食品微生物检验学实验指导

食品微生物检验学实验指导

课时分配及主要实验内容(总学时30,其中动检20,动食安30)

实验1 微生物检验常规试验预备 3

主要内容：菌落总数测定和大肠菌群检验所需的1）研钵、剪刀、镊子、吸管、平皿的包扎与干热灭菌；2）实验所需培养基（营养琼脂、EMB琼脂、乳糖胆盐发酵管）和生理盐水的配制、分装、包扎和高压蒸汽灭菌。

实验2 菌落总数测定 3

主要内容：1）样品的称取、匀浆和稀释；2）接种与琼脂倾注；3）24h后菌落计数及结果报告。实验3 大肠菌群MPN测定 3

主要内容：1）样品的称取、匀浆和稀释；2）接种于乳糖胆盐发酵管，培养；3）24h后观察产酸产气情况，划线于EMB琼脂，培养；3）48h时观察菌落特征，革兰氏染色、镜检；4）查MPN检索表，报告结果。

实验4 蜡样芽孢杆菌检验 3

主要内容：1）将细菌肉汤培养物划线于普通琼脂、MYP琼脂，点种于卵黄琼脂平板，接种生化培养基，培养；2）24h时观察菌落特征，革兰氏染色、镜检；3）观察主要生化试验结果。4）报告。

实验5 致病性球菌检验 3

主要内容：1）将金黄色葡萄球菌和链球菌肉汤培养物划线于普通琼脂、血液琼脂，接种生化培养基，进行纸片法药敏试验，培养；2）24h时观察菌落特征，革兰氏染色、镜检；3）观察主要生化试验结果和药敏试验结果。4）报告。

实验6 魏氏梭菌检验 3

主要内容：1）形态及染色特性观察；2）细菌厌氧培养；3）家兔“泡沫肝”试验

实验7 霉菌检验 2

主要内容：1）观察曲霉、毛霉和青霉在PDA琼脂上的菌落特性；2）挑取霉菌培养物制备压片，在显微镜下观察霉菌菌丝、孢子等结构。

实验8 肉的微生物学检验 2

主要内容：1）鲜肉的感官性状观察；2）鲜肉压印片制备与镜检、细菌计数；3）微生物毒素呈色反应。

实验9 乳的微生物学检验 2

主要内容：1）鲜乳的感官性状观察；2）乳的涂片制备与镜检、细菌计数；3）美兰还原试验。

实验10 食品中沙门氏菌的检验 6

主要内容：1）沙门氏菌检验所需培养基的制备；2）细菌分离与菌落挑选；3）细菌生化试验；4）血清学鉴定；5）结果报告。

实验一微生物检验常规试验预备

[目的与要求]

1.熟悉菌落总数测定和大肠菌群检验所需的各种培养基的制备。熟悉高压蒸汽灭菌器的使用。

2.熟悉玻璃器皿的包装与干热灭菌方法。

[主要内容]：

1 研钵、剪刀、镊子、吸管、平皿的包扎与干热灭菌。

2 实验所需培养基（营养琼脂、EMB琼脂、乳糖胆盐发酵管）和生理盐水的配制、分装、包扎和高压蒸

汽灭菌。

1）配制700 mL生理盐水（0.9%NaCl），分别分装与5个盐水瓶，每瓶90 mL；分装18支试管，每管9 mL。

2）配制乳糖胆盐培养基（发酵管）200 mL，并分装于小试管各3 mL，每管中加入一个充满培养基的小倒管，注意一定不能有气泡。（配方：2%蛋白胨，0.5%猪胆盐，1%乳糖，调pH7.4，然后加入0.4%溴甲酚紫2.5ml/100ml）

3）配制普通琼脂培养基400ML，分装于2 个三角瓶。（0.5%NaCl，1%蛋白胨，0.3%牛肉粉（膏），pH7.4，琼脂粉1.5%）

4）配制伊红美蓝培养基300 mL。（配方：蛋白胨1%，NaCl 0.5%，牛肉膏0.3%，pH7.4，琼脂粉1.5%，加热溶化后加入乳糖1%、2%伊红水溶液2 mL/1000 mL、0.65%美蓝1 mL/1000 mL）

5）TTC培养基

（1）2%乳糖发酵管40支，每管2.5ml（2%乳糖，2%蛋白胨）。

（2）TTC培养液100ml（2%蛋白胨，1%Nacl，1%Na2HPO4.12H2O,0.4%十二烷基硫酸钠，PH7.4）

（3）灭菌后加10%TTC8ml后分装于（1），每管加2.5ml。

6）DC培养基（0.5%蛋白胨，0.5%Nacl，1%乳糖，0.3%K2HPO4.3H2O，0.2%柠檬酸铁铵，琼脂粉0.7%）溶于水后调PH7.2，加入10%去氧胆酸钠1ml及0.4%溴麝香草酚兰1.6ml。[思考题]

1 配制培养基时的一般原则和注意事项？

2 使用高压灭菌器和恒温干燥箱的注意事项？

实验二菌落总数测定

[目的与要求]

通过本试验要求掌握食品的菌落总数测定的方法，菌落计数和报告方式，以及经常食用的各类动物性食品的菌落总数标准。

菌落总数是指食品检样经过适当处理，在一定的条件下培养后，所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数，其也是判定食品被污染程度的标志。

[实验器材及试剂]

温箱、天平、灭菌试管、吸管、灭菌平皿、乳钵、剪子和镊子、稀释液、营养琼脂、显微镜、载玻片、革兰氏染色液，等。

[实验内容]

（一）检样稀释及培养：

1. 以无菌操作，将检样2 5 g（或2 5mL）剪碎放于含有2 5 0 mL（或2 2 5 mL）灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨作成1：10的均匀稀释液。

2. 用1mL灭菌吸管，吸取1：10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水的试管中振摇试管混合均匀，作成1：100倍稀释。

3. 另取lmL灭菌吸管，按（2）操作10倍递增稀释，如此每递增稀释一次换一只1mL 灭菌吸管。

4根据卫生标准要求或对样品污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，用吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作2个平皿。

5. 稀释液移入平皿后，应立即将冷至46 ℃左右营养琼脂培养基（可放置46℃水浴中保温）注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有lmL灭菌稀释液的灭菌平皿内，作空白对照。

6. 待琼脂凝固后，翻转平板，置37℃温箱内培养2 4±2h时（肉、水产、乳、蛋为48±2h）取出，计算平皿内菌落数，乘以稀释倍数，即得每g（mL）样品所含菌落总数。（二）菌落计数方法

作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜观察，以防遗漏。在记下各皿的菌落数后，求出同稀释度的各皿平均菌落数。

（三）菌落计数的报告包括三步。

1．平板菌落数的选择选取菌落数在30～3 0 0之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。

2. 稀释度选择

（1）选择平均菌落数在30～300之间，乘稀释倍数。

（2）若两个稀释度，其菌落数均在30～300之间，则视二者之比来决定。比值小于或等于2，应报告平均数，大于2则报告其较小的数字。

（3）若所有稀释度的平均菌落数均较大于300，则应按稀释度最高的平均数乘以稀释倍数报告。

（4）若所有稀释度平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低平均数乘以稀释倍数。

（5）若所有稀释度均无菌落的生长，则以小于（＜）1乘以最低稀释倍数报告之。

（6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以其稀释倍数。

3．菌落数的报告菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示，详见表2－1。

[思考题]

1 菌落总数的食品卫生学意义？

2 影响本实验结果的因素有哪些？

表2-1 稀释度选择及菌落数报告方式

实验三大肠菌群数的测定

[目的与要求]

1．掌握大肠菌群MPN的测定原理与方法，及实验结果报告方式。

2．熟悉检验中各种培养基的配制。

3．了解大肠菌群的食品卫生学意义

[原理]

大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。

食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the most probable number-简称MPN）表示。

[实验器材及试剂]

样品：乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。

温箱、天平、灭菌试管、吸管、灭菌平皿、乳钵、剪子和镊子、稀释液、营养琼脂、显微镜、载玻片、革兰氏染色液、乳糖胆盐发酵管、伊红美兰琼脂、乳糖发酵管、DC半固体培养基、TTC乳糖培养基、灭菌中性定性滤纸片，等。

[实验内容]

一、常规检验法

1检样稀释及培养取样及稀释方法与菌落总数检验方法相同,做成1:10的均匀稀释液为检样。同一稀释度在做菌落总数的测定的同时接种乳糖胆盐发酵管，并且用大肠埃希氏菌、产气肠杆菌混合菌种作对照。

2乳糖发酵试验根据食品卫生要求或对检样污染程度的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。接种量在1ml以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1ml及1ml以下者,用单料乳糖胆盐发酵管，同时用大肠埃希氏菌和产气肠杆菌混合菌种混合接种于1支作单料乳糖胆盐发酵管对照。置36±1℃温箱内,培养24±2小时,如所有发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则与对照的混合菌种一起按下列程序进行。

3 分离培养将产气的发酵管分别在伊红美兰琼脂（EMB琼脂）平板上划线分离。然后置36±1℃温箱内，培养18～24小时后取出, 观察菌落形态,并作革兰氏染色和证实试验。

4 证实试验在上述平板上,挑取可疑大肠菌落1～2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱培养24±2小时,观察产气情况,凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,即可报告为大肠菌群阳性.

5 报告根据证实大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表(见附录)报告每100ml(克)食品中大肠菌群的最可能数.

二、快速检验法

（一）T T C（氯化三苯四氮唑）显色快速法样品处理同常规法。具体操作步骤：1．接种每份样品以无菌操作接种lmL、0．lmL、0．01mL各三管于TTC乳糖培养基中，如接种量为10mL，则用三倍TTC乳糖培养基。

2．培养接种后，置35－37℃温箱中培养18－24h。

3．结果判定观察TTC乳糖培养基呈色和产气情况。按下列标准进行判定。见表3-1，

表3－1 显色法的大肠菌群结果判定

4．结果报告根据阳性管数查MPN检索表，得出结果并报告之。

5．注意事项观察产气时，如小导管内有肉眼可见气泡，均为产气阳性，另要注意导管有无被沉淀物堵塞，如轻轻振动试管，有小气泡上升者仍为阳性。

（二）DC（去氧胆酸钠）半固体试管快速法样品稀释同常规法，具体操作步骤：

1. 接种液体样品选择原液、1：10、l：100三个稀释度的样品液，每个稀释度取三个1mL，分别放入灭菌试管中。固体样品取1：10稀释液三个10mL（1g）样品分别注入三个灭菌试管内，再取1：10稀释液三个lmL和1：100稀释液三个lmL分别加入灭菌试管内。

2．加入培养基并进行培养接种1mL样品的试管，注入已溶化并冷至50℃左右的DC半固体培养基3mL，接种10mL样品的试管加入三倍DC培养基5mL，立即将样品与培养基充分混合，待凝固后，置37℃温箱内培养18～24h。取出观察结果。

3．结果判定和记录则分别按下述四种处理（1）培养基变桔红色，有气泡产生或琼脂崩裂，记录为○+。（2）培养基为桔红色，或有桔红色菌落，无气泡或琼脂崩裂现象，记录为十。（3）培养基为绿色，有黄色菌落无气泡和琼脂崩裂现象，记录为土。（4）培养基为绿色，记录为-。

4．报告结果：判定为（1）和（4）反应结果，记录阳性管数。查MPN检索表并报告之。

如遇（2）、（3）项反应结果，可挑2～3个大肠菌群可疑菌落接种乳糖复发酵管，置37℃温箱中培养18～24h。时，根据产酸产气管数查MPN检索表并报告之。

（三）纸片快速法

1．制备纸片将中性定性滤纸裁成10 ×12cm，然后叠成5×6cm大小双层纸片，灭菌后用专用培养基浸渍，然后37~40℃烘干，以无菌操作放入塑料袋内备用（塑料袋为耐高温的聚丙塑料膜，以利消毒）。

2．接种样品样品稀释方法同前述液体和固体样品培养。（1）液体样品：取原液、1:10、1:100三个稀释度各三个1mL，分别涂布于9张纸片上。（2）固体样品：取原液、l:10、1:100三个稀释度各三个lmL，分别涂布于9张纸片上。

3．培养将上述纸片置37士1℃温箱中，培养15小时观察结果。

4．结果判定根据以下情况分别判定：

（1）纸片上出现紫红色菌落，其周围有黄圈者为阳性。

（2）纸片为一种颜色，无菌落生长者为阴性。

（3）纸片呈紫色，有紫红色菌落，其周围无黄圈者为阴性。

（4）酸性食品接种后，纸片变黄，经培养后无紫红色菌落为阴性。

（5）纸片变色呈现不典型菌落，结果可疑者，应做复发酵进行验证。

5．结果报告根据纸片的阳性片数，查大肠菌群MPN检索表并报告之。

6．注意事项有二。

（1）用培养基浸渍过的纸片，应避光保存，并注意防潮，可放冰箱中保存备用。

（2）如发现纸片变为粉红色即为失效。

[思考题]

1 大肠菌群检验中为什么首先要用乳糖胆盐发酵管？

2 作空白对照实验的目的？

3 为什么大肠菌群的检验要经过复发酵才能证实？

4 复发酵时为什么使用乳糖发酵管但不需加胆盐？

表3-2 大肠菌群最可能数（MPN）检索表

注：① 表采用3个稀释度[1mL（g）、0.1mL（g）和0.01mL（g）]，每稀释度3管。

② 内所列检样量如改用10mL（g）、1mL（g）和0.1mL（g）时，表内数字相应降低10倍；如改用0.1mL（g）、0.01mL（g）和0.001mL（g）时，则表内数字应相应增加10倍。其余可类推。

实验四食品中蜡样芽胞杆菌的检验

[目的与要求]

通过本实验要求了解蜡样芽胞杆菌的主要生化特性、毒力测定与类似菌鉴别；掌握本菌的形态特征，选择培养基的菌落特点。

[实验器材及试剂]

温箱、营养琼脂、显微镜、载玻片、革兰氏染色液、硝酸盐培养基、酪蛋白琼脂、10％卵黄琼脂、酚红葡萄糖肉汤，等。

[实验内容]

一、活菌计数：

活菌计数是取样品25g（或25mL），用灭菌生理盐水（或磷酸盐缓冲液PH7.0）225mL 稀释（固体样品如肉或肉制品等，应无菌研磨制成匀浆后稀释），稀释度为1:10，再将此稀释液作1:10（样品的实际稀释度为1:100，以下各稀释度类推）、1:100、1:1000和1:10000稀释，取各稀释度0.1mL，接种在10％卵黄琼脂或MYP（甘露醇卵黄多粘菌素）琼脂上涂匀后，置 3 7℃温箱中培养12～20h，选取菌落数在30个左右者计数，蜡样芽胞杆菌的菌落在卵黄琼脂上呈粉红色，周围呈乳白色混浊环，在MYP琼脂上呈灰白色或微带红色，并且

在粉红色（表示不发酵甘露醇）的背景中环绕白色至淡红色的晕（表示产生卵磷脂酶）。

计数后，从中挑取5个典型菌落作证实试验，根据证实为蜡样芽胞杆菌的菌落，计算出该皿内的蜡样芽胞杆菌数，然后乘其稀释倍数，即得每g（或mL）样品中所含蜡样芽胞杆菌数，例如，将固定检样1:10000的稀释液0.lmL涂布于甘露醇卵黄多粘菌素琼脂平板上，生成的可疑菌落为25个，取5个鉴定，证实为蜡样芽胞杆菌的是4个，则1g检样中蜡样芽胞杆菌数为：25×4／5×104×10=2×106

二、细菌培养：将检样或其稀释液接种于血琼脂或MYP琼脂平板，置37℃温箱内培养12～20h，挑取可疑菌落接种于肉汤和营养琼脂做成纯培养，以备证实试验用。

三、证实试验

1．形态观察：革兰氏染色法镜检，芽胞卵圆形，芽胞较菌体小，位于中央或稍偏一端。

2．培养特性：蜡样芽胞杆菌在肉汤中呈混浊生长，常微有菌膜或壁环，振荡易乳化。营养琼脂上呈不透明、表面粗糙、似毛玻璃或融蜡状，边缘似齿轮状。

3．生化特性：蜡样芽胞杆菌有动力，还原硝酸盐，接触酶阳性，溶血，不发酵甘露醇和木糖，常能液化明胶和溶菌酶试验阳性，淀粉酶试验阳性，厌氧条件下能发酵葡萄糖。

1）硝酸盐试验：将纯培养的细菌穿刺接种于硝酸盐培养基中，培养18～24h后，

取出检查，有动力的细菌，可由穿刺线向四周扩散生长，使周围的培养基变混浊，无动力的细菌仅能沿穿刺线生长，周围的培养基仍然保持透明，然后沿管壁加入硝酸盐还原指示剂甲液和乙液各二滴，能还原硝酸盐的细菌立即呈红色。

2）酪蛋白琼脂：划线后于37℃培养48h，观察菌落周围培养基，如透明表示酪氨酸蛋白酶阳性。

3）卵磷脂酶试验：取肉汤培养物点种于10％卵黄琼脂平板上，置37℃培养3h，蜡样芽胞杆菌产生混浊环，6h后混浊环扩散至5～6mm。

4）厌氧发酵葡萄糖试验：取1环肉汤培养物接种于3mL酚红葡萄糖肉场内，置厌氧罐中，37℃培养24h，观察培养基颜色是否由红变黄，如果变黄，为厌氧条件下利用葡萄糖产酸阳性。

[思考题]

1 为什么在检验食品中的蜡样芽胞杆菌时要进行活菌计数？

2 蜡样芽胞杆菌的主要生化特性？

实验五致病性球菌的检验

[目的与要求]

1．掌握葡萄球菌和溶血性链球菌的常规检验方法。

2．认识葡萄球菌和溶血性链球菌的形态、培养和生化特性。

[实验器材及试剂]

温箱、营养琼脂、显微镜、载玻片、革兰氏染色液、健康人血浆、新鲜兔血浆、血琼脂平板、杆菌肽药敏纸片等。

[实验内容]

一、葡萄球菌的检验

金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，并使血浆纤维蛋白发生凝固，呈现阳性反应。

一）检样的采集与处理取25 g检样加入225 mL灭菌生理盐水内制成混悬液。

二）细菌的形态与培养观察

1．吸取混悬液5mL接种7.5％氯化钠肉场50mL，同时挑取混悬液接种血平板及

Baird-Parker氏培养基，置36士1 ℃温箱培养24h。如果血平板上菌落呈金黄、大而突起、圆形、不透明、表面光滑、周围有溶血圈。Baird—Parker氏培养基上为圆形、光滑、突起、湿润，颜色从灰色到黑色，边缘为淡色，周围为混浊带和透明带时，则初步判断为金黄色葡葡球菌。

2．挑取可疑菌落进行革兰氏染色镜检，如见到革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽胞、无荚膜的细菌，则可认为是该菌。

三）血浆凝固酶试验吸取1:4新鲜兔血浆0.5mL于小试管中，加入葡萄球菌肉场培养物0.5mL，振荡摇匀，放36土l℃温箱或水浴内，每小时观察一次，观察6h，出现凝固即为阳性。同时取已知阳性和阴性菌株及肉汤作对照。

二、溶血性链球菌

A群链球菌能产生一种激活酶，此酶能激活血液中的溶纤维蛋白酶原（亦称胞浆原），使之变为有活性的溶纤维蛋白酶，以溶解纤维蛋白。产生链激酶的细菌除A群链球菌外，还有C和G等群键球菌。

一）检样的采集与处理取25 g检样加入225mL灭菌生理盐水内制成混悬液。

二）细菌的形态与培养

1．取混悬液接种于血平板上，并吸5mL接种于50mL葡萄糖肉浸液肉场内。如检样污染严重另取5mL接种匹克氏肉场，培养24h。挑取乙型溶血、圆形突起的细小菌落，接种血平板（纯精养）。如菌落呈灰白色、半透明或不透明，表面光滑、有浮光、圆形突起的细小菌落，周围有2～4mm无色透明的溶血环，可初步认为是溶血性链球菌。

2．批取菌落作革兰氏染色镜检，如见到革兰氏阳性球菌，不形成芽胞，无鞭毛，链状排列时可判定为该菌。

三）链激酶试验

1．方法：取健康人血浆0.2mL（草酸钾0. 01g、加入5mL人血混匀，经离心沉淀吸取上清液，即为血浆），加入0.8mL灭菌生理盐水，混匀后，加入被检菌肉场培养液0.5mL，再加入0.25％氯化钙溶液0.25mL，振荡后放入36℃水浴中。

2．结果：10分钟内血浆先凝固，随后又溶化。血浆溶化的时间长短，视激活酶含量多少，链激酶愈多，溶化所需时间愈短，强阳性者可在20min内完全溶化凝固的血浆，24h仍不溶化者为阴性。

四、杆菌肽敏感试验

1.方法：挑取乙型溶血性链球菌浓菌液，涂布于血平板（肉浸液琼脂加入5%血液）上。用灭菌镊子夹取每片含有0.04单位的杆菌肽纸片，放于上述平板上，放36士1℃培养18～24h。

2．结果如有抑菌环现即为阳性，可初步鉴定为A群链球菌，同时用已知阳性菌株作对照。

[思考题]

1 金黄色葡萄球菌的毒力主要表现在哪几个方面?

2 链球菌与食物中毒的关系? 与肠球菌的比较?

实验六魏氏梭菌检验

[目的与要求]

1．认识魏氏梭菌的形态及染色特性

2．掌握魏氏梭菌检验方法。

[实验器材及试剂]

温箱、天平、灭菌试管、吸管、灭菌平皿、乳钵、剪子和镊子、稀释液、营养琼脂、

显微镜、载波片、革兰氏染色液SPS琼脂、动力一硝酸盐培养基含铁牛奶培养基卵黄琼脂平板。

[实验内容]

一、形态及染色特性观察

本菌为革兰氏阳性的粗大杆菌，单在或成双排列。芽胞呈卵圆形位于菌体中央或近端。在机体内形成荚膜，无鞭毛，不能运动。在陈旧的培养物中，菌体呈革兰氏阴性。

二、活菌计数培养

1．按无菌操作称取食品检样25g（mL）放入均质器，加0．1％蛋白胨水稀释剂225mL，低速搅动1～2分钟，使之均质化，做成1：10稀释。

2．以上述1：10稀释的均质液按lmL加0．1％蛋白胨稀释剂9mL，做成10-2～10-6的系列稀释液。

3．吸取各稀释液分别放于2个灭菌平皿内各lmL。每个平皿浇注约50℃的SPS琼脂15～20mL，仔细转动手血，使稀释液和琼脂充分混匀。

4．上述琼脂平板凝固后，倒置于厌氧培养装置内36士1℃培养24h。

5．选取长有30～300个黑色菌落的平板，计数。

三、证实试验

1．由平板上任取10个黑色菌落，分别接种FT培养基；36土1℃培养18～24h。

2．用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检，检查培养液的纯净度。

3．用接种环（针）穿刺接种动力一硝酸盐培养基，36土1℃培养24h，观察接种线的生长情况，判断有无动力。然后滴加a一萘胺液和对氨基苯磺酸液各0．5mL，观察硝酸盐是否被还原。

4．取生长旺盛的FT培养液lmL接种含铁牛奶培养基，于46℃水浴中培养，2h时后观察有无“暴烈发酵”现象。5h不发酵者为阴性。

5．用接种环蘸取FT培养液点种卵黄琼脂平板（每个平板至少可点种10点），倒置厌氧培养装置内，35℃培养24h，观察接种点的乳白色混浊变化，以判定有无卵磷脂酶产生。

四、菌落计算

根据黑色菌落的计数（5）和证实试验的结果，计算每g（mL）食品检样的含菌数。

例如，10-4稀释液的平板长有黑色菌落100个，而供作证实试验的10个菌落中有7个被确证为魏氏梭菌，则每g（mL）食品检样所含魏氏梭菌数：

100×0.7×104=7×105

五、家兔“泡沫肝”试验：取待检菌18~24h液体培养物0.5mL，经耳静脉注射家兔，10min后处死，置37℃温箱内5~8h，剖检。如有魏氏梭菌存在，则可见各脏器有许多气泡，尤以肝脏为甚，故称为“泡沫肝”或“海绵肝”。用肝脏作涂片镜检和细菌分离培养。[思考题]

1 魏氏梭菌的形态染色特性和培养特性?

2 “暴烈发酵”的原理是什么?

实验七霉菌和酵母计数

[目的与要求]

了解和掌握食品中霉菌和酵母计数的测定方法；了解霉菌直接镜检计数法。

[实验器材及试剂]

被检肉样，灭菌试管，灭菌吸管，灭菌平皿，天平，量筒，三角瓶，剪刀，镊子，载玻片，显微镜，香柏油，擦镜纸等。

马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（附加抗生素），孟加拉红培养基。

[实验内容]

一、琼脂倾注法

1 以无菌操作称取检样25g（mL），放入含有225mL灭菌水的具玻塞锥形瓶中，振摇30min，即为1:10稀释的样品。

2 用灭菌吸管吸取1:10样品液10mL，注入灭菌试管中，另用1mL一支灭菌吸管反复吹打50次，使霉菌孢子充分散开。

3 吸取1:10样品液1mL注入含有9 mL灭菌水的试管中，另换一支1 mL灭菌吸管吸吹5次，制成1:100样品液。

4 按上述操作顺序做10倍系列稀释，每稀释一次，换用一支灭菌吸管，根据对样品污染程度的估计选择3个合适的稀释度，分别在进行稀释的同时吸取1mL样液置于灭菌平皿，每个稀释度做２个平皿。然后将融化后保存在４６℃水浴中的琼脂培养基倾注入平皿，轻轻转动平皿使样液与培养基充分混匀，待琼脂凝固后倒置于２５℃～２８℃温箱中，３ｄ后开始观察，共观察５ｄ。

５计数方法：通常选择菌落数在10~150之间的平皿进行计数，取同一稀释度的两个平皿菌落数的平均值乘以稀释倍数，即为每克（毫升）检样中所含霉菌和酵母数。稀释度选择和菌落报告方式可参照“菌落总数测定”。

６报告：每克（毫升）食品中所含霉菌和酵母数以cfu／g（ｍＬ）表示。

二、霉菌直接镜检计数法

本方法适用于番茄酱罐头，常用郝氏霉菌计测法。

１检样的制备：取定量检样,加蒸馏水稀释至折光指数为 1.3447~1.3460(即浓度为7.9%~8.8%)，备用。

2 显微镜标准视野的校正：将显微镜按放大率90倍~125倍调节标准视野，使其直径为1.382mm。

3 涂片：洗净郝氏计测玻片，将制好的标准液用玻璃棒均匀地摊布于计测室，以备观察。

4 观测：将制好的载玻片放于显微镜标准视野下进行霉菌观测，一般每一个检样观察50个视野，同一检样应由2人进行观察。

5 结果与计算：在标准视野下，发现有霉菌菌丝且其长度超过标准视野直径（1.382mm）的1/6（测微器的一格）或3根菌丝总长度超过标准视野的1/6，即判为阳性，否则为阴性。按100个视野计，其中发现菌丝体阳性的视野数，即为霉菌的视野百分数。

附：

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）：

马铃薯（去皮切块）300 g

葡萄糖20 g

琼脂20 g

蒸馏水 1 000 mL

制法：将马铃薯去皮切块，加1 000 mL蒸馏水煮沸10min~20min。用纱布过滤，补加蒸馏水至1 000 mL。加入葡萄糖和琼脂，加热溶化，分装，121℃高压灭菌20 min。

孟加拉红培养基：

蛋白胨 5 g

葡萄糖10 g

磷酸氢二钾 1 g

硫酸镁（七水）0.5 g

琼脂20 g

1/3 000 孟加拉红溶液100 mL

蒸馏水 1 000 mL

氯霉素0.1 g

制法：上述各成分加入蒸馏水溶解后，加入孟加拉红溶液。另用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中，分装，121℃高压灭菌20 min。

实验八肉与肉制品微生物学检验

[目的与要求]

1．了解并掌握肉与肉制品的常规微生物学检验方法；

2．通过检验，学会对肉的品质和质量作出简单的综合判定。

[实验器材及试剂]

被检肉样，试管，微量吸管，滴管，生理盐水，碱性美蓝染液，营养琼脂。

试管、天平、量筒、三角瓶、剪刀、镊子、载玻片、显微镜、香柏油、擦镜纸、灭菌平皿、消毒滤纸等。

[实验内容]

一、细菌镜检：分别观察肉表面和深层的细菌种类和数量。

1 制片镜检以无菌操作分别从待检肉块表层和深层制得2个触片，用甲醇（可用95%乙醇替代）固定，然后用碱性美蓝染色液染色3~5min，干燥，镜检不少于5个视野，分别记录每个视野的球菌和杆菌数，最后求出每个视野的细菌平均数。

2 判定标准新鲜肉触片印迹着色很浅，表层触片能看到少数球菌和杆菌，深层仅可见个别细菌或没有，触片上完全看不到分解的肉组织。

次新鲜肉印迹着色较好，表层触片能看到20~30个球菌和少数杆菌，深层可发现20个左右的细菌，触片上能看到分解的肉组织。

变质肉印迹着色很浓，不论表层或深层均能看到30个以上的细菌，且多数为杆菌。触片上粘附有大量分解的肉组织。

二、肉品表面细菌数的测定

1 采样方法1）滤纸法：将滤纸剪成2cm×2cm大小，灭菌后每张滴加1滴无菌盐水，用无菌镊子将滤纸紧贴于待检肉表面约1min，取下，放入带有玻璃珠的灭菌三角瓶中，按滤纸总面积加入2倍量的无菌生理盐水，充分振摇至滤纸片散成纤维，去上清液作10倍系列稀释。2）棉拭采样法：检验肉、禽及其制品表面受污染的程度，可用板孔5cm2的金属制规板压在受检物上，将灭菌棉拭稍沾湿，在板孔范围内反复揩抹多次，然后将板孔规板移压另一处，用另一棉拭揩抹，如此共移压揩抹10次，用10只棉拭，采样总面积为50cm2。每只棉拭在揩抹完毕后应立即剪断或烧断后投入盛有50mL灭菌水的三角瓶中，立即送检。检验时应充分振摇，然后作10倍系列稀释。

2 检验方法分别参见菌落总数测定、大肠菌群测定和沙门氏菌检验等相关标准。

实验九乳和乳制品的微生物学检验

[目的与要求]

1．了解乳类食品的样品采集和处理方法；

2．掌握乳类食品的微生物学检验方法；

3．掌握鲜乳中抗生素残留的检验方法。

[实验器材及试剂]

载玻片、显微镜、香柏油、擦镜纸、温箱、灭菌试管、吸管、灭菌平皿、稀释液、革

兰氏染色液，等。

[实验内容]

一、样品的采取和送检

1 大型包装的鲜乳：用灭菌吸管取样，采样时应注意代表性。采样数量按GB/T4789.1，放入灭菌容器内，及时送检。在气温较高或路途较远的情况下应进行冷藏，不得使用任何防腐剂。

2 定型包装的乳品：采取整件包装。采样时注意包装的完整。各种定型包装的乳与乳制品每件样品量按GB/T 4789.1要求。

二、检验内容

1 菌落总数和大肠菌群数测定参见实验二、实验三。

2 美蓝还原试验存在于乳中的微生物在生长繁殖过程中，能分泌出还原酶类，它们可使美蓝受还原而褪色，而还原反应的速度与乳中细菌数量呈正相关，因此可根据美蓝褪色时间估计乳中含菌量多少，从而对乳的品质作出评价。操作步骤如下：

1）用灭菌吸管取被检乳样10 mL置于无菌试管中，水浴加热至38~40℃（应塞上胶塞，但勿塞紧）。

2）用灭菌吸管取新鲜配制的1:30 000美蓝无菌水溶液1 mL，加入乳样中，立即塞紧胶塞上下颠倒3~4次，充分混匀。迅速置于38~40℃水浴箱中，并记录试验开始时间。

3）分别在开始后20min、2h和5.5h各观察一次，注意美蓝的褪色情况，并记录其褪色时间。

4）按下表判断被检生乳的等级。如被检样品是消毒乳，则美蓝褪色时间在6h以上方为合格。

表美蓝还原时间和生乳质量

3 直接涂片计数法可用于鲜乳中含菌数的检验。以一定量的鲜乳制成一定面积的涂片，染色后放在已知视野面积的显微镜油镜下直接计数每个视野的平均细菌数，然后换算出单位体积鲜乳中的细菌数。具体操作如下：

1）显微镜油镜视野面积的测定：取黑色硬纸片剪成圆形，以刚好能放入目镜中为度，纸片中央用利刀切一个3mm×3mm的方孔，或用直径3mm的打孔器打一个小孔。这样在把纸片放入目镜中后，可以缩小视野范围，便于计数。

首先把刻度为1μm的物测微尺置于油镜下，调整焦距看清刻度后，将黑纸片放入目镜中隔，用测微尺测出所观察到的视野的边长或直径，计算出视野面积。然后计算1cm2与视野面积的比值A。

2）制备涂片：用无菌微量加样器吸取1:10稀释的乳液10μl，小心涂于事先刻有1cm2方格的洁净载玻片上，均匀涂满整个空格面积但不要外溢。将载玻片置于恒热加热板或酒精灯火焰上方，使其在10 min内干燥但要避免过度加热。固定后浸于二甲苯中脱脂1~2 min，取出沥净并晾干，再浸入95% 乙醇中1~2 min，以洗去残留的二甲苯，取出晾干后，用碱性美蓝染色5 min，水洗，干燥即成。

3）镜检和计数：将涂片置于油镜下观察，根据菌数多少而检查10~50个视野，计算每个视野中的细菌数，求其平均值。

以一个视野细菌数的平均值乘以A，即为1 cm2面积即10μl乳中的细菌数，再将此数字乘以100再乘以10，即可得1mL乳中的含菌数。

用此方法得出的含菌数，往往比稀释倾注平板计数法得出的菌落总数大4倍左右，因为直接涂片计数包括死亡后尚未消失的细菌在内，而后者仅包括活菌数。但直接计数法可在较短时间内得出结果，同时也可认识一下乳中的病原菌。

实验十动物性食品中沙门氏菌的常规检验

[目的与要求]

通过本实验要求了解沙门氏菌的培养特性、形态染色特性、生化特性和血清学特性；掌握动物性食品中沙门氏菌的国家标准检验方法（GB4789·4－84）。

[实验器材及试剂]

温箱、营养琼脂、显微镜、载玻片、革兰氏染色液、亚硫酸铋琼脂、DHL琼脂、S·S 琼脂、三糖铁琼脂、蛋白胨水、KCN培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、pH7．2尿素琼脂、A—F多价O血清，等。

[实验内容]

（一）沙门氏菌的形态、染色特性观察；

（二）沙门氏菌的分离培养和菌落特性观察；

（三）沙门氏菌的生化特性观察；

（四）沙门氏菌的血清学鉴定（平板凝集试验）。

[操作步骤]

一、国家标准检验方法（GB4789·4－84）

（一）前增菌和和选择性增菌冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。各称取检样25g，加在装有225mL缓冲蛋白胨水的500mL广口瓶中，固体食物可先用均质器，以8000～10000转/分打碎1min。，或用乳钵加灭菌沙磨碎；粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化。于36±1℃培养4h（干蛋白需培养18～24h），移取10mL，转种子100mL氯化镁孔雀绿增菌液内或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42℃培养18～24h。同时，另取10mL 加入1 00mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36士1℃培养上18～24h。

鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工食品不必经过前增菌。各取25g（mL）加入灭菌生理盐水225mL按前法做成检样匀液，取其半量接种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42℃培养24h；另半量接种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36士1℃培养18～24h。

（二）分离取增菌液1环，划线接种于亚硫酸铋琼脂平板一个和DHL琼脂平板（或HE琼脂平板、或S·S琼脂平板）一个。两种增菌液可同时划线接种在一个平板上。于36士1℃分别培养18～24h（DHL、HE、S·S）或40～48h（BS），观察各个平板上生长的菌落。沙门氏菌属亚属Ⅰ、Ⅱ、IV、V和亚属Ⅲ在各个平板上的菌落特征见表3－1。

（三）生化试验挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落，接种于三糖铁琼脂上。一般应多挑几个菌落，以防遗漏。在三糖铁琼脂上，各个菌属的主要反应结果见表3－2。

*：+阳性；—阴性；+/—多数阳性，少数阴性

上表说明，在三糖铁琼脂内只有斜面产酸并同时H2S阴性的菌株可以排除，其他的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时也均有不是沙门氏菌的可能，因此都要做几项最低限度的生化实验，必要时作抹片染色镜检应为革兰氏阴性短杆菌，氧化酶实验应为阴性。

在接种三糖铁琼脂的同时，再接种蛋白胨水（供作靛基质试验）、pH7．2尿素琼脂、KCN培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各一管，于36士1℃培养18～24h，必要时可延长至48h，判定结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果属于A1、A 2和B1，其他五种反应结果均可以排除，详见表3－3。

检验科微生物实验室生物安全事件应急预案

检验科微生物实验室生物安全事件应急预案 This manuscript was revised by JIEK MA on December 15th, 2012.

检验科微生物实验室生物安全事件应急预案为了有效的预防微生物实验室生物污染，有效应对实验室突发污染事件，保证实验结果的科学准确，保障实验工作人员的健康、生命财产安全，防止实验室污染对周围环境造成严重污染，加强检验工作的质量控制和实验室的管理，根据《中华人民共和国传染病防治法》、《突发公共卫生事件应急条例》和《实验室生物安全通用要求》等相关法律法规的规定，特制定本预案，确保一旦发生实验室污染事件及安全事故时，能及时、规范、科学、迅速有效地控制。 一、适用范围 本预案适用于微生物实验室发生的、与实验室安全相关的、危害科室工作人员健康以及社会公众健康和社会稳定的所有事件。主要包括：1．病原微生物的实验室污染事件； 2．工作人员受到实验室内有毒病原微生物的感染或侵害； 3．病原微生物被泄漏出实验室事件。 4．由于停电、火灾等不可预测因素所引起的实验室其他污染事件。 当出现以上适用范围中的任意情况，启动本预案。 二、应急管理小组 有微生物实验室生物安全事件应急管理小组，科主任任组长，制定实验室生物安全防护指导方针，规划对实验室的硬件建设、组织实施科学管理。在实验室生物安全事件发生时，决策指挥，调动人员，全面部署。发生突发事件后应急处理小组全体成员，应立即按实验室污染突发事件处理

的技术规范，采取有效措施控制事件、调查原因，减少人员伤亡和财产损失。 三、预防措施 1．加强实验室标准化建设，对实验室设备的配置、个人防护和实验室安全行为应按《实验室生物安全通用要求》做出明确规定。 2．建立实验室病原微生物专库，对于传染病病原样本建立严格的监督管理制度。 3．增强安全意识，合理完善实验室生物安全的各项规章制度。把生物安全管理责任和措施落到实处，消除安全隐患。实验室工作人员应自觉遵守实验室生物安全管理规定，严格按照操作规程和技术规范开展研究工作。 4．提高警惕，加强安全保卫，防止不法之徒盗窃病原微生物和有毒有害化学试剂，用于对人群进行生物化学恐怖攻击，对公众健康产生严重损害，影响社会稳定。 5．建立有效的预警机制，为各种病原微生物和有毒有害化学试剂建立档案和使用纪录，填写准确。每次使用后及时登记，发现遗失或被盗，立即报告。 6．建立实验室工作人员健康档案，定期体检。发现与实验室生物安全有关的人员感染或伤害应立即报告。 7．定期开展自查，及时发现安全隐患，发出预警通报。 四、应急控制措施

食品微生物检测实验

实验一食品中细菌总数的检验 一、实验目的要求 1、了解细菌总数检验的意义。 2、掌握样品稀释处理的方法和菌落总数计数的方法 3、掌握国标法测定菌落总数的方法和技能 4、熟练无菌操作技术。 二、原理 菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。 菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。 三、试剂和仪器 （一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌） 规格名称数量用途 1、500ml广口瓶1个稀释样品 2、500ml三角瓶1个配制生理盐水 3、250ml三角瓶2个配制营养琼脂 4、18×180mm试管3支稀释样品 5、1ml移液管 5 支 6、直径为90mm平皿10套倒营养平板 7、250ml量筒1支 8、玻璃珠：直径约5mm （二）应灭菌、消毒的器材 剪刀1把不锈钢药匙1把称量纸：适量 酒精消毒的器材：吸耳球1个，滴管胶头4只，开瓶器

（三）应制备的培养基 培养基总量所用容器 1、0.85%NaCl生理盐水1瓶300ml/瓶500ml三角瓶 2、平板计数琼脂（PCA）培养基：2瓶100ml/瓶250ml三角瓶 四、实验内容 （一）、基本操作过程： 样品称量→→样品稀释→→倾注平皿→→培养48小时→→计数报告。 （二）、样品的稀释（样品的处理） 样品：袋装乳粉 外包装消毒→→无菌称样品25g→→加无菌生理盐水→→加盖振荡摇均匀 1、用75%酒精棉球擦拭消毒袋口，用无菌剪刀开封取样。称取检样25g，放入装有适量玻璃珠的灭菌广口瓶子中，然后用225mL温热的灭菌生理盐水徐徐加入（先加入少量生理盐水将乳粉调成糊状，再全部加入，以免奶粉结团），采用振摇法（用力快速振摇50次,振幅不小于40cm）振摇均匀，即为1:10的稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。 2、用1ml灭菌吸管，吸取1∶10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1∶100稀释液。 3、另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用另一支1ml灭菌吸管。 4、根据对检样污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的稀释液1ml于灭菌平皿内，每个稀释度做2个平皿。 5、用1ml生理盐水作空白对照试验，做2个平皿。 注意： ①吸管尖端不要触及瓶口或试管口外部，也不得触及管内稀释液。 ②吸管插入检样液内取样稀释时，插入深度要达2.5cm以上,调整时应使管尖与容器内壁紧贴。 ③进行稀释时，应使吸管内的液体沿管壁小心流加入，以免增加检液。 ④每递增稀释一次，即换用一支1ml灭菌吸管。

微生物学实验指导

实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察、 大小的测定和计数 一、实验目的 １、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养 2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片,学会绘制生物图 3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法 ４、了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法 二、实验器材 １、显微镜 ２、微生物标本装片 ３、目、物镜测微尺 ４、血球计数板 ５、酵母菌液或霉菌孢子液 6、载波片、盖波片、烧杯、滴管、擦镜纸、香柏油、二甲苯等 三、显微镜的构造、原理及使用方法 1、构造 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜,由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器;光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。 ２、操作 在目镜保持不变的情况下,使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下,特别是初学者，进行显微观察时应遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序,因为低倍数物镜视野相对大,易发现目标及确定检查的位置。 四、微生物大小的测量原理和方法 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小,只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和物镜测微尺。 1、目镜测微尺(图1-1）是一块圆形玻片,在玻片中央把5ｍｍ长度刻成5０等分，或把1０mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中 --

-- 间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同,目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用物镜测微尺校正，以求出在一定放大倍数下,目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 2、物镜测微尺(图１-２）是中央部分刻有精确等分线的载 玻片,一般将lmm 等分为100格,每格长ｌ０μm （即0.0ｌmm), 是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将物镜测微尺放在载 物台上,由于物镜测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经 过物镜和目镜的两次放大成象进入视野,即物镜测微尺随着显 微镜总放大倍数的放大而放大，因此从物镜测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小,所以用物镜测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度,然后移去物镜测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 3、目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把物镜测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与物镜测微尺的刻度平行，移动推动器,使两尺重叠,再使两尺的“０”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度（图1－３)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。因为物镜测微尺的刻度每格长l0μｍ，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。 例如目镜测微尺５小格正好与物镜测微尺5小格重叠，已知物镜测微尺每小格为ｌ0μm ，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/５=1０μm 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同,因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用,当更换不同放大倍数的目镜或物镜时,必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 4、细胞大小的测定 移去物镜测微尺,换上待测菌体的装片，先在低倍镜下找到目的物,然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值,即等于该菌的长和宽。 结果计算： 长μm=平均格数×校正值 宽μｍ＝平均格数×校正值 大小表示: 宽μm ×长μｍ 五、微生物细胞数量的测定原理和方法 1、血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个计数区(图1-4），计数区 图1-1 目镜测微尺 图1-2 物镜测微尺 图1-3 目、物镜测微尺的校正 图1-4 血球计数板

关于病原微生物实验室生物安全管理自查报告

病原微生物实验室生物安全 管理工作自查材料 尊敬的各位领导、专家： 大家好！ 为加强医院病原微生物实验室生物安全管理工作，确保医院平安目标的实现，实验室各项工作的有效有序进行，确保微生物实验室不发生生物安全事件，保障公众健康，维护社会稳定，我院检验科根据湖北省《病原微生物实验室生物安全管理条例》《2015年度全省病原微生物实验室生物安全督导检查工作方案》的相关内容，对医院实验室安全管理工作进行了自查。现总结汇报如下： 一、组织机构与管理制度 医院检验科根据《病原微生物实验室生物安全管理条例》的相关规定进行学习，于2013年8月搬迁之际成立了微生物实验室，建立了生物安全管理制度，并于2014年5月成立生物安全专家委员会及工作领导小组，由院党委书记院长魏华任组长，副院长叶 志伟、李正宇任副组长，委员会明确了职责，建立了工作制度， 详细了规划了生物安全管理的工作细则。检验科在此基础上建立 实验室安保制度，并定期对有关生物安全各项规章制度的运行情 况进行检查，对存在的问题及时进行整改。实验室所从事的实验 活动均严格遵守有关的国家标准和实验室技术规范、操作规程， 并指定专人监督检查实验室技术规范和操作规程的落实情况。同

时，对检查情况进行详细记录，定期召开会议讨论工作中发现的问题，及时纠正。 二、实验室资质和备案情况 医院检验科已于2013年在卫计委进行了了BSL-2实验室备案。检验科目前是HIV检测点，可做HIV的快速检查，筛查实验室的资质已于2015年8月向市疾控中心申报，等待评审验收！PCR实验室（进行乙肝DNA 检测）资质已于2015年10月向湖北省临检中心申报，等待现场评审！ 三、生物安全管理制度的落实 建立实验室生物安全管理体系文件，制定了相关规章制度，并严格执行。非工作人员不得进入实验室工作区域，生物安全员和科主任对实验室生物安全每月进行一次自查自检，及时发现问题，纠正问题。有应急预案，计划年底进行一次应急演练。有完善的个人防护及健康监护制度，建立个人健康档案，定期对实验室人员及医院相关职能科室人员进行生物安全培训，有随时可阅的生物安全手册，规范了血液、体液外溢在台面、地面和其他表面的的处理原则、皮肤刺伤(破损)的处理原 则、离心管发生破裂的处理原则。在实验室的显着位置张贴了实验负责人、实验室工作人员、消防、医院、公安、工程技术人员、水、电气维修部门电话。日常标本在鉴定完毕后进行高压灭菌销毁时，要做到灭菌指示标志明确，达到灭菌效果，才能转运到医疗废物处理中心，并做好销毁登记等内容。同时对检验科的各类仪器作好定期维护校准工作，并在设备使用登记本上作好详细记录。

食品微生物检测实验室要求

自来水水池至少有两个，工作台，药品试剂柜，超净工作台（无菌室），灭菌锅，培养箱，冰箱，干燥箱，电子天平，显微镜，平皿，试管，三角瓶等玻璃器皿。这些都是必备基本设备，只要能摆放的下就可以。 一、微生物实验室设计 微生物实验室由准备室、洗涤室、灭菌室、无菌室、恒温培养室和普通实验室六部分组成。这些房间的共同特点是地板和墙壁的质地光滑坚硬，仪器和设备的陈设简洁，便于打扫卫生。 二、微生物实验室基本要求（一）准备室 准备室用于配制培养基和样品处理等。室内设有试剂柜、存放器具或材料的专柜、实验台、电炉、冰箱和上下水道、电源等。（二）洗涤室 洗涤室用于洗刷器皿等。由于使用过的器皿已被微生物污染，有时还会存在病原微生物。因此，在条件允许的情况下，最好设置洗涤室。室内应备有加热器、蒸锅，洗刷器皿用的盆、桶等，还应有各种瓶刷、去污粉、肥皂、洗衣粉等。 （三）灭菌室 灭菌室主要用于培养基的灭菌和各种器具的灭菌，室内应备有高压蒸汽灭菌器、烘箱等灭菌设备及设施。（四）无菌室 无菌室也称接种室，是系统接种、纯化菌种等无菌操作的专用实验室。在微生物工作中，菌种的接种移植是一项主要操作，这项操作的特点就是要保证菌种纯种，防止杂菌的污染。在一般环境的空气中，

由于存在许多尘埃和杂菌，很易造成污染，对接种工作干扰很大。1. 无菌室的设置 无菌室应根据既经济又科学的原则来设置。其基本要求有以下几点： （1）无菌室应有内、外两间，内间是无菌室，外间是缓冲室。房间容积不宜过大，以便于空气灭菌。最小内间面积2×2.5＝5m2，外间面积1×2＝2m2，高以2.5m以下为宜，都应有天花板。 （2）内间应当设拉门，以减少空气的波动，门应设在离工作台最远的位置上；外间的门最好也用拉门，要设在距内间最远的位置上。（3）在分隔内间与外间的墙壁或“隔扇”上，应开一个小窗，作接种过程中必要的内外传递物品的通道，以减少人员进出内间的次数，降低污染程度。小窗宽60cm、高40cm、厚30cm，内外都挂对拉的窗扇。（4）无菌室容积小而严密，使用一段时间后，室内温度很高，故应设置通气窗。通气窗应设在内室进门处的顶棚上（即离工作台最远的位置），最好为双层结构，外层为百叶窗，内层可用抽板式窗扇。通气窗可在内室使用后、灭菌前开启，以流通空气。有条件可安装恒温恒湿机。 2. 无菌室内设备和用具 （1）无菌室内的工作台，不论是什么材质、用途的，都要求表面光滑和台面水平。 （2）在内室和外室各安装一个紫外灯（多为30W）。内室的紫外线灯应安装在经常工作的座位正上方，离地面2m，外室的紫外线灯可

食品卫生微生物检验实验室操作技术要求

食品卫生微生物检验实验室操作技术要求 实验室管理制度 一、实验室管理制度 1．实验室应制定仪器配备管理、使用制度，药品管理、使用制度，玻璃器皿管理、使用制度，并根据安全制度和环境条件的要求，本室工作人员应严格掌握，认真执行。2．进入实验室必须穿工作服，进入无菌室换无菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非实验室人员不得进入实验室，严格执行安全操作规程。 3．实验室内物品摆放整齐，试剂定期检查并有明晰标签，仪器定期检查、保养、检修, 严禁在冰箱内存放和加工私人食品。 4．各种器材应建立请领消耗记录，贵重仪器有使用记录，破损遗失应填写报告；药品、器材、菌种不经批准不得擅自外借和转让，更不得私自拿出。5．禁止在实验室内吸烟、进餐、会客、喧哗，实验室内不得带入私人物品，离开实验室前认真检查水电，对于有毒、有害、易燃、污染、腐蚀的物品和废弃物品应按有关要求执行。 6．负责人严格执行本制度，出现问题立即报告，造成病原扩散等责任事故者，应视情节直至追究法律责任。 二、仪器配备、管理使用制度 1．食品微生物实验室应具备下列仪器：培养箱、高压锅、普通冰箱、低温冰箱、厌氧培养设备、显微镜、离心机、超净台、振荡器、普通天平、千分之一天平、烤箱、冷冻干燥设备、匀质器、恒温水浴箱、菌落计数器、生化培养箱，电位pH计、高速离心机。 2.实验室所使用的仪器、容器应符合标准要求，保证准确可靠，凡计量器具须经计量部门检定合格方能使用。 3．实验室仪器安放合理，贵重仪器有专人保管，建立仪器档案，并备有操作方法，保养、维修、说明书及使用登记本，做到经常维护、保养和检查，精密仪器不得随意移

动，若有损坏需要修理时，不得私自拆动、应写出报告、通知管理人员，由经理同意填报修理申请、送仪器维修部门。 4．各种仪器（冰箱、温箱除外），使用完毕后要立即切断电源，旋钮复原归位，待仔细检查后，方可离去。5．一切仪器设备未经设备管理人员同意，不得外借，使用后按登记本的内容进行登记。 6．仪器设备应保持清洁，一般应有仪器套罩。 7．使用仪器时，应严格按操作规程进行，对违反操作规程的因管理不善致使仪器械损坏，要追究当事者责任。 三、药品管理、使用制度 1．依据本室检测任务，制定各种药品试剂采购计划，写清品名、单位、数量、纯度、包装规格，出厂日期等，领回后建立账目，专人管理，每半年做出消耗表，并清点剩余药品。2．药品试剂陈列整齐，放置有序、避光、防潮、通风干燥，瓶签完整，剧毒药品加锁存放、易燃、挥发、腐蚀品种单独贮存。 3．领用药品试剂，需填写请领单、由使用人和室负责人签字，任何人无权私自出借或馈送药品试剂，本单位科、室间或外单位互借时需经科室负责人签字。 4．称取药品试剂应按操作规范进行，用后盖好，必要时可封口或黑纸包裹，不使用过期或变质药品。 四、玻璃器皿管理、使用制度 1．根据测试项目的要求，申报玻璃仪器的采购计划、详细注明规格、产地、数量、要求，硬质中性玻璃仪器应经计量验证合格。2．大型器皿建立账目，每年清查一次，一般低值易耗器皿损坏后随时填写损耗登记清单。 3．玻璃器皿使用前应除去污垢，并用清洁液或2%稀盐酸溶液浸泡24 h后，用清水冲洗干净备用。 4．器皿使用后随时清洗，染菌后应严格高压灭菌，不得乱弃乱扔。 五、安全制度 1．进入实验室工作衣、帽、鞋必须穿戴整齐。2．在进行高压、干燥、消毒等工作时，工作人员不得擅自离现场，认真观察温度、时间，蒸馏易挥发、易燃液体时，不准直接

食品卫生微生物检验实验室操作技术(doc 10)

食品卫生微生物检验实验室操作技术(doc 10)

3．严禁用口直接吸取药品和菌液，按无菌操作进行，如发生菌液，病原体溅出容器外时，应立即用有效消毒剂进行彻底消毒，安全处理后方有离开现场。 4．工作完毕，两手用清水肥皂洗净，必要时可用新洁尔灭、过氧乙酸泡手，然后用水冲洗，工作服应经常清洗，保持整洁，必要时高压消毒。 5．实验完毕，即时清理现场和实验用具，对染菌带毒物品，进行消毒灭菌处理。 6．每日下班，尤其节假日前后认真检查水、暖气、电和正在使用的仪器设备，关好门窗，方可离去。 六、环境条件要求 1. 实验室内要经常保持清洁卫生，每天上下班应进行清扫整理，桌柜等表面应每天用消毒液擦拭，保持无尘，杜绝污染。 2. 实验室应井然有序，不得存放实验室外及个人物品、仪器等，实验室用品要摆放合理，并有固定位置。 3. 随时保持实验室卫生，不得乱扔纸屑等杂物，测试用过的废弃物要倒在固定的箱筒内，并及时处理。 4. 实验室应具有优良的采光条件和照明设备。 5. 实验室工作台面应保持水平和无渗漏，墙壁和地面应当光滑和容易清洗。 6. 实验室布局要合理，一般实验室应有准备间和无菌室，无菌室应有良好的通风条件，如安装空调设备及过滤设备，无菌室内空气测试应基本达到无菌。 7. 严禁利用实验室作会议室及其他文娱活动和学习场所。第二节实验室技术操作要求 一、无菌操作要求 食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多试验要求在无菌条件下进行，主要原因：一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。 1. 接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 2. 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。

【实验室管理】食品微生物检测实验室操作要求

食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多试验要求在无菌条件下进行，那么，对食品微生物检测实验室操作要求有哪些？ 无菌操作要求 1.接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 2.进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 3.接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。 4.进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。 5.从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。 6.接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。 7.接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。 8.吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。 无菌间使用要求 1.无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5～0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物品。 2.无菌间内应保持清洁，工作后用2%～3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。 3.无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W 紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在

紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。 4.处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。 5.在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置。 消毒灭菌要求 微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。 干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法 1.灭菌前准备（1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。 （2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。 2.装放（1）干热灭菌器：装放物品不可过挤且不能接触箱的四壁。 （2）大型高压蒸气锅：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。 3.设备检查 （1）检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。 （2）检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞。 （3）对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否符合于进行灭菌处理的要求。 4.灭菌处理

检验科微生物室室内质量控制流程

检验科微生物室室内质量控制流程 一、实验室仪器设备的性能维护 微生物室常用仪器设备主要包括：细菌培养箱、细菌鉴定及药敏测试仪、显微镜、高压灭菌器、冰箱、水浴箱等。这些仪器设备的质量维护对于检验结果的质量保证至关重要。性能维护方法及维护频率参照制造商提供的使用手册进行。如使用手册中未详细注明或实验室自身无法完成，由生产厂家协助解决，每年至少一次。 二、培养基的质量控制 要求对培养基进行两方面的质量控制：无菌试验以及已知菌生长试验。无菌试验一般为随机抽样3-5%，在35℃条件下培养48h，每批培养基至少进行一次无菌试验；已知菌生长试验的前提条件是实验室有足够的已知菌储备，其中包括标准菌株(如ATCC或NCTC标准菌株)及经过准确鉴定的临床分离菌。如果条件允许，提倡使用标准菌株。已知菌生长试验应明确预期结果。每批培养基至少进行一次已知菌生长试验。三、细菌染色的质量控制 在临床细菌学检查过程中，革兰染色和抗酸染色使用频率最高。 1．革兰染色IQC要求：利用标准菌株(金黄色葡萄球菌ATCC25923及大肠埃希菌ATCC25922)或其他已知的革兰阳性菌及革兰阴性菌至少每周进行一次质量验证。 2．抗酸染色：利用已知的抗酸杆菌(AFB)阳性涂片每周或在更新炭酸复红染液时至少进行一次质量验证。 四、细菌鉴定或鉴别常用试验的质量控制 细菌鉴定或鉴别试验的IQC就是利用已知菌或标准菌株(如ATCC或NCTC标准菌株)进行鉴定或鉴别试验相关影响因素的质量监控。应用频率较高的试验IQC每周至少一次，频率较低的试验IQC随标本一同进行。五、微生物药物敏感试验的质量控制 临床常用抗微生物药物敏感试验包括一般β-内酰胺酶测试、超广谱β-内酰胺酶(ELBLs)测试、纸片扩散法药敏试验以及定量药敏试验(即MICs测定法)。 1．一般β-内酰胺酶测试的质量控制：至少每周一次。质控菌株可使用临床分离的已知菌株，但最好使用标准菌株，如淋病奈瑟菌ATCC31426(β-内酰胺酶阳性绿脓杆菌ATCC27853)和淋病奈瑟菌ATCC43069(β-内酰胺酶阴性或金黄色葡萄球菌ATCC25923)。 2．ESBLs测试的质量控制：美国临床实验室标准化协会(CLSI：原NCCLS)目前仅提供了肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌ESBLs的测试标准。其测试标准参照最新的CLSI文件。质量控制随临床测试菌株一同进行。 3．纸片扩散法及MIC测定法药敏试验的质量控制：质控试验条件、质控菌株选择及质控允许范围参照最新的CLSI规定。频率为每周至少一次。 4．某些耐药菌检测的质量控制：一些耐药菌株如高水平氨基糖苷类耐药的肠球菌、苯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌以及万古霉素耐药的肠球菌等的IQC具体方法、质

检验科微生物实验室菌种

任县医院检验科微生物实验室菌种、毒株管理规定与 流程 1．目的 对本实验室菌种、毒种的申购、保存、保管、领用、处理等各个环节实行有效的监督控制，防止意外事故发生，确保疾病预防与控制检验业务及科研教学工作。 2．适用范围及菌种、毒种专职管理人员 适用于本科微生物实验室菌种、毒株的管理； 菌种、毒种专职管理人员：宋素玲乔伟涛 3．职责 3．1微生物实验室负责菌、毒种的出入库保管、保存及处理等日常管理。 3．2科室指定宋素玲乔伟涛2名菌种、毒种库管理人员承担菌、毒种日常管理。 3．3科室负责人负责一、二类菌、毒种的出入库和向上级索取及对下级发送的审核。 3．4技术管理层批准本实验室一、二类菌、毒种的出入库和向上级索取及对下级发送的审批。 4．工作程序 4．1报送及入库 4．1．1当微生物实验室检出菌、毒株应及时报送市疾病预

防控制中心。 4．1．2新发现的菌、毒种，要做好原始记录，逐级报送进行复核确认，报送时须宋素玲乔伟涛2人参加。 4．1．3一、二类菌、毒种入库前，科室审核，技术管理层批准后入库 4．1．4个人不得擅自保留菌、毒种，必须由科室进行统一编号、登记入库管理 4．1．5菌、毒种入库时，宋素玲乔伟涛2名菌、毒种保管人员须认真做好菌毒种的编号、登记工作。 4．2日常管理 4．2．1保管人员由宋素玲乔伟涛2名检验人员组成。4．2．2菌、毒种入库时，保管人员应及时验收，统一编号，填写《菌、毒种登记表》 4．2．3严禁随意将菌、毒种置于非菌、毒种专用保存场所，应做到三专（专室、专柜、专锁）。 4．2．4菌、毒种库由2名保管人员双锁管理，铁门与锁必须牢固有效，发现损坏须及时报修。未经各科室负责人同意，不得擅自将钥匙委托他人代管。 4．2．5菌、毒种保管人员应定期对库内温度、湿度、通风及冰箱、冰柜等菌、毒种保藏设备运转情况进行检查，并做好记录。 4．2．6菌、毒种保管人员根据菌、毒种的保存期限，及时

微生物学实验指导(10.10)

实验一显微镜的使用及细菌的革兰氏染色 一、实验目的和内容 （一）实验目的 1. 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油镜的使用方法。 2. 初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤 （二）实验内容 1．学习油浸系物镜的使用方法。 2．制作细菌染色装片。 3．进行革兰氏染色法操作。 4．用油镜观察大肠杆菌和苏云金杆菌染色装片。 二、实验原理 （一）油镜的基本原理 普通光学显微镜包括低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜。油镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95×、100×等。油镜头上常刻有OI（Oil，Immersion）或HI（Homogeneous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长。在低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numberal aperture）最大，而工作距离最短（图3-1）。 图1-1 显微镜物镜参数图 显微镜的分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比.

从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积。影响数值孔径大小的因数，一是镜口角，二是介质的折射率。 当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n＝1.0）与玻璃（n＝1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n＝1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明废，更重要的是通过增加数值孔径提高分辨率，因而可以使物像明亮清晰。 （二）革兰氏染色 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的，是细菌学中最重要的鉴别染色法，其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。

检验科微生物室sop文件检验科微生物实验室

检验科微生物室sop文件检验科微生物实验室检验科微生物室SOP文件检验科微生物实验室 作业指导书细菌室工作守则文件编号:LAB,SOP,JX001 细菌室工作守则 1.每日工作前用紫外线照射实验室半小时以上。 2.入室前应穿工作服，并做好实验前的各项准备工作。 3.实验室内应保持肃静，不准吸烟、吃东西及用手触摸面部。尽量减少室内活动，以免引起风动，无关人员禁入。 4.非必要物品禁止带入实验室，必要资料和书籍带入后，应远离操作台。 5.做好标本的登记、编号及试验记录。未发出报告前，请勿丢弃标本。 6.标本处理及各项试验应在操作间进行，接种环用完后应立即火焰灭菌，沾菌吸管、玻片等用后应浸泡在消毒液内。 7.实验时手部污染，应立即用过氧乙酸消毒或浸于3%来苏儿溶液中5-10分，再用肥皂洗手并冲洗干净;如误入口内，应立即吐出，并用1:1000高锰酸钾溶液或3%双氧水漱口，根据实际情况服用有关药物。 8.实验过程中，如污染了实验台或地面，应用3%来苏儿覆盖其上半小时，然后清洗;如污染工作服，应立即脱下，高压灭菌。 9.若出现着火情况，应沉着处理，切勿慌张，立即关闭电闸，积极灭火。易燃物品(如酒精、二甲苯、乙醚和丙酮等)必须远离火源，妥善保存。 10.工作结束时检查电器、酒精灯等是否关闭，观察记录培养箱、冰箱温度及工作情况，用浸有消毒液的抹布将操作台擦拭干净，并将试剂、用具等放回原处，清理台面，未污染的废弃物扔进污物桶，有菌废弃物应送高压灭菌后处理。 11.离室前工作人员应将双手用消毒液消毒，并用肥皂和清水洗净。

12.爱护仪器设备，经常清洁，注意防尘和防潮。 作业指导书细菌室消毒隔离措施文件编号:LAB,SOP,JX002 细菌室消毒隔离措施 1.每天工作前用消毒液消毒工作台，上班前、下班后开紫外灯(最少半小时)进行空气消毒。 2.非必要品禁止带入实验室，必要资料和书籍带入后，应远离操作台。 3.使用后的载玻片、盖片、平皿、试管等用消毒液浸泡，经煮沸后清洗或丢弃。 4.试验后的血液标本用消毒液浸泡后煮沸消毒，所有用于试验的反应板、吸头等用消毒液浸泡(至少24小时以上)后清洗或丢弃。 5.所有微生物培养物(细菌、支原体、真菌等培养物)，不管标本阳性或阴性均用消毒液浸泡后，经煮沸消毒，才能清洗或丢弃。 6.取材、最好采用一次性工具，不能采用一次性工具者，每次取材前均应彻底消毒。 7.用于浸泡各种器械如刮菌刀、持物钳、镊子等的消毒液要定期更换。 8.不慎发生临床标本或培养物污染工作台，不要立即用水冲洗，应先用纸巾、布等敷料加上消毒液(如5%石炭酸、3%来苏儿等)消毒30分钟以上，然后再清洗。如污染工作服，应立即脱下，高压灭菌。 9.实验时手部污染，应立即用肥皂洗手并冲洗干净，再外用消毒药水，如误入口内，应立即吐出，并用1:1000高锰酸钾溶液或3%双氧水漱口，必要时根据实际情况服用有关药物。作业指导书微生物实验室安全与防护文件编 号:LAB,SOP,JX003 在工作区内禁止饮食，吸烟和存放食物及使用化妆品。 实验室里应保持整洁，不存放与工作无关的杂物。 工作台每天至少用消毒剂清洁一次，在溢渗传染物后要立即消毒、清洗; 进入无菌室必须穿工作服，戴口罩、帽子。 在各种操作进程中均应尽量避免或减少气溶胶产生。

食品卫生微生物检验实验室操作技术

食品卫生微生物检验实验室操作技术要求??第一节实验室管理制度??一、实验室管理制度? 1．实验室应制定仪器配备管理、使用制度,药品管理、使用制度,玻璃器皿管理,使用制度,并根据安全制度和环境条件的要求,本室工作人员应严格掌握,认真执行。??２．进入实验室必须穿工作服,进入无菌室换无菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非实验室人员不得进入实验室，严格执行安全操作规程。 ?3．实验室内物品摆放整齐，试剂定期检查并有明晰标签,仪器定期检查、保养、检修, 严禁在冰箱内存放和加工私人食品。? 4．各种器材应建立请领消耗记录,贵重仪器有使用记录，破损遗失应填写报告；药品、器材、菌种不经批准不得擅自外借和转让，更不得私自拿出，应严格执行《菌种保管制度》。??５．禁止在实验室内吸烟、进餐、会客、喧哗,实验室内不得带入私人物品，离开实验室前认真检查水、电、暖气、门窗，对于有毒、有害、易燃、污染、腐蚀的物品和废弃物品应按有关要求执行。? 6.科、室负责人督促本制度严格执行,根据情况给于奖惩,出现问题立即报告，造成病原扩散等责任事故者，应视情节直至追究法律责任。??二、仪器配备、管理使用制度? １．食品微生物实验室应具备下列仪器:培养箱、高压锅、普通冰箱、低温冰箱、厌氧培养设备、显微镜、离心机、超净台、振荡器、普通天平、千分之一天平、烤箱、冷冻干燥设备、匀质器、恒温水浴箱、菌落计数器、生化培养箱,电 2.实验室所使用的仪器、容器应符合标准要求,保位pＨ计、高速离心机。?? 3.实验室仪器安证准确可靠,凡计量器具须经计量部门检定合格方能使用。?? 放合理，贵重仪器有专人保管，建立仪器档案，并备有操作方法，保养、维修、说明书及使用登记本，做到经常维护、保养和检查,精密仪器不得随意移动，若有损坏需要修理时，不得私自拆动、应写出报告、通知管理人员,经科室负责人同意填报修理申请、送仪器维修部门。 ?4．各种仪器（冰箱、温箱除外)，使用完毕后要立即切断电源，旋钮复原归位，待仔细检查后,方可离去。 ?5．一切仪器设备未经设备管理人员同意，不得外借,使用后按登记本的内容进行登记。 7．使用仪器时，应严格按?6．仪器设备应保持清洁,一般应有仪器套罩。?? 操作规程进行，对违反操作规程的因管理不善致使仪器械损坏，要追究当事者责任。 1.依据本室检测任务，制定各种药品试剂采购?三、药品管理、使用制度?? 计划，写清品名、单位、数量、纯度、包装规格,出厂日期等，领回后建立帐目,专人管理，每半年做出消耗表，并清点剩余药品。 2.药品试剂陈列整齐,放置有序、避光、防潮、通风干燥，瓶签完整，剧毒药品 3．领用药品试剂，需填写请加锁存放、易燃、挥发、腐蚀品种单独贮存。?? 领单、由使用人和室负责人签字,任何人无权私自出借或馈送药品试剂，本单位科、室间或外单位互借时需经科室负责人签字。 ? 4.称取药品试剂应按操作规范进行，用后盖好,必要时可封口或黑纸包裹，不使用过期或变质药品。??四、玻璃器皿管理、使用制度 1.根据测试项目的要求，申报玻璃仪器的采购计划、详细注明规格、产地、数量、

微生物学实验报告

微生物学实验报告 (格式标准) (生命科学专业) 教师:黎勇 目录索引 实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 3 实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 5 实验三常用培养基的配制7 实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别8 实验五、微生物大小的测定与显微计数10 实验六环境中微生物的检测与分离纯化11 实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应12 实验八(综合实验)化能异养微生物的分离与纯化13 课程名称: 微生物学实验班级:化生系生命科学本科 实验日期: 指导教师:黎勇 实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术;观察细菌的基本形态;学习观察细菌的运动性的基本方法。 〔基本原理〕 1、 N·A=n·sinα 2、 D=λ/2N、A 3、目镜可提高放大倍数,但有效放大率取决于镜口率。已经分辨的物体不放大瞧不清,未分辨物放得再大也瞧不清。 4、用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时,可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。 〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸;细菌、放线菌等固定装片;培养18小时左右的B、subtilis、 S、arueus 菌斜面培养物;无菌水、生理盐水。 〔方法步骤〕: (一) 油镜的使用 镜检装片在中倍(或高倍镜)下找到目的物,并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置,虹彩光圈开到最大,镜头转开成八字形在玻片的镜检部位(光斑处)滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台(缩短镜头与装片距离,镜头浸入油中,至油圈不扩大为止镜头几与装片接触) 粗调器徐徐下降载物台(密切注视视野,当捕捉到物像时,立即用细调器校正) 仔细观察并绘图 取出装片,清洗油镜:擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留(用手指辅助,迅速拭擦一、二次) 用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯(2-3次)。 (二) 细菌的简单染色法:涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察 (三) 细菌运动性的观察取洁净盖玻片,四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察 〔结果分析〕 1、画一圆圈表示视野,选取所观察的微生物绘图,注意特殊结构、形状与排列。(描绘时按视野实际大小5－10倍绘制)

检验科微生物室上岗考核试题(有答案)

微生物室上岗、轮岗考核 1.目前实验室保存菌种的最好方法是( ) A.冷冻保存法 B.半固体保存法 C.冷冻真空干燥法 D.普通琼脂斜面保存法 E.干燥保存法 39.双糖铁培养基属于( ) A.基础培养基 B.鉴别培养基 C.营养培养基 D.选择培养基 E.厌氧培养基 3.革兰染色结果判定G一应为( ) A.红色 B.紫色 C.蓝色 D.黄色 E.白色 4.肠毒素型大肠埃希菌( ) A.EIEC B.ETEC C.EPEC D.EHEC E.EAggEC 5.临床上病人留取痰标本后，应( ) A.立即温箱干燥后，送实验室 B.置于4℃生理盐水中保存 C.立即送实验室检测 D.置于增菌液中保存 E.室温过夜 6.下列细菌中血浆凝固酶试验阳性的是( ) A.表皮葡萄球菌 B.溶血葡萄球菌 C.金黄色葡萄球菌 D.腐生葡萄球菌 E.模仿葡萄球菌 7.肺炎链球菌在血平板上生长时，菌落周围常常会出现溶血环，其特征为( ) A.草绿色 B.褐色 C.暗红色 D.砖红色 E.黄色

8.罗氏培养基适用于培养下列哪种细菌( ) A.霍乱弧菌 B.肠道细菌 C.白喉杆菌 D.破伤风梭菌 E.结核杆菌 9.细菌诊断中标本采集和运送的原则包括( ) A.标本必须新鲜，采集后尽快送检 B.在送检过程中，对脑膜炎球菌标本要进行保温 C.在检验容器上要贴好标签 D.尽可能采集病变明显部位的材料 E.以上都是 10.淋病是由下列何种病原体引起的( ) A.梅毒螺旋体 B.淋病奈瑟菌 C.淋病螺旋体 D.淋病杆菌 E.衣原体 11.与革兰染色无关的染料是( ) A.结晶紫 B.亚甲蓝 C.稀释石炭酸复红 D.卢戈碘液 E.95％乙醇 12.哪种创伤最适宜引起破伤风梭菌感染( ) A.深度刺伤或战伤 B.膝肘部大面积擦伤 C.因瘙痒挠破的伤痕 D.被猫抓破的伤口 E.被树枝刮破表皮 13.下列描述，哪项不正确( ) A.消毒是指杀死物体上所有微生物的方法 B.灭菌是指杀灭物体上所有微生物的方法 C.防腐是指防止或抑制细菌生长繁殖的方法 D.无菌为不含活菌的意思 E.消毒不一定能杀死含芽胞的细菌和非病原微生物 14.与其他肺部感染病原菌相比较，铜绿假单胞菌的毒力特点是( ) A.产生外毒素 B.具有内毒素 C.产生溶血素 D.产生绿脓素 E.具有菌毛 15.MIC是( )

水处理微生物学实验指导书

水处理微生物学实验指导书 班级 姓名 学号 市政与环境工程学院 年月

目录 实验一显微镜、测微尺的使用及生物相的观察实验二革兰氏染色技术 实验三培养基的配制和灭菌 实验四水中细菌总数的测定

实验一显微镜、测微尺的使用及生物相的观察 一、实验目的与要求 （1）了解普通光学显微镜的构造与功能，学习与掌握显微镜观察微生物的方法。 （2）观察细菌、放线菌和蓝细菌的个体形态，学会绘制微生物的形态结构图。 二、显微镜的基本结构和功能 普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。以往最简单的显微镜仅由几块透镜组成，而当前使用的显微镜由一套透镜组成。普通光学显微镜通常能将物体放大1500—2000倍。 （一）显微镜的构造 普通光学显微镜的构造可分为两大部分：一为机械装置，一为光学系统，这两部分很好的配合，才能发挥显微镜的作用。 1、显微镜的机械装置 显微镜的机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺旋等部件。 （1）镜座镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载物台和镜筒，它是用来安装光学放大系统部件的基础。 （2）镜筒镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜（装在转换器下）间的暗室。 从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的。镜筒长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且成像质量也受到影响。因此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒长度。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm，此数字标在物镜的外壳上。 （3）物镜转换器物镜转换器上可安装3—4个接物镜，一般是三个接物镜（低倍、高倍、油镜）。Nikon显微镜装有四个物镜。转动转换器，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。 （4）载物台载物台中央有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。 （5）推动器是移动标本的机械装置，它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的，好的显微镜在纵横架杆上刻有刻度标尺，构成很精密的平面座标系。如果我们须重复观察已检查标本的某一部分，在第一次检查时，可记下纵横标尺的数值，以后按数值移动推动器，就可以找到原来标本的位置。（6）粗动螺旋粗动螺旋是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件，老式显微镜粗螺旋向前扭，