瘤胃木质纤维素降解菌及降解酶基因的研究进展
微生物学报Acta Microbiologica Sinica 50（8）：981－987；4August 2010ISSN 0001－6209；CN 11－1995/Q http ：//https://www.wendangku.net/doc/5517801486.html, /actamicrocn
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瘤胃木质纤维素降解菌及降解酶基因的研究进展
陈富荣
1，2
，朱雅新2，东秀珠2，刘丽华1，黄力2，戴欣
2*
（1内蒙古工业大学化工学院基因工程实验室，呼和浩特010051）
（2中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室，北京
100101）
摘要：反刍动物瘤胃是公认的木质纤维素高效降解的天然反应器，对瘤胃微生物的研究已成为开发生物能源的热点领域之一。目前的研究手段已经从传统的依赖分离培养从瘤胃中获得木质纤维素降解菌，并对降解菌中的木质纤维素降解酶逐一分析，发展到通过基因组/元基因组学技术，直接从瘤胃中发现并获得大量新的木质纤维素降解酶基因/基因簇，
进而探讨其降解的分子机理。已有的研究结果表明，瘤胃微生物降解木质纤维素的过程非常复杂，涉及大量不同种类的微生物及基因/基因簇，随着新分析技术的建立和完善，对这些微生物和基因的研究已取得了诸多进展。本论文综述了近期有关该方向的研究进展。关键词：瘤胃；木质纤维素降解；基因/基因簇；元基因组中图分类号：Q938.1
文献标识码：A
文章编号：0001-6209（2010）08-07-0981木质纤维素中的纤维素和半纤维素是自然界中含量最多的可再生资源，
其开发和利用被认为是缓解能源问题最有效的途径之一。很早以前，人们就知道反刍动物的瘤胃具有高效消化降解木质纤维素的能力，
瘤胃微生物也因此受到众多微生物学家、酶学家的关注。瘤胃微生物主要包括真菌、细菌和古菌，其中参与木质纤维素降解的主要是真菌和细菌，古菌则与甲烷形成相关。瘤胃真菌是迄今唯一已知的厌氧真菌类群，
尽管已知它们在瘤胃降解木质纤维素中起非常重要的作用，但由于难以分离纯化和传代培养，对它们的生理生化特性了解不多。已有的研究大多集中于从瘤胃中分离具有木质纤维素降解功能的细菌，
并通过培养纯化以及生理生化特性的研究，推测其在瘤胃木质纤维素降解中可能的作用机制。随着分子生物学技术尤其是环境元基因组学技术的发展，对瘤胃微生物的研究逐渐深入到基因水平，并取得了较大的进展。本文将对有关瘤胃中主要木质纤维素降解菌及降解酶基因的研究进展
做一综述。
1
通过分离培养获得的瘤胃木质纤维
素降解菌及其降解酶
1966年，Hungate 根据瘤胃微生物的代谢特点将其分为11大类，即纤维分解菌、半纤维素分解菌、果胶分解菌、蛋白分解菌、淀粉分解菌、脂肪分解菌、维生素合成菌、产甲烷菌、单糖利用菌、酸利用菌、产氨细菌和尿素分解细菌等
［1］
。至今分离获得纯培
养的瘤胃细菌约有29个属69个种［2］
，其中参与降
解纤维素的细菌主要有：白色瘤胃细菌（Ruminococcus albus ）、产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes ）、黄色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens ）、小生纤维梭菌（CIostridium cellobioparus ）、小瘤胃杆菌（Ruminobacer parvum ）；参与降解半纤维素的细菌主要有：溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolven ）、长芽孢梭菌（Clostridium longisporium ）、湖头梭菌（Clostridium locheadii ）。其中溶纤维丁酸弧菌中只有少量几个种
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能高效降解木质纤维素［3－4］。
对通过分离培养获得的瘤胃微生物的研究结果表明，瘤胃中纤维素降解的3个优势菌分别是黄色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）、白色瘤胃细菌（Ruminococcus albus）和产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）。
1.1黄色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）
黄色瘤胃球菌是瘤胃中重要的厌氧革兰氏阳性纤维降解菌。已有的研究表明，黄色瘤胃球菌中可能存在类似纤维小体（Cellulosome）的多酶复合物［5］。黄色瘤胃球菌菌株17的纤维小体复合物由ScaA，ScaB，ScaC，CttA和ScaE等5个基因组成的sca基因簇编码，菌株FD-1虽然也含有与菌株17相同结构的sca基因簇，但它们的DNA序列有很大的差异，即编码纤维小体的基因簇具有菌株特异性［6］。
对黄色瘤胃球菌FD-1基因组的分析表明，在目前已知的与纤维素降解有关的细菌中，该菌株具有最多的与纤维小体相关的蛋白，含有坞因子（dockerin）的酶的多样性表明，该菌株可以组成多种纤维小体。基因芯片分析显示［7］，菌株FD-1所利用的底物对纤维小体的形成有一定的诱导作用，在含有纤维素底物的培养基中生长时会优先表达与复杂碳水化合物水解有关的酶，但上调程度最高的是一些半纤维素酶，而不是纤维素酶。对黄色瘤胃球菌菌株17的酶谱分析同样发现，在纤维素培养基中，该菌株会表达高分子量的木聚糖酶（典型的半纤维素酶）［8］。对这些纤维小体相关蛋白表达结果可能的解释是：典型的纤维素是被其它植物细胞壁多糖物质包被的，因此瘤胃环境中的黄色瘤胃球菌很少遇到纯粹的纤维素，而需要大量的半纤维素酶降解木质纤维素中非纤维素的植物细胞壁组分［9］。
1.2白色瘤胃细菌（Ruminococcus albus）
白色瘤胃球菌分离于1957年（Hungate，1957），被认为是瘤胃降解纤维素的主要菌种之一，其大部分分离株都能利用纤维素、木聚糖和纤维二糖作为碳源，并且具有多种木质纤维素降解酶，包括β-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶、α-半乳糖甘酶、α-阿拉伯糖苷酶、纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶和β-1，4-木聚糖酶等活性。人们发现白色瘤胃球菌对纤维素的黏附对于随后的纤维素降解是至关重要的一步，并已从基因的角度证实了白色瘤胃球菌纤维小体类似物的存在，但对其纤维降解机制的了解远没有对黄色瘤胃球菌认识的多［5，10－13］。
2004年Morrison研究小组在白色瘤胃球菌菌株8中发现了家族9和家族48的纤维素酶（Cel9B 和Cel48A）。与梭菌纤维小体不同，白色瘤胃球菌的Cel9B和Cel48A在C端均有一个家族37的碳水化合物结合模块（Carbonhydrate binding module37，CBM37），该结合模块代替了形成纤维小体复合物必需的坞因子结构域，且能结合许多多糖（包括纤维素）［14］，因此推测它们有可能参与白色瘤胃球菌对纤维素的黏附。最近的研究已证实，CBM37模块（module）能够帮助酶固定在细菌膜表面，它可能在白色瘤胃球菌纤维素酶的黏附过程中作为一个桥梁将细菌和它的多糖底物衔接起来。有趣的是，白色瘤胃球菌中许多这类糖苷水解酶都具有CBM37，而这种结构似乎是属于白色瘤胃球菌所独有的［15］。
到目前为止，已经在白色瘤胃球菌中发现Type IV pili、多糖蛋白质复合物、纤维小体和CBM37模块参与底物的黏附过程。如果白色瘤胃球菌确实具有这4种黏附机制，这也许就解释了为什么白色瘤胃球菌能够在与其它两种主要的纤维素降解菌———黄色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌与纤维素黏附的竞争中占据优势，并能够在瘤胃这样复杂的生态系统中生存。
1.3产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）
产琥珀酸丝状杆菌是瘤胃中主要的纤维素降解菌之一［16］，它不仅能高效降解多种形式的结晶纤维素，也可以降解半纤维素，具有很高的降解不同植物细胞壁多糖的能力，所以一直是研究瘤胃微生物高效降解木质纤维素的主要模型。已对产琥珀酸丝状杆菌S85菌株酶系统中20多个酶（包括不同的纤维素酶、木聚糖酶、阿魏酸酯酶、乙酰酯酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶）的酶学性质进行了研究。对菌株S85全基因组序列的分析表明，该菌的纤维降解酶系比原来所认为的复杂得多，有100多个可能的糖苷水解酶（GH）基因存在于该基因组中，对于这100多个糖苷水解酶在体内如何协调从而高效降解木质纤维素的机制仍不清楚。新的研究结果表明，该菌株中存在一个具有独特的三结构域的乙酰木聚糖酯酶基因，它由一个酯酶结构域（CE）、一个碳水化合物结合结构域（CBM6）和一个未知功能的结构域（FPm-1）组成。FPm-1结构域为产琥珀酸丝状杆菌特有的模块，它在降解过程对碳水化合物结合方面起到的作用甚至比CBM6更加关键［17］，推测产琥珀酸丝状杆菌中这种独有的碳水化合物结合模块与白色瘤胃所独有的CBM37有着类
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似的功能。当然，这一推测还有待进一步验证。
为了了解产琥珀酸丝状杆菌中糖苷水解酶的表达调控机理，Béra-Maillet等利用GH基因转录产物定量分析方法（RT-qPCR）对羊瘤胃中8个GH基因（包括5个纤维素酶基因，1个地衣聚糖酶基因，2个木聚糖酶基因）的转录产物丰度进行分析，发现这些GH基因同时转录，且转录水平很接近。但在限菌羔羊（即瘤胃中纤维降解菌仅有产琥珀酸丝状杆菌的羔羊）的瘤胃微生物中，GH基因表达水平明显高于普通羊，提示普通羊中存在的纤维降解菌之间的相互作用可能降低产琥珀酸丝状杆菌中GH基因的表达［18］，其机制仍有待进一步研究。
瘤胃中还有其他许多微生物参与木质纤维素的降解过程，如普氏菌属（Prevotella）的P.bryantii和P.ruminicola，它们既能降解木聚糖，又具有羧甲基纤维素（CMC）酶活性。但这些菌种的纯培养物在体外并不能有效地降解植物细胞壁，而只有与其他纤维素降解菌共同培养时才能高效利用木聚糖和果胶［19］。已在普氏菌属（Prevotella）中发现参与木聚糖降解的基因簇［20－21］，在P.bryantii B
1
4的木聚糖降解基因簇中还发现了双组分调控蛋白XynR［22］，这些结果都将有助于对瘤胃微生物木质纤维素降解机制进行更深入的研究。
2瘤胃微生物的元基因组学研究基于16S rRNA基因的定量分析表明［23］，采用传统的分离培养方法获得的22种主要瘤胃细菌优势属种［24］，仅占瘤胃微生物中很小的一部分［12］。在分离培养中被认为是优势的、并且被广泛研究的微生物（如黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌），只占瘤胃微生物总量的不到1%，有些还不到0.03%［23］。也就是说，瘤胃中至少有80%－90%的微生物目前尚未获得培养。对这些大量的未培养微生物基因的研究，有助于发现新的酶资源、新的酶学特性和新的代谢途径，也将为全面阐释瘤胃微生物木质纤维素降解机制奠定基础。
元基因组技术（Metagenomics）是近年来发展起来的、通过提取环境样品中总DNA，构建文库或直接测序，获得并研究该样品所有基因的方法［25］。这种技术，使人们得以在基因水平上直接分析环境样品中未培养微生物物种的物质代谢和能量代谢以及它们可能的生态功能［26］，同时也是获得新的功能基因和新的代谢类型的重要途径［27－29］。目前已有多个实验室利用元基因组技术对各种瘤胃中的微生物进行研究，并取得了一系列进展。
2.1瘤胃噬菌体文库
2005年，德国GBF的科学家成功构建了奶牛瘤胃微生物元基因组噬菌体文库［30］，该文库的2?105个噬菌体颗粒中插入片段的平均长度为 5.5 kb。从该文库中获得了3个新的降解酶基因，分别为聚酚降解活性（可能是一种新的木质素降解酶［30］），多酚氧化酶［31］以及α-淀粉酶［28］。2006年，美国科学家构建了牛瘤胃液微生物元基因组噬菌体文库［29］，该文库插入片段平均长度为3kb。从文库中获得了1个可同时降解纤维素，木聚糖和甘露聚糖的酶基因GH6248，它编码的、由917个氨基酸残基组成的酶具有糖苷水解酶家族5和家族26两个活性结构域，可降解羧甲基纤维素、β-葡聚糖、地衣多糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、甘露聚糖、木聚糖、阿拉伯木聚糖和木葡聚糖等多种底物。此类一个糖苷水解酶具有两个或多个催化结构域的例子还很少，推测在瘤胃中为了便于高效降解木质纤维素，纤维素酶和半纤维素酶通过基因融合形成了这种多功能酶。这种多功能酶具有潜在应用价值，即可以利用一种酶完成原来需要多个酶参与才能完成的过程。
2.2瘤胃cosmid文库
2005年，我国广西大学冯家勋实验室构建了成年黄牛瘤胃微生物元基因组cosmid文库［32］，该文库插入片段的平均大小为35kb，从中获得了3个可能与纤维素降解相关的新基因。其中2个基因编码的蛋白与未培养细菌纤维素酶相似性很高，这2个酶同时具有木聚糖酶活性；另外1个基因编码的是未培养细菌的β-葡萄糖苷酶。随后，他们又从水牛瘤胃微生物元基因组cosmid文库中筛选到了1个新的酸性纤维素酶基因［33］，该酶在很宽的pH范围（pH3.5－10.5）内有活性，最适pH值为4.5，且具有很多与其他纤维素酶不同的特性，表明瘤胃中纤维素酶及纤维素降解机制存在多样性。在该cosmid 文库中还发现了2个参与木质纤维素降解的基因簇，其中几个糖苷水解酶相互协作，共同完成对木质纤维素的降解。
2.3瘤胃BAC文库
从总体上看，目前国内外构建的瘤胃微生物元基因组文库主要是插入片段较小的噬菌体文库和cosmid文库，研究工作也主要集中在对新的单个基因或酶的筛选以及它们的异源表达及其产物酶学特性分析等方面。由于天然木质纤维素是由纤维素、
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半纤维素以及木质素经多种化学键复合而成，任何单一的水解酶很难破坏这种复杂的分子结构，往往需要多种酶协同作用完成降解，而相关酶的编码基因有时通过基因簇的方式来协同表达和作用，因此，通过构建大片段DNA文库（如BAC文库）有可能获得降解酶基因/基因簇的更完整的信息。
2006年，本实验室成功构建了荷斯坦奶牛瘤胃微生物元基因组BAC文库［34］，获得了15360个克隆，文库的插入片段平均长度为54.5kb，库容837 Mb。对文库纤维素降解活性的初筛已经得到了20多个阳性克隆，分析这些阳性克隆对木聚糖、地衣多糖以及纤维二糖的降解活性发现，很多克隆具有两种或两种以上与纤维素、半纤维素降解有关的酶活。2008年，本实验室还成功构建了青海牦牛瘤胃元基因组BAC文库。对该BAC文库中部分活性克隆的序列测定和分析，证实了瘤胃中许多纤维素降解酶相关基因是成簇排列的（结果未发表）。
中国农业科学院北京畜牧兽医研究所从我们构建的荷斯坦奶牛瘤胃微生物元基因组BAC文库中筛选到两个新的脂肪酶基因RlipE1和RlipE2，推测它们分别编码含361和225个氨基酸残基的脂肪酶。其中RlipE1与其他细菌酯酶/脂肪酶相似性低于50%，根据氨基酸序列构建的进化树显示，RlipE1同另外6个细菌脂肪酶聚为一簇，不属于任何一个已知的脂肪酶家族，它们可能构成脂肪分解酶的新的亚家族；RlipE2与T.carboxydivorans Nor1的一个羧酸酯酶的相似性高达90%。底物特异性研究表明，这两个酶对长酰基链底物（>C
12
）的活性远远大于短酰基链，说明它们属于脂肪酶家族，而非酯酶家族［35］。2009年，又从该BAC文库中筛选获得了18个脂肪酶酶活阳性克隆，并对克隆的脂肪酶酶学性质进行了分析，发现这些酶的最适pH为7.4，属于中性脂肪酶，其中的一个脂肪酶的热稳定性很强，有工业应用前景［36］；另外他们还对该文库的尿酶克隆进行了筛选和分析，共筛选到12个尿酶阳性克隆，对其酶活力及酶活最适pH和温度的研究结果显示，12个脲酶克隆具有高低不等的酶活力，最适pH 差异也很大，酶切图谱上的DNA片段分析表明，筛选到的脲酶阳性克隆具有较大的插入片段，有助于进一步研究脲酶基因簇和脲酶基因的表达调控［37］。
2.4元基因组测序
随着测序技术的发展和完善，对瘤胃微生物元基因组进行直接测序并注释已成为可能。2009年，Brulc等分别对纤维素黏附的瘤胃微生物及瘤胃液微生物元基因组进行了直接测序和分析［38］。分析结果显示：（1）对瘤胃微生物元基因组测序有助于更好地了解瘤胃微生物在降解木质纤维素过程中的协同作用。元基因组学分析结果直接证实，原来认为的瘤胃中降解木质纤维素的瘤胃球菌，实际在瘤胃微生物中所占比例非常低；（2）瘤胃微生物元基因组序列中存在大量的编码糖苷水解酶催化模块的基因，它们分别属于35个不同的糖苷水解酶家族；仅发现3个家族的碳水化合物结合模块（CBM6，CBM13and CBM32）和3个坞因子模块，没有发现纤维小体中常见的黏附因子（cohesin）和CBM3模块，表明瘤胃中并非以纤维小体作为其主要的木质纤维素酶组成方式（甚至很罕见）；（3）基因组中编码降解木聚糖主链和果胶主链的酶基因相对较少，而降解这些多糖侧链的酶，如酯酶等则比较多。
数量巨大，种类繁多的瘤胃微生物构成了一个复杂的群落体系，通过这些微生物之间的协同作用最终将反刍动物摄入的木质纤维素降解为可提供给宿主利用的糖类、可挥发性脂肪酸以及蛋白质等物质。尽管对瘤胃微生物的研究已有六十多年的历史，但人们对瘤胃中木质纤维素降解这一复杂过程仍知之甚少。相信随着技术的进步，尤其是测序技术的日臻完善与发展，人们终将揭示瘤胃微生物木质纤维素降解的这一复杂机制。
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Lignocellulose degrading bacteria and their genes encoding cellulase/hemicellulase in rumen-A review
Furong Chen1，2，Yaxin Zhu2，Xiuzhu Dong2，Lihua Liu1，Li Huang2，Xin Dai2*（1College of Chemical Engineering，Inner Mongolia University of Technology，Huhhot010051，China）
（2State Key Laboratory of Microbial Recourse，Institute of Microbiology，Chinese Academy of Sciences，Beijing100101，China）
Abstract：Rumen of ruminant animals is known as a natural reactor involved in highly efficient lignocelluloses degradation. Rumen fibrolytic microbes have attracted an increasing attention for their potential value in biofuel research.Studies on rumen microbes have traditionally entailed the isolation of fibrolytic bacteria and subsequent analysis of fibrolytic enzymes. Developments in genomic and metagenomic approaches have made it possible to isolate directly genes and gene clusters encoding fibrolytic activities from rumen samples，permitting a global analysis of mechanisms of degradation of lignocellulose in rumen.Research in this field shows that lignocellulose degradation in rumen is a complex process involving a number of different microbes and is effected by a huge array of hydrolytic enzymes in a concerted fashion.This review briefly summarizes results from recent studies，especially metagenomic studies，on lignocellulose degradation in rumen.
Keywords：rumen；lignocellulose degradation；genes/gene clusters；metagenomics
（本文责编：王晋芳）
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*Corresponding author.Tel：+86-10-64807418；Fax：+86-10-64807429；E-mail：daixin@https://www.wendangku.net/doc/5517801486.html,
16March2010
Received：14January2010/Revised：
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《微生物学报》刊、期统计表
2010年8月统计
时间刊期卷号期号
1953－1956半年刊1－41－2
1957－1958季刊5－61－4
1959季刊71－2
1959－1962停刊3年
1962季刊83－4
1963－1965季刊9－111－4
1966季刊121－2
1966－1972停刊6年半
1973－1988季刊13－281－4
1989－2007双月刊29－471－6
2008月刊481－12
2009月刊491－12
2010月刊508