate that Chinese traditional starter cultures for flour-based food are complex bacterial floras dominated by LAB and yeast, in addition to several other microorganisms, including Bacillus spp., Acetobacter spp., and even pathogenic bacteria. Differences in microbial species compositions among LAB and yeasts in samples from different areas were identified by comparing species distributions in different sourdough samples. Key words: sourdough; elucidation of microbial flora structure; 16S/26S rDNA sequencing; biodiversity; phylogenetic tree 我国传统的面食发酵剂类似于西方发酵面包用的酸面团，在我国一般被称为“老面”、“酵子”、“面收稿日期：2014-04-17 基金项目：国家自然科学基金资助项目（31371826） 作者简介：刘同杰（1989-），男，在读博士，研究方向：传统发酵食品通讯作者：何国庆（1957-），男，博士，教授，研究方向：食品生物技术及发酵工程肥”等[1]，具有悠久的使用历史。上世纪80年代，即发活性干酵母被引入我国，因其使用便捷，传统面食发酵剂逐渐被取代，但直到现在仍有很多地区尤其农村地区，仍然使用其制备馒头等主食，因使用传统面食发酵剂制备的馒头品质更优。究其原因，活性干酵母为单一菌种发酵，与传统发酵剂的混菌体系发酵相比，发酵的馒头风味平淡、香气不佳，总体的感官品 114
实验 酵母RNA的分离及组分鉴定
※实验六酵母RNA的分离及组分鉴定 【实验目的】 了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 【实验原理】 酵母核酸种RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 鉴定依据：磷酸与定磷试剂反应产生蓝色物质。核糖与苔黑酚作用产生绿色物质。嘌呤碱与硝酸银能产生白色的嘌呤碱银化合物沉淀。 【实验器材】 150 ml锥形瓶、水浴、量筒、漏斗及抽虑瓶、吸管7、滴管8、试管及试管架9、烧杯、离心机、漏斗 【试剂和材料】 1、0.04 mol/L氢氧化钠溶液； 2、酸性乙醇溶液：将0.3毫升浓盐酸加入30毫升乙醇中； 3、95%乙醇； 4、乙醚； 5、1.5 mol/L硫酸溶液； 6、浓氨水； 7、0.1 mol/L硝酸银溶液； 8、三氯化铁浓盐酸溶液：将2 ml 10% 三氯化铁溶液（用FeCl3·6H2O配制）加入到400 ml浓盐酸中； 9、苔黑酚（地衣酚）乙醇溶液：溶解6 g苔黑酚于100 ml 95% 乙醇中（可在冰箱中保存一个月）； 10、定磷试剂：（1）17% 硫酸溶液：将19 ml浓硫酸（比重1.84）缓缓加入到83 ml 水中（2）2.5% 钼酸铵溶液：将2.5 g钼酸铵溶于100 ml水中（3）10% 抗坏血酸溶液：10 g抗坏血酸溶于100 ml水中，贮棕色瓶保存（溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失败，需纯化抗坏血酸）。临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。17% 硫酸溶液：2.5%
酵母菌分类
酵母菌分類 根據荷蘭Lodder & Kreger-van Rij 所著“The Yeasts, A Taxonomy Study” 分類主要依據是 1. 形態 2. 對硝酸鹽或碳源的利用 3. 對糖的發酵性 形態與大小：因酵母種類不同而不同，同一種也會因培養條件或發育時期不同而有異，一般直徑約在5 μm，顯微鏡40X及100X接物鏡下皆可觀察到。 cerevisiae型：球形與卵形(如啤酒酵母Saccharomyces cereviisiae) ellipsoideus型：橢圓形(如葡萄酒酵母Saccharomyces ellipsoideus) pastorianus型：香腸形 apiculatus型：檸檬形 trigonopsis型：三角形 增殖法：主要為營養增殖(即出芽生殖(budding))，偶而發生有性生殖時則行子囊胞子來增殖。 母細胞(mother cell)：原來的細胞 子細胞daughter cell)：增殖後的細胞 多極出芽(multilateral budding)：同一個細胞上數個地方可以出芽者 兩極出芽(bipolar budding)：只有細胞兩端才會出芽者(如Kloeckera spp.) 偽菌絲(pseudomycelium)：出芽後的細胞一直連成很長，呈菌絲狀者(如Candida spp.) 真菌絲(true mycelium)：有些酵母會形成如同黴菌具有隔膜(septum)的真菌絲(如Endomycopsis spp., Trichosporum spp.) 分裂酵母(fission yeast)：非出芽，而是在細胞中央形成隔膜再分裂成兩個細胞者(如Schizosaccharomyces spp.)
酵母菌的分离与纯化
酵母菌的分离与纯化 小组组员: 一、实验目的 1.学习分离纯化酵母菌的技术与方法 2.了解培养基的配置与灭菌技术 3.增强无菌操作技术的意识 二、基本原理 从混杂的微生物群体获得只含某一种某一株微生物的过程叫做微生物分离与纯化，酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为4.5-6.0.酵母菌生长迅速，容易分离培养。马丁氏培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基。此培养基是由葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、孟加拉红(玫瑰红，Rose Bengal)和链霉素等组成。其中葡萄糖主要作为碳源，蛋白胨主要作为氮源，KH2PO4和MgSO4·7H2O作为无机盐，为微生物提供钾、磷和镁离子。而孟加拉红和链霉素主要是细菌和放线菌的抑制剂，对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长，从而达到分离真菌的目的。 三、实验材料及用具 1.用品：苹果、葡萄糖、琼脂、水、1%孟加拉红水溶液、马铃薯 2.设备与器材：1ml的无菌吸管、无菌培养皿等. 四、实验步骤 1、马铃薯培养基的配置 培养基成分:马铃薯 40克、蔗糖（葡萄糖） 4克、琼脂 4克、水 200毫升、 pH 自然。配置方法: （1）配制20%马铃薯浸汁：取去皮马钓薯40g，切成小块，加水200ml.加热煮游30 min ，用纱布过滤，然后补足失水互所需体积。121Pa灭菌30min.即成20%马铃馨漫汁，贮存备用。 （2）配制时，按每100ml 马铃薯浸汁加入2g蔗糖，加热煮沸后加入4克琼脂，继续加热融化并补足失水。 （3）分装、加塞，包扎。 （4）高压蒸汽灭菌：121Pa灭菌30min
酵母菌的分离与纯化
酵母菌的分离与纯化 土壤是微生物生活的大本营，是寻早有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同图样中各类微生物的含量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。放线菌一般在较干燥、偏碱性、有机质较多的土壤中较多；霉菌在含有机质丰富、偏酸性、通气性较好的土壤中较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在酒曲、面肥、水果表皮、果园土壤中数量多些。（一）菌源 1土样用无菌的采样小铲在橘树果园中取土壤表层下1~10cm土壤10g，装入灭菌的牛皮纸袋内。封好袋口，记录取样地点、环境及日期。图样采集后应及时分离，饭不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥的条件下，以减少其中菌相的变化。 2面肥 （1）面粉500克，白酒100克，水250，和好静置发酵就可以了。冬季10个小时。（2）在温水中兑一点酒，倒入适量面粉拌匀后放入绝缘保温盛器（陶瓷，砂锅）中，用布将整个盛器盖好置于温度较高处，6小时后即成面肥。 *以上方法做出的面肥只能保存几天，不宜放置太久。 3水果果皮 桔子和葡萄等的果皮上含有数量较多的酵母菌，既可单独作为菌源也可以和果园土壤作为混合菌源。 （二）酵母菌的分离 1制备菌悬液 称取菌源1g，加入盛有99ml无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中。振荡20min，即成10-2的菌源悬液。再一次稀释成10-4、10-5、10-6三个稀释度。 2涂布法分离 取融化并冷却至45~50度左右的豆芽汁葡萄糖培养基，每皿分别倾注约12ml培养基到培养皿内。注意，温度过高易将菌烫死，皿盖上冷凝水太多也会影响分离效果；低于45度培养基易凝固，平板高低不平。呆平板冷却后，用无菌移液管分别吸取上述已经制好的菌源稀释液10-4、10-5、10-6三个稀释度菌悬液各0.1ml，依次滴加于相应编号的豆芽汁葡萄糖培养基平板上。每个稀释度做2~3个平行皿。左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，再火焰旁右手持无菌玻璃涂棒将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散。注意，切忌用力过猛，这样会将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。3培养 接种后，平版倒置于30度恒温箱中，培养2~3天，观察结果。 4纯化 用接种环挑取单个单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分离得到单个菌落。 酵母扩培方案 一、培养基制备 (一)麦芽汁培养基的配制 1．培养基成分 新鲜麦芽汁一般为10-15波林。 2．配制方法 (1)用水将大麦或小麦洗净，用水浸泡6-12h，置于15℃阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。 (2)取一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化，直
酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵3(DOC)
酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵 吴英玲 10197020 10生物创新班 摘要：酵母菌喜欢酸性环境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培养酵母菌，然后在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内 4 ℃下保存。用TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的酵母菌。并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行微生物鉴定。采用PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行酒精发酵。 关键词：酵母菌分离鉴定固定化酒精发酵 Abstract: Yeast like acid environment, the use of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and duchenne tubular observation screen high fermentation ability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation。 前言 酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸
酵母菌的分离纯化实验方案
酵母菌的分离纯化 ?实验目的 1.了解培养基的配置与灭菌技术； 2.无菌操作技术； 3.工业微生物的分离与纯化技术； 4.工业微生物的检测及保藏。 ?基本原理 1、培养基是人工配置的用于培养、分离、鉴定和保存各种微生物的营养基质。也适合微生物在生命活动中积累各种代谢产物。由于微生物种类不同，营养类型各异以及实验目的不同，因此培养基的种类也很多。不同微生物对营养的要求不同，在配置时根据微生物对PH 的要求选择合适的PH。由于本次实验主要是分离纯化酵母菌，所以配置的培养基是适合酵母菌生长麦芽汁平板培养基，同时添加抗生素抑制霉菌及其它菌的生长。 2、接种和培养过程中必须保证不被其它微生物所污染，关键在于严格进行正确的无菌操作，但是绝对无菌是不可能的，只能人工创造相对无菌的环境。所以本次实验无菌操作是在超净工作台的酒精灯火焰旁进行。 3、把特定微生物从混杂的微生物群体中分离出来而获得某一种或某一株微生物的过程叫微生物的分离与纯化。首先根据其生长特性设计只利于此菌生长的条件，再根据各种稀释法使他们在固体培养基上单独长成菌落。分离纯化的方法通常有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法和平板划线。此次实验采用梯度稀释涂布平板法。 4、微生物检测项目最常用的是细胞数的检测，方法比较多，主要有显微镜直接计数法、平板菌落计数法（CFU）、光电比浊计数法等。本次实验设计酵母菌的数量检测，选用显微镜直接计数法和平板菌落计数法。 实验器材 仪器设备 恒温水浴锅、电热干燥箱、蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、恒温摇床、水浴锅、电炉、铜锅、酒精灯、接种环、电子天平、研钵、光学显微镜、血细胞计数器 玻璃器皿 烧杯、锥形瓶、大小试管、培养皿、漏斗、三角涂棒、吸管、试管架、玻璃涂棒、盖玻片 试剂与材料 苹果、大麦芽、琼脂、蒸馏水、碘液、抗生素、染色液 其它 纱布、滤纸 ?实验内容及操作步骤 (一)、样品的选择 酵母菌一般在果园的土壤中或者水果的表面含量较多，因此选择苹果为样品。 （二）、样品的处理 制备苹果悬液 1.首先将1g苹果在研钵中磨细，放入装有10ml生理盐水和玻璃珠的100ml三角瓶中去。
酵母发酵酒精的研究进展
酵母发酵酒精的研究进展 （生命科学与技术学院微生物专业） 前言 人类利用酵母菌的历史已有几千年了。值得提出来的是，早在我国宋代的酿酒著作中，中国人已经明确记载了从发酵旺盛的酿酒缸内液体表面撇取酵母菌（当然不是纯粹的酵母菌）的方法，并把它们称为“酵”，风干以后制成的“干酵”可以长期保存。这种制造干酵母的原始方法说明，早在800年前，中国人已经意识到酒精发酵是由“酵”，即某种能生长的物质引起的。这种推断直到19世纪巴斯德才证明是酵母菌。明代末年出版的词书中记载有“以酒母起面曰发酵”，“发酵，浮起者是也”等解释。这说明至少在那时，一引起细心观察自然现象和注意比较的学者，已经认识到发面和酿酒有某种相同的因素在起作用。当时在欧洲虽然已经发现了酵母菌，但在200年后才知道酵母菌的作用。今天我们把这类微生物称酵母菌，正是以此为根据的。 酵母菌能够把糖变成酒精，是因为它的细胞里有催化剂，这些存在于生物细胞的催化剂在科学上叫做酶。虽然现在知道所有的生物都是靠酶催化的化学反应来生活的，但最早发现的酶，就是酵母菌的酶。酵母菌中最早发现的酶，是把糖变成酒精的一群酶，当时自然数酒化酶。由于这种酶的作用，使糖分解成酒精和二氧化碳，这就是利用酵母菌酿酒和发面包的原理。使面团产生许多空隙的就是二氧化碳。酵母细胞大小为2.5-10μm×4.5-21μm, 在加盖的玉米琼脂上不产生假菌丝或有不典型的假菌丝, 营养细胞可直接变为子囊, 每囊有1-4个圆形光面的子囊孢子, 在麦芽汁25℃培养3d, 细胞为圆形、卵形、椭圆形和香肠形。其菌落在麦芽汁琼脂上为乳白色, 有光泽, 平坦, 边缘整齐。菌体维生素、蛋白质含量高, 既可食用又可提取细胞色素C、核酸、麦角固醇、谷胱甘肽、凝血质、辅酶A、三磷酸腺苷等。该菌种能发酵葡萄糖、麦芽糖、半乳糖及蔗糖, 但不能发酵乳糖和蜜二糖, 不同化硝酸盐。 酵母菌的繁殖方式既可进行无性繁殖，如芽殖，又可进行有性生殖；酵母菌既可进行有氧呼吸，又可进行无氧呼吸，是一种兼性厌氧呼吸的真核微生物。单细胞真核生物酿酒酵母基因组为12,068kb，比单细胞的原核生物和古细菌大一个数量级。酿酒酵母基因组共有5887个ORF，这比原核生物和古细菌要多很多。酿酒酵母的基因密度为1个基因/2kb，密度小于原核生物流感嗜血杆菌和尿殖道支原体等。酿酒酵母是最小的真核基因组，裂殖酵母其次，其密度是1/2.3kb，简单多细胞生物线虫的基因密度为1/30kb。第二、酿酒酵母只有4%的编码基因有内含子，而裂殖酵母则有40%编码基因有内含子。 1、酵母的生长条件 1.1 无机盐
酵母菌酒精发酵实验报告
酵母菌酒精发酵实验报告 实验方案 酵母菌酒精发酵地条件研究 学院（部）：生物与化学工程学院 专业：生物工程 学生姓名：鑫 学 班 指导 1 2 ｇ玉米粉 糖化：糖化时地工艺条件为：糖化温度为５８℃，ｐＨ值为４．５，糖化时间为３．５ｈ，糖化酶地添加量为０．３ｇ／１００ｇ玉米粉. 活化培养基 本实验在进行实验时采用察氏(czapck)培养基地配制，配方如下表一：
表一 扩大培养基 扩大培养仍然用察氏(czapck)培养基，由于要用液体地，所以将其中地琼脂配料去掉. 1 2 3 （1 （2 按照 中90℃液化3.5h.边液化边搅拌. （3）玉米粉地糖化 将液化后地玉米液中按照0.3g/100ml加入液化液中.再在水浴锅中，58℃糖化3.5h. （4）过滤 糖化后地糖化液有可能有没有彻底液化地玉米颗粒，会造成浑浊，这时需要对糖化液进行过 滤操作.
操作步骤： 最后与以上培养基一起进行灭菌处理.灭菌时，清洗16支移液管，与培养基一起灭菌. （5）活化步骤 器材：酒精灯，接种针，母菌，斜面培养基，消毒酒精. 步骤：1、将器材放于实验台上.对双手合桌面进行灭菌.对接种针进行灼烧灭菌.2、在酒精灯旁按照无菌操作步骤在酒精灯火焰旁取下试管棉塞.3、将灼烧后地接种针伸入母菌试管取粘 培养. ， 不同菌量下地发酵 器材：扩大菌种，移液管四个，酒精灯，发酵液，洗耳球. 步骤：1、将实验器材放于实验台上.2、用移液管移取8%地扩大菌种到发酵液中.3、塞好棉塞，将发酵液存放于30℃条件下发酵2d.4、按照以上步骤，分别移取10%、12%、14%地扩大菌种到发酵液中，30℃培养2d，之后进行酒精检测. 不同醪液浓度下地发酵
酵母菌的培养与分离
. . . 微生物学大实验 实验指导 编者： 生物技术教研室 2007.3
目录 实验一酵母菌的培养与分离‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥2 实验二酵母菌的鉴定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥7 实验三酵母菌耐受能力的测定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥19 实验四酵母菌发酵工艺条件的优化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥22 实验五耐高温酵母菌株的诱变选育‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥24 实验六酿酒酵母细胞固定化与酒精发酵‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥27
耐高温酒精酵母菌的选育及发酵条件的研究 实验一酵母菌的培养与分离 一、实验目的 学习培养和分离酵母菌的技术和方法 二、基本原理 大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH为4.5－6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。 利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离之。 三、实验主要内容和要求 （一）本次实验的方案由同学们自己制定，实验包括： 1．马铃薯葡萄糖培养基, 乳酸马铃薯葡萄糖培养液的配制。 2.菌株的筛选,根据一定的生产目的并从特定的样品筛选出高产酒精的适宜的酵母菌株。 3.酵母菌的分离,要求接种一次, 28-30℃，培养24小时，转接一次，28-30℃，培养24小时，并用镜检的方法独立判定所分离菌株是否为酵母菌。 4.用划线分离法对酵母菌进行纯化，要求每组挑取单个菌落，连续划线分离4代，镜下为单一纯菌株，每组扩繁10支斜面菌种，备用。 四、实验的准备 1、甘蔗、成熟葡萄或苹果等果皮、0.1%美蓝染液、1ml的无菌吸管、无菌培养皿等。 2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基： 原料：马铃薯（200克）、葡萄糖（20克）、琼脂（15-20克）、蒸馏水（1000ml）。 配制方法： （1）先将马铃薯去皮，切片，称200克并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml ，制成20%的马铃薯汁。 （2）在20%的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，补足水分并在115℃条件下高压灭菌20分种。 （3）加入葡萄糖，制成培养酵母菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
酵母菌的分离纯化
微生物学课程设计专业：生物技术 姓名：符英康 学号：1040521125
从土样中分离纯化酵母菌 一、实验目的 1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理玉方法 2、学习、掌握微生物的鉴定方法 3、对提取的图样进行微生物的分离、纯化培养、并进行简单的形态鉴定 二、实验原理 1、基本思想: 酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为4.5-6.0.酵
母菌生长迅速，容易分离培养。在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。 2、基本路线: 采样→稀释→接种→鉴定→纯化→保藏 菌种 三、器材和用品 1、器材： 小铁铲和无菌纸或袋、培养皿、载玻片、盖玻片、普通光学显微镜、量筒、滴管、吸水纸、无菌水试管、烧杯、三角瓶、电炉、玻璃棒、接种环、恒温培养箱、高温灭菌锅、移液枪（枪头）、天平、滤纸、pH试纸等。无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、显微镜、接种环等。 2、试剂： a、美兰染液。
b、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g （煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。分装三角瓶；试管斜面1支/组。 c、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml 乳酸，pH为5.5左右，再分装试管9ml2支/组。 四、实验方法 1、采集土样带上小铁铲和无菌袋到果园土、菜园土等地采集较细碎土壤。 2、样品稀释在无菌纸上称取样品5g，放入100mL无菌水的三角瓶中，手摇10分钟使土和水充分混合。用1mL无菌吸管吸取0.5mL注入4.5mL无菌水试管中稀释。 3、分离在上述样品稀释液中，吸取lmL，接种灭菌了的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，倒置于37℃温箱中培养48小时。 4、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1ml，注入另装有乳酸马铃薯葡萄糖培养液
微生物实验十七、酵母RNA的提取及组份鉴定
一、实验目的 1. 了解并掌握稀碱法提取核酸的原理和方法。 2. 学习使用血球记数板测定微生物数量的方法。 3. 了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。 二、实验原理 核酸是一类不稳定的生物大分子，在制备过程中很容易发生降解。因此，要使制得的核酸尽可能保持其在生物体内的天然状态，制备核酸必须采用温和的条件。酵母核酸中RNA含量较多，RNA达 2.67- 10.0%,而DNA含量仅为 0.03- 0.516%,酵母核酸的提取方法较多,工业上一般选用成本较低、适宜于大规模操作的稀碱法和浓盐法。稀碱法是用1% NaOH溶液，将细胞壁溶解，用酸 中和,升高温度使蛋白质变性,将蛋白质与核酸分离,然后除去菌体,将pH 调至RNA 的等电点（pH 2.5）,使核酸沉淀出来。稀碱法的优点是抽提时间短,但核酸在此条件下不稳定,容易分解。 血球计数板法主要计数酵母、原生动物等个体较大的微生物,是计数一定容积中的细胞总数的常用方法。其型号分为X B.K. 25.和X B.K. 16. 两种,前者是一个大方格分成25 个中方格,而每个中方格又分成16 个小方格；后者为一个大方格分成 1 6个中方格,而每个中方格又分成25个小方格。但无
论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为1mm,则每一个大方格的面积为1mm2,盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为 0.1mm，所以计数室的容积为 0.1mm3 （万分之一毫升）。 核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光。RNA的紫外吸收高峰在OD260nm波长处。一般在OD260nm波长下，每毫升含1⑷RNA 溶液的吸光值为 0.022。故测定未知浓度RNA溶液OD260nm波长的吸光值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，迅速。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸等各组分，加入硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。磷酸与定磷试剂作用可以生成蓝色的钼蓝。核糖与地衣酚试剂反应呈鲜绿色。脱氧核糖与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，而核糖无此反应。嘌呤碱与硝酸银反应能产生白色的嘌呤银化合物沉淀。 三、试剂和仪器设备 1. 材料与试剂 酵母粉； 0.04mol/LNaOH;酸性乙醇：将0.3mL浓盐酸加入到30mL乙醇中；95%乙醇； 1.5mol/L硫酸；浓氨水； 0.1mol/L硝酸银。 定磷试剂：17%硫酸： 将17mL浓硫酸（比重1084）缓缓倾入83mL水中； 2.5％鉬酸铵：
酵母菌酒精发酵实验方案
酵母菌酒精发酵实验方案 实验方案 酵母菌酒精发酵地条件研究 学院（部）：生物与化学工程学院 专业：生物工程 学生姓名： 学 班 指导 1 2 ｇ玉米粉 糖化：糖化时地工艺条件为：糖化温度为５８℃，ｐＨ值为４．５，糖化时间为３．５ｈ，糖化酶地添加量为０．３ｇ／１００ｇ玉米粉. 活化培养基 本实验在进行实验时采用察氏(czapck)培养基地配制，配方如下表一：
表一 扩大培养基 扩大培养仍然用察氏(czapck)培养基，由于要用液体地，所以将其中地琼脂配料去掉. 1 2 3 （1 （2 按照 中90℃液化3.5h.边液化边搅拌. （3）玉米粉地糖化 将液化后地玉米液中按照0.3g/100ml加入液化液中.再在水浴锅中，58℃糖化3.5h. （4）过滤 糖化后地糖化液有可能有没有彻底液化地玉米颗粒，会造成浑浊，这时需要对糖化液进行过 滤操作.
操作步骤： 最后与以上培养基一起进行灭菌处理.灭菌时，清洗16支移液管，与培养基一起灭菌. （5）活化步骤 器材：酒精灯，接种针，母菌，斜面培养基，消毒酒精. 步骤：1、将器材放于实验台上.对双手合桌面进行灭菌.对接种针进行灼烧灭菌.2、在酒精灯旁按照无菌操作步骤在酒精灯火焰旁取下试管棉塞.3、将灼烧后地接种针伸入母菌试管取粘 培养. ， 不同菌量下地发酵 器材：扩大菌种，移液管四个，酒精灯，发酵液，洗耳球. 步骤：1、将实验器材放于实验台上.2、用移液管移取8%地扩大菌种到发酵液中.3、塞好棉塞，将发酵液存放于30℃条件下发酵2d.4、按照以上步骤，分别移取10%、12%、14%地扩大菌种到发酵液中，30℃培养2d，之后进行酒精检测. 不同醪液浓度下地发酵