家畜胚胎超低温冷冻保存的研究进展

家畜胚胎超低温冷冻保存的研究进展

蔡元1、2，张凤鸣1、2，潘红梅1、2、，陈四清1、2

(1.重庆市畜牧科学院重庆荣昌402460 .2.重庆市养猪工程技术研究中心重庆荣昌402460)

摘要：本文对家畜胚胎冷冻保护液的成分、冷冻方法、胚胎解冻方法与冷冻保护剂的脱除及最新研究进展进行了综述。

关键词：家畜；胚胎；冷冻保存

Present Research Advance in Cryopreservation of Livestock Embryos

Cai yuan1、2, Zhang fengming1 2 ,Pan hongmei1、2 ,Chengsiqing1 2

(1.Chongqing Institute of Animal Science ,Chongqing Rongchang 402460

2.Chongqing Swine engineering Research，Chongqing Rongchang 402460)

Abstract： Advances on cryoprotextive solution, freezing way, thaw way and the elimination of cryoprotective solution and recent situation in livestock embryos were reviewed in this paper. Key words：Livestock；Embryo；Cryopreservation

家畜胚胎的超低温冷冻保存技术不仅为动物种质资源的保存和良种家畜的国际交流提供了简单有效的手段,而且还是胚胎移植、体外受精、转基因和克隆等胚胎生物技术不可分割的组成部分。自从1972年,英国学者Whittingham等人首次冷冻保存小鼠胚胎获得成功后[1]，到目前已经在20多种哺乳动物上获得成功，奶牛、黄牛、山羊、绵羊、马、兔和小鼠等的冷冻胚胎已得到较广泛的使用[2-3]，特别是牛和羊的胚胎冷冻保存研究进展很快，其冷冻胚胎已经走向商品化应用。目前人们对冷冻保存原理、冷冻保存的因素和冷冻方法进行了广泛的研究并取得了巨大进步。

1、抗冻保护剂和冷冻溶液

在哺乳动物的胚胎冷冻过程中，加入抗冻保护剂的目的是为了防止冰晶的形成。抗冻保护剂常可分为三类：(1)细胞内液抗冻保护剂。常用低分子量可渗性物质，例如甲醇、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(G)、二甲基亚砜(DMSO)等；(2)细胞外液抗冻保护剂。常用低分子量不可渗性物质，例如半乳糖(Galactose)、蔗糖(Sucrose)、海藻糖(Trchaose)、聚蔗糖(Ficoll)等。（3）大分子量不可渗性物质，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙烯醇(PVA)，羟乙基淀粉及其它一些聚合物。

在实际应用中，缓慢冷冻法经常只使用一种抗冻保护剂，如甘油或乙二醇等，而快速冷冻和玻璃化冷冻常应用多种抗冻保护剂，如甘油和丙二醇、甘油和乙二醇或者乙二醇和丙二醇，再加入葡萄糖、蔗糖或半乳糖。甘油可调节细胞脱水并保护蛋白结构，而糖类，例如海藻糖可以保持膜结构，甘油本身并不能保持细胞膜结构，而且在高浓度和高温下可以诱发膜融合，因此解冻后需尽快除去甘油。这些不同低温保护液的特性表明，他们是以不同方法来保持胚胎细胞免受冷冻损伤，有效的低温保护液应将各种低温保护剂

有机结合起来。

2、冷冻方法

自从哺乳动物胚胎冷冻保存成功以来，研究者从冷冻速度、解冻速度和操作程序等方面进行了改进，目前主要由常规冷冻法、直接冷冻法和玻璃化冷冻法。

2.1常规冷冻法

该方法是Whittingham首次成功应用在小鼠卵母细胞低温保存时建立起来的方法。随后研究者不断完善该方法，目前已被广泛采用。一般G、DMSO 和EG 等作为冷冻保护剂。在冷冻的初始阶段, 分三或四步将胚胎浸入浓度由低到高的冷冻保护剂中, 每步间隔10min, 使保护剂充分渗入胚胎细胞。有的研究者把保护剂的添加由三步或四步减为一步, 即直接将胚胎放入含最终浓度的保护剂中, 经比较这两种方法差异不显著。其冷冻程序一般为: 胚胎先以1℃/min 的速度由室温降至- 7℃, 植冰, 然后以0.1- 0.5℃/min 降温至-35℃, 平衡10min 后, 投入液氮保存。植冰使细胞外保护剂冻结, 胚胎慢慢冷却并开始脱水收缩。当温度降至-15℃时, 胚胎细胞体积收缩50% , 降至- 20℃时收缩60%。慢速冷冻使胚胎过度脱水, 必须采用缓慢解冻法使胚胎复原, 提高其存活率[4]。

2.2直接冷冻法

直接冷冻法也叫一步细管法，就是冷冻胚胎解冻后,将细管内的溶液混合静置,然后可直接移植的冷冻胚胎保存方法。1982年Niemonn 等用蔗糖二步清除防冻剂的方法,法国的Renard 等对此进行了改进,采用0.125mol/L 蔗糖液一步清除法。此后不久,Leibo 等提出了在胚胎解冻后,不需分几步洗脱防冻剂,可直接移植的一步吸管法,该法特别在现场给受体母牛移植时,操作十分简便。阳年生等对胚胎一步脱除防冻剂的冷冻方法也进行了深入的研究[5]。贺文杰等1998年应用一步解冻法对奶牛胚胎解冻取得了33.13%的移植受胎率[6]。

2.3玻璃化冷冻法

玻璃化冷冻法是将胚胎在适当的冷冻保护剂混合液中做短暂处理后,直接投入液氮。它是根据物理学原理,将高浓度的低温保护剂在超低温环境下凝固,形成无规则的玻璃化固体,这种固态物质能保持液态时的正常分子与离子分布,因而在细胞内发生玻璃化起到保护作用。Rall 和Fathy[7]首次报道了用玻璃化方法来冷冻保存小鼠胚胎。这种方法不仅大大简化了冷冻过程,而且减少了由于细胞冰晶形成所引起的一系列物理及化学损伤。此外,这种方法采用迅速通过临界温度区,从而减轻了一些动物胚胎冷冻中常见的冻伤现象。玻璃化冷冻过程中必须有至少一种渗透性冷冻保护剂(如DMS0、PG、EG、PROH等)，而且浓度要在5～8mol/L，还需要非渗透性冷冻保护剂如蔗糖等。降温速度越快越好，操作一定要迅速。目前，玻璃化冷冻方法已有好多种。如按照冷冻过程中使用工具的不同可分为细管法、微滴法、电子显微镜铜网法（electron microscopic grid,EMG)[8]、开放式拉长塑料细管法(0pen pulled straw,0PS)[9]、低温环法（Cryoloop）[10]、玻璃微细管法(glass micropipette,GMP)、微型冷冻瓶法(cryovial)[11]。

Kasai等以乙二醇为主体抗冻保护剂配制EFS40玻璃化溶液,在20℃室温下,对小鼠桑椹胚平衡2～5 min后投入液氮中冷冻保存,解冻后获得了很高的体外发育率(96%)[12]。以后用相同的方法对ICR小鼠各阶段胚胎冷冻保存,其中囊胚的保存效果欠佳(发育率为57%)[13],继而Zhu等改室温为25℃,经预处理即二步法冷冻保存的囊胚发育率高达95% ,移植产仔率也达到58%[14]。朱士恩等1999年采用液氮气熏蒸法玻璃化冷冻小鼠扩张囊胚,胚胎解冻后透明带损伤率为0% ,胚胎发育率近100%,囊胚孵化率80%,从而解决了玻璃化冷冻解冻过程中因急速降温和升温使胚胎遭受物理性损伤,导致透明带破裂而死亡这一关键性问题[15]。

和常规冷冻方法相比，玻璃化法具有快速、经济的特点，而且不需要仪器和电源，可以在野外操作，但操作过程必须快速、熟练，否则玻璃化液会对卵母细胞产生巨大毒性和渗透性损伤。另外，除细管法以外的其它方法都使冷冻液和液氮直接接触，可能会造成对胚胎的污染。

3、胚胎解冻及脱除保护剂

3.1解冻

胚胎解冻方法有快速解冻和缓慢解冻。快速解冻时,预先准备30～35℃温水, 将冷冻胚胎投入其中,轻摇1min后取出, 即完成解冻。实验证明,冷冻胚胎的快速解冻优于缓慢解冻。余文莉等报道将牛胚胎经常规冷冻后移入1mol/L 蔗糖PBS解冻液,较15%蔗糖PBS 溶液和12%蔗糖+5%甘油PBS溶液解冻效果好[16]。Dall.WF指出,胚胎从液氮中取出后在空气中稍作停留,待温度缓慢回升到一定程度再进入温水可降低热应激效应[17]。

3.2脱除保护剂

胚胎在解冻过程中脱除保护剂是必要的。一方面是因为保护剂对胚胎有一定的毒性；另一方面,把含有较高浓度保护剂的胚胎移植到受体的生殖道或移入等渗培养液中,由于细胞内外存在较高的渗透压差,大量水分子进入细胞而使其膨胀或崩解。目前多采用蔗糖液法脱除保护剂使胚胎复水。即在胚胎解冻后, 室温(25～26℃)下放入用血清PBS 配制成的0.2～0.5M蔗糖液中,保持5～10min,于显微镜下观察, 当胚胎扩张至接近冻前状态时, 即认为保护剂已脱除。

4、家畜胚胎超低温保存研究现状

家畜胚胎冷冻以牛胚胎最为成功，牛的胚胎冷冻保存已是一种较成熟的常规技术，采用常规冷冻法、直接冷冻法和玻璃化冷冻法，均可成功。牛胚胎冷冻已广泛应用于商业性胚胎移植工作。山羊用常规冷冻法、直接冷冻法和玻璃化冷冻法也已成功，其中以OPS玻璃化冷冻法效果最好，国内OPS法冷冻保存的波尔山羊胚胎解冻后的妊娠率达61.5%，移植后产羔率为40.0%[18]。

然而，上述方法对猪的胚胎冷冻保存一直未能得到理想的效果。猪胚胎常规慢速冷冻的研究主要集中在20世纪80年代末，90年代初，在这一时期冷冻保存成功的都是扩张囊胚到孵化囊胚期间的胚胎，因为其脂质含量较少，而早期胚胎由于脂质含量较高，冷冻后均不能成活[19]。1994年，Dobrinsky等[20]首次玻璃化冷冻第6、7天的猪胚胎成功，胚胎解冻后在体外的发育率分别为27%和39%。Vajta等[21]首次报道

了用OPS法冷冻体内生成的猪胚胎，获得了91%的胚胎冻后存活率和67%的孵化囊胚率。但是他没有进行冻后胚胎的移植产仔试验。2000年，Berthelot第一次进行了将猪胚胎经OPS法冷冻后生下后代的报道[22]。

猪胚胎玻璃化冷冻后的存活率与胚胎发育阶段有关，孵化囊胚冻后存活率较高，而桑椹胚和早期囊胚较低，这和胚胎中的脂质含量有关。Nagashima等[23]将猪桑椹胚和早期囊胚去除脂肪滴后用常规冷冻和玻璃化冷冻方法冷冻保存，解冻后培养48h ，胚胎发育率分别是89%和83%。经胚胎移植后，11头受体共产下27头小猪。近期美国学者采用胚胎细胞“骨架结构松弛法”+玻璃化方法，获得孵化囊胚冷冻保存成功的结果；丹麦学者采用“开口细管”法，取得早期胚胎低温冷冻并能存活的诱人结果。

目前玻璃化冷冻保存技术在家畜胚胎冷冻保存上取得了巨大成功，在不久的将来改善的玻璃化冷冻保存技术将会代替传统的慢速冷冻法，并且会给商业化胚胎生物技术提供新的途径。这对解决我国动物遗传资源急速衰减，挽救濒危品种，建立胚胎库和配子库，提供了一个广阔的前景。特别是OPS玻璃化冷冻法具有诸多优于其它冷冻方法的特点，它将很可能成为超低温冷冻保存技术的首选方法之一。

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小鼠胚胎冷冻方案

药品器材清单 PMSG 孕马血清促性腺激素 hCG 人绒毛膜促性腺激素 DPBS 杜氏磷酸缓冲液 M16 体外培养液 EG 乙二醇 蔗糖 塑料细管 1ml注射器 35mm培养皿若干 二氧化碳培养箱 小鼠胚胎的获取 控光（14h光照，10h黑暗）饲养1-2周后的4-6周龄小白雌鼠，腹腔注射10 IU/只PMSG，48h后腹腔注射10 IU/只hCG。注射hCG后（计时为0h）当晚与雄鼠（≥8周龄）合笼（雌：雄=2:1或1:1）。次日早晨检查阴道栓，见栓雌鼠于72-82h颈椎脱臼处死，采集桑椹胚。在DPBS中洗净后移入M16培养基，置于5 %CO2,95 %空气,相对湿度100 %的二氧化碳培养箱中待用。 小鼠胚胎的玻璃化冷冻 平衡液EG10，见附录溶液的配制。 玻璃化溶液EFS40 ，见附表2。或者EG40，亦见附录溶液的配制。 解冻稀释液用DPBS稀释而成的0. 5mol/L蔗糖溶液。 将室温调至25℃,经1～2小时将溶液及用具充分平衡后，用0. 25ml的塑料细管(Flance) 按顺序吸入解冻稀释液5cm———空气1㎝——1.5cm玻璃化溶液。 用吸管将胚胎移入平衡液平衡5分钟,而后导入细管内的玻璃化溶液中平衡30秒。这30秒接着吸入空气1cm——吸满解冻稀释液，封口后直接投入液氮中保存。 小鼠冷冻胚胎的解冻 将冻好保存于液氮中的细管,取出后直接投入25℃水中快速解冻。当解冻稀释液部分由乳白变为透明时取出,用吸水纸将细管水珠拭净,剪断细管两端的栓塞后,用含有解冻稀释液(0. 8ml)的注射器(带16号针头),将细管内容物冲洗于表面皿中，轻轻摇匀,置于实体显微镜下回收胚胎。回收的胚胎于解冻稀释液中平衡5分钟,以便脱出细胞内部乙二醇,再用PBS洗净后,移入M16溶液中于5 %CO2,95 %空气,相对湿度100 %的二氧化碳培养箱中培养。 小鼠胚胎的发育能力判定 体外培养回收的胚胎在M16中培养48小时以内恢复到囊胚或继续发育的胚胎视为有发育能力胚胎。 胚胎移植解冻后的胚胎,约经3小时培养,选择外形良好的胚胎移植于与结扎输精管的公鼠交配后即假妊娠第3天受体鼠的子宫中,一侧5～7枚,每只受体10～14枚胚胎为宜。妊娠19～22天观察产仔情况。

小鼠胚胎-精子冷冻保种申请表-清华大学试验动物中心

小鼠胚胎/精子冷冻保种申请表 需要填写的资料： 说明： 1.*表示必须填写； 2.保种方式的选择：我们采用精子冻存和胚胎冻存的方法进行保种；假如为杂合子，雄性数量≥3 只并且可以和B6交配做净化，我们推荐安乐死一只雄鼠使用精子冻存的方式保种，可以有效控制保种周期，不受雌鼠排卵多少的限制。 3.保种对提供小鼠的要求： 精子冻存 冷冻精子需要提供的小鼠信息：阳性纯合子雄鼠，2-3只，12-18W（最佳），生育能力良好，在实验前7d内进行过成功交配，而在3d内未交配过；冻存2只/品系，20个麦管。 费用：200元/麦管 冷冻的流程和所需的时间： 1)提前1周邮件预约申请，写明小鼠品系名称、数量、出生日期、所在位置。 2)通过申请后安排实验，精子冻存后至少1周进行复苏检测实验（1麦管）。 3)等待代孕小鼠生仔（孕期19.5天，小鼠出生后10-12天剪尾，通知取回鼠尾检测，（一周内反 馈检测结果。） 冷冻后的保存：液氮中保存 终生免费保存。 精子复苏（除复苏检测外） a、外来精子复苏 提前1周邮件预约申请，写明小鼠冻精信息（品系，数量），送达时间。

从接收之日起，1周内安排复苏实验 精子复苏采用体外受精的方式得到2-cell期胚胎，输卵管移植生仔。（孕期19.5天，小鼠出生后10-12天剪尾，通知取回鼠尾检测，一周内反馈检测结果。） 费用：IVF 500元，IVF用B6（含激素）40元/只，移植用受体单侧100元/只，双侧180元/只，试剂和人工费100元。 如需其他品系雌鼠，需从外单位订购。 b、动物中心精子复苏 提前1周邮件预约申请，写明复苏品系。 精子复苏采用体外受精的方式得到2-cell期胚胎，输卵管移植生仔。（孕期19.5天，小鼠出生后10-12天剪尾，通知取回鼠尾检测，一周内反馈检测结果。） 费用：IVF 500元，IVF用B6（含激素）40元/只，移植用受体单侧100元/只，双侧180元/只，试剂和人工费100元。 注意事项： 1. 运输过程中：请使用专业运输工具（航空罐）进行运输，运输过程中请避免磕碰，注意液氮充足。 2. 由于各家单位使用冷冻精子的方法和试剂并不相同，请一定提供冷冻和复苏的protocol作为参考，且不保证100%复苏成功。截止2015年9月，我们复苏精子平均成功率是40%。 胚胎冻存 品系内冻存需要提供的小鼠信息：雄鼠2-3只12-18W,雌鼠至少10只，3-4W或9-12W。正常情况下可冻存200枚胚胎左右。 费用3000元/品系。 与B6冻存：雄性小鼠，2-3只12-18W，中心提供雌性B6小鼠3-4W，30只。正常情况下可冻存500-600枚胚胎左右。 费用3000元/品系+B6费用40元/只。 c．冷冻流程和所需时间 提前1周邮件预约申请，写明小鼠品系名称、数量、出生日期、所在位置。 通过申请后一周左右安排实验，胚胎冻存采用体外受精的方式得到2-cell期胚胎，玻璃化冻存。胚胎冻存后至少1周进行复苏检测实验（1个冻存管，30 -50枚胚胎/管） 复苏回收的成活2-cell，采用输卵管移植到代孕母鼠体内，19.5天生仔，1-12天剪尾通知取回检测，（一周内反馈检测结果。） 冷冻后的保存：液氮中保存 终生免费保存。 胚胎复苏（除复苏检测外） a、外来胚胎复苏 提前1周邮件预约申请，写明小鼠冻存胚胎信息（品系，数量）送达时间。 从接收之日起，1周内安排复苏实验，输卵管移植生仔。（孕期19.5天，小鼠出生后10-12天剪尾，通知取回鼠尾检测，一周内反馈检测结果。） b．动物中心胚胎复苏 提前1周邮件预约申请，写明复苏品系。 通过申请后1周左右安排复苏实验，输卵管移植生仔。（孕期19.5天，小鼠出生后10-12天剪尾，通知取回鼠尾检测，一周内反馈检测结果。） 费用：移植用受体单侧移植100元/只，双侧移植180元/只，试剂和人工费100元。 注意事项： 1.运输过程中：请使用专业运输工具（航空罐）进行运输，运输过程中请避免磕碰，注意液氮 充足。 2.由于各家单位使用冷冻精子的方法和试剂并不相同，请一定提供冷冻和复苏的protocol作 为参考，且不保证100%复苏成功。截止2015年9月，我们复苏胚胎平均成功率是60%。

哺乳动物胚胎冷冻保存综述

哺乳动物胚胎冷冻保存综述 09动物生物技术2班 200930380216 宋骥晨 摘要：哺乳动物胚胎冷冻保存效果受冷冻保护剂、冷冻方法、解冻方法等多种因素影响, 其中冷冻方法是一个关键性因素。目前胚胎冷冻方法主要有常规慢速冷冻法和玻璃化冷冻法两种。常规慢速冷冻法是指利用甘油、乙二醇等做冷冻保护剂通过缓慢降温的方式进行胚胎冷冻; 玻璃化冷冻法是指利用高浓度的冷冻保护剂通过快速降温的方式进行胚胎冷冻。与常规慢速冷冻法相比, 玻璃化冷冻法简化了操作过程, 大大缩短了操作时间, 不需昂贵的程序控制冷冻仪。 关键词：胚胎; 冷冻保存; 冷冻保护剂; 冷冻; 解冻 胚胎冷冻保存是采取特殊的保护措施和降温程序使胚胎在 -196℃温度下停止代谢活动, 而升温后又不失去代谢能力的一种长期保存技术, 是实现动物胚胎生产技术实用化和商业化的重要保证。1972年, whittingham等首先发明了慢速冷冻法, 成功地保存了小鼠胚胎, 并在解冻后移植产下了后代。这种方法经过30多年的发展, 冷冻效果已基本稳定, 迄今为止, 已有多种动物胚胎经常规冷冻、解冻后移植至受体得到后代。 1.胚胎冷冻保存原理 胚胎细胞是发育中的细胞, 细胞内水分含量达到80%以上, 如

果不经保护, 冷冻时细胞内部就会形成冰晶, 破坏蛋白质的结构使其发生不可逆的变化, 从而导致胚胎死亡。常规慢速冷冻法的原理是通过加入低浓度的防冻剂, 缓慢降温将胚胎内的水分在冻结前脱出, 阻止冷冻过程中形成有害冰晶而造成胚胎损伤。将胚胎放到含有渗透性防冻剂的溶液中,防冻剂使胚胎细胞内的水分能够在-10℃以上不冻结并且能替换出部分水分。随着降温的进行, 细胞外液开始形成冰晶, 细胞外液浓度变高, 由于渗透压的原理使细胞内的水分开始脱出。为了保证细胞外液冰晶形成的时间总是早于细胞内液, 大多数冷冻程序采用植冰的方式来诱发细胞外液冰晶的生长, 植冰通常在-5℃到- 7℃进行。缓慢降温使细胞内的水分有更多的时间在冻结前脱出。需要指出的是, 胚胎在冷冻过程中不可避免地要形成冰晶。关键是冰晶的大小和数量能否造成胚胎的损伤。玻璃化冷冻保存的原理是在足够低的温度下或采用高浓度的防冻剂使冷冻过程中形成玻璃样物质减少细胞内外冰晶的形成。总之, 无论采取何种冷冻方法, 胚胎冷冻保存的原理都是阻止冷冻、解冻过程中细胞内形成致死冰晶。 2.抗冻保护剂和冷冻保护液 在哺乳动物的胚胎冷冻过程中, 冰晶的形成对胚胎的损伤是致命的。-15℃~ -50℃是一个致死温度区, 在这个温度区细胞容易形成大的冰晶。加入抗冻保护剂能避免冰晶的形成。抗冻保护剂主要分为3类：（1）低分子质量可渗物质, 如甲醇、乙二醇、丙二醇、甘油等一些醇类; （2）低分子质量不可渗物质, 如葡萄

哺乳动物胚胎冷冻保存

摘要:哺乳动物胚胎冷冻保存效果受从稀释液和冷冻保护剂、冷冻前处理、冷冻剂型、冷冻速率、解冻等方面的因素。,其中冷冻方法是一个关键性因素。目前胚胎冷冻方法主要有常规慢速冷冻法和玻璃化冷冻法两种。常规慢速冷冻法是指利用甘油、乙二醇等做冷冻保护剂通过缓慢降温的方式进行胚胎冷冻;玻璃化冷冻法是指利用高浓度的冷冻保护剂通过快速降温的方式进行胚胎冷冻。与常规慢速冷冻法相比,玻璃化冷冻法简化了操作过程,大大缩短了操作时间,不需昂贵的程序控制冷冻仪。 关键词:胚胎;冷冻保存;冷冻保护剂;冷冻;解冻,玻璃化 胚胎冷冻保存[1]是指通过特殊的保护措施和降温程序,使胚胎在-196℃条件下停止代谢,而升温后又恢复代谢能力的一种技术。一般指0～-80℃的温度下保存胚胎,而超低温冷冻保存则是在极低的温度(液氮-196℃、液氦-269℃)下保存动物胚胎.处于超低温下的胚胎,其新陈代谢几乎完全暂时停止,因而可以达到长期保存的目的[2]。1972年Whittingham[3，4，5]等首次在超低温条件下成功地冷冻保存了小鼠胚胎, 解冻后移植产下后代。由于这种方法的诞生引来了很多的人的注意，此后,许多学者对哺乳动物胚胎冷冻保存进行了大量的研究,取得了大量研究成果, 牛(Wilmut & Rowson,1973)、家兔(Whittingham & Adams,1976)、大鼠(Whittingham,1975)、山羊(Bilton et al.,1976)和绵羊(Willadsen et al.,1976)等动物的胚胎超低温保存也相继取得成功. 1977年Willadsen等[6]对上述方法进行了改良,发明了快速冷冻法,将冷冻降温时间缩短了1 h.1985年Rall等[7]首次发明了玻璃化冷冻法,对小鼠8细胞胚胎冷冻保存取得成功.随后经研究者的不断改进,使这项技术日趋成熟,部分动物胚胎经玻璃化冷冻后已在生产中示范应用,有望在生产实际中得到推广，本文对哺乳动物胚胎冷冻保存技术的最新研究进展加以综述。 1冷冻保护剂的种类 抗冻保护剂(Cryoprotective agents,CAP)也就是冷冻保存剂是指可以保护细胞抵抗低温或超低温时对细胞产生的损害,如细胞结冰、脱水、溶质浓度提高和蛋白质变性及其骨架结构的损伤等的一类化合物。 1.1抗冻保护剂[8]主要包括丙三醇(glycer-ol)、二甲基亚砜(dimethylsulphoxide,DMSO)、丙二醇(propyleneglycol)、乙二醇( ethylene glycol)、乙酰胺( acetamide)、甲醇(methyl alcohol)和丁二醇(butadiene)等。又称细胞内液抗冻保护剂,这类保护剂分子量小, 能够保证细胞内水分的及时脱出,而且还能降低溶液的凝固点,这样使胚胎有更多的时间把细胞内的水分脱出,避免细胞内形成冰晶。并通过与胚胎的平衡,替换出细胞内的部分水分,这样降低细胞内形成冰晶。但是它们对胚胎有毒害作用,尤其在高浓度或高温下毒害作用更大。 各种渗透性抗冻保护剂对胚胎的保护作用机制基本是相同的,但它们的毒性和渗透性有很大差别,因此在玻璃化冷冻的胚胎存活率上效果不同。关于不同种类的抗冻保护剂的渗透性和毒性,Leibo用毒性相对较低的Gly和EG对牛胚作对比研究发现,EG对细胞的渗透性强。Kasai等用30% (v/v)浓度抗冻保护剂处理小鼠桑椹胚30 min,观察对生存率影响实验的结果表明,乙二醇的化学毒性最小,其次是丙三醇、DMSO、丙二醇,乙酰胺毒性最高。另外,对不同发育时期的胚胎来说,抗冻保护剂的毒性也不尽相同。 1. 2分子量非渗透性抗冻保护剂低分子量非渗透性冷冻保护剂是胚胎冷冻液中 的另一个关键性成分。其主要指糖类,如单糖(葡萄糖、果糖、山梨醇和甘露醇)、二糖(蔗糖、海藻糖)和多糖(棉子糖),目前应用最广泛的是蔗糖。糖类除了能通过提高渗透压来促进细胞脱水外,还能保持细胞结构的完整。同时,糖类能减少达到玻璃化所需的渗透性冷冻保护剂的浓度,这两个特性均可降低冷冻保护剂对胚胎的毒害作用。此外,糖类还可以作为渗透压缓冲

家畜胚胎超低温冷冻保存的研究进展

家畜胚胎超低温冷冻保存的研究进展 蔡元1、2，张凤鸣1、2，潘红梅1、2、，陈四清1、2 (1.重庆市畜牧科学院重庆荣昌402460 .2.重庆市养猪工程技术研究中心重庆荣昌402460) 摘要：本文对家畜胚胎冷冻保护液的成分、冷冻方法、胚胎解冻方法与冷冻保护剂的脱除及最新研究进展进行了综述。 关键词：家畜；胚胎；冷冻保存 Present Research Advance in Cryopreservation of Livestock Embryos Cai yuan1、2, Zhang fengming1 2 ,Pan hongmei1、2 ,Chengsiqing1 2 (1.Chongqing Institute of Animal Science ,Chongqing Rongchang 402460 2.Chongqing Swine engineering Research，Chongqing Rongchang 402460) Abstract： Advances on cryoprotextive solution, freezing way, thaw way and the elimination of cryoprotective solution and recent situation in livestock embryos were reviewed in this paper. Key words：Livestock；Embryo；Cryopreservation 家畜胚胎的超低温冷冻保存技术不仅为动物种质资源的保存和良种家畜的国际交流提供了简单有效的手段,而且还是胚胎移植、体外受精、转基因和克隆等胚胎生物技术不可分割的组成部分。自从1972年,英国学者Whittingham等人首次冷冻保存小鼠胚胎获得成功后[1]，到目前已经在20多种哺乳动物上获得成功，奶牛、黄牛、山羊、绵羊、马、兔和小鼠等的冷冻胚胎已得到较广泛的使用[2-3]，特别是牛和羊的胚胎冷冻保存研究进展很快，其冷冻胚胎已经走向商品化应用。目前人们对冷冻保存原理、冷冻保存的因素和冷冻方法进行了广泛的研究并取得了巨大进步。 1、抗冻保护剂和冷冻溶液 在哺乳动物的胚胎冷冻过程中，加入抗冻保护剂的目的是为了防止冰晶的形成。抗冻保护剂常可分为三类：(1)细胞内液抗冻保护剂。常用低分子量可渗性物质，例如甲醇、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(G)、二甲基亚砜(DMSO)等；(2)细胞外液抗冻保护剂。常用低分子量不可渗性物质，例如半乳糖(Galactose)、蔗糖(Sucrose)、海藻糖(Trchaose)、聚蔗糖(Ficoll)等。（3）大分子量不可渗性物质，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙烯醇(PVA)，羟乙基淀粉及其它一些聚合物。 在实际应用中，缓慢冷冻法经常只使用一种抗冻保护剂，如甘油或乙二醇等，而快速冷冻和玻璃化冷冻常应用多种抗冻保护剂，如甘油和丙二醇、甘油和乙二醇或者乙二醇和丙二醇，再加入葡萄糖、蔗糖或半乳糖。甘油可调节细胞脱水并保护蛋白结构，而糖类，例如海藻糖可以保持膜结构，甘油本身并不能保持细胞膜结构，而且在高浓度和高温下可以诱发膜融合，因此解冻后需尽快除去甘油。这些不同低温保护液的特性表明，他们是以不同方法来保持胚胎细胞免受冷冻损伤，有效的低温保护液应将各种低温保护剂

玻璃化冷冻法保存人类囊胚的临床应用

玻璃化冷冻法保存人类囊胚的临床应用 戴志俊季钢张芳芳张奕 （合肥市妇幼保健院，合肥230001，安徽） 摘要：目的：探讨玻璃化冷冻法保存人类囊胚的临床应用效果。方法：回顾性分析2011年1月～10月在我院生殖中心行玻璃化冷冻解冻囊胚患者共12个周期的结局。结果：玻璃化冷冻解冻共21枚胚胎，存活21枚（存活率100%），共解冻12个周期，均有胚胎移植，获得临床妊娠5例（妊娠率41.67%），着床率23.81%（5/21）。结论：玻璃化冷冻法是保存人类囊胚的一种有效方法。 关键词：囊胚，玻璃化，冷冻保存，人类 Clinical Application Of Vitrification For Human Blastocysts Dai Zhijun, Ji Gang , Zhang Fangfang , Zhang Yi （Hefei Maternity and Child Health Hospital,Hefei 230001,Anhui）Abstract:Objective: To examine the clinical value of vitrification for human blastocysts. Methods: Retrospective analysis of 12 patients who conduct embryos vitrification from Jua.2011 to Oct.2011. Results: All of the 21 blastocysts were thawed and survived , survival rate was 100%(21/21);5 cycles of 12 cycles got clinical pregnancy after transferred, clinical pregnancy rate were 41.67% ,implantion rate were 作者单位：合肥市妇幼保健院 安徽医科大学妇幼保健临床学院安徽230001

胚胎冷冻保存技术

胚胎冷冻保存技术 摘要; 胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。研究和优化胚胎冷冻保存技术对胚胎工程的发展有重要的意义。 关键词：胚胎冷冻保存 为便于长途运输和随时供移植使用，将那些６～７日龄已有２０～３０个细胞的新鲜活胚胎（或分割后的半胚胎、１／４胎）在－１９６℃的超低温下冷冻贮存就是胚胎冷冻保存技术。这是在冷冻精子的技术基础上进一步发展起来的一项新技术。目前用冷冻胚胎移植的成功率约为鲜胚胎的７０％～８０％，胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。 现有的胚胎冷冻保存方法有四种： 一、常规冷冻法 常规冷冻法：也叫慢速冷冻法、逐步降温法。将采集到的胚胎用培养液洗涤后置入有不同冷冻保护剂(甘油或二甲亚枫(DMSO)等)浓度的三种冷冻液中(冷冻液浓度由低到高，最终浓度1．4M)，每种冷冻液中平衡5分钟，然后将胚胎和冷冻液装入细管中封口、标记，放入冷冻仪中进行冷冻。冷冻速率先以1～3~C／分下降至-6～-7℃，在此温度诱发结晶，平衡10分钟，然后，以0．3℃／分的速率降温至-35～_38℃，之后投入液氮中保存。胚胎解冻后，需按胚胎进入冷冻液时的相反浓度，即从高到低浓度脱除冷冻保护剂，每步5分钟，最后置入含20％血清的PBS保护液中洗涤3次，彻底脱除冷冻保护剂。或者将解冻后的胚胎放入0．5M(或1．0M)的蔗糖溶液中平衡10分钟，再用上述PBS液洗涤3次。 二、一步冷冻法 一步冷冻法：也叫一步细管法。该方法是由慢速冷冻法改进而来，细管内的冷冻液和蔗糖液是分开的，因此，在细管内用蔗糖液可一步脱除甘油抗冻剂，从而利于在生产中推广应用。 三、程序冷冻法 程序冷冻法主要采用低浓度冻结保存剂梯度脱水,经程序冷冻仪缓慢降温。主要操作步骤包括:将细胞顺序放入一系列逐渐增加保存剂浓度的溶液中梯度脱水,置入程序冷冻仪快速降温至-6℃植冰(人工诱导冰晶形成),然后程序冷冻仪缓慢降温至-30℃~-80℃后液氮贮存。 程序冷冻法主要使用渗透较慢的低温保护剂，如乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(G)、二甲基亚砜(DMSO)，使冷冻保护剂充分渗透人胚胎细胞内，平衡后，利用程序降温仪缓慢降温，最后投入液氮保存。程序冷冻法采用较低浓度的冷冻保护剂，对胚胎毒性损害小，解冻后存活率较高。但因其操作繁琐，降温速度慢，致使所需时间长，需要特殊的降温装置，在不具备实验条件的场所不能使用此法进行胚胎冷冻。目前国内外均较少使用。 通常在程序化慢冷的液体中，各含有一种细胞渗透性冷冻保护剂和一种非细胞渗透性保护剂，于室温下，在低浓度的冷冻保护剂溶液中预平衡，然后放置在终浓度的冷冻液中。在冷冻仪内于预设的程序下降温标本，经过冷冻保护剂的处理后，胞内渗透压增高，意味着细胞内液冰点下降。由于细胞自身的特性，

冷冻胚胎案二审判决

江苏省无锡市中级人民法院 民事判决书 （2014）锡民终字第01235号 上诉人（原审原告）沈新南。 上诉人（原审原告）邵玉妹。 两上诉人的共同委托代理人郭小兵，江苏瑞莱律师事务所律师。 两上诉人的共同委托代理人郭伟，江苏瑞莱律师事务所律师。 被上诉人（原审被告）刘金法。 被上诉人（原审被告）胡杏仙。 原审第三人南京鼓楼医院，住所地南京市鼓楼区中山路321号。 法定代表人韩光曙，该院院长。 委托代理人王玢，该院生殖中心医生。 委托代理人郑哲兰，江苏永衡昭辉律师事务所律师。 上诉人沈新南、邵玉妹因与被上诉人刘金法、胡杏仙，原审第三人南京鼓楼医院监管权和处置权纠纷一案，不服宜兴市人民法院（2013）宜民初字第2729号民事判决，向本院提起上诉。本院于2014年7月2日受理后，依法组成合议庭审理了本案，现已审理终结。 原审法院审理查明： 沈杰与刘曦于2010年10月13日登记结婚，于2012年4月6日取得生育证明。2012年8月，沈杰与刘曦因“原发性不孕症、外院反复促排卵及人工授精失败”，要求在南京市鼓楼医院（以下简称鼓楼医院）施行体外受精-胚胎移植助孕手术；鼓楼医院在治疗过程中，获卵15枚，受精13枚，分裂13枚；取卵后72小时为预防“卵巢过度刺激综合征”，鼓楼医院未对刘曦移植新鲜胚胎，而于当天冷冻4枚受精胚胎。治疗期间，刘曦曾于2012年3月5日与鼓楼医院签订《辅助生殖染色体诊断知情同意书》，刘曦在该同意书中明确对染色体检查及相关事项已经了解清楚，同意进行该检查；愿意承担因该检查可能带来的各种风险；所取样本如有剩余，同意由诊断中心按国家相关法律、法规的要求代为处理等。2012年9月3日，沈杰、刘曦与鼓楼医院签订《配子、胚胎去向知情同意书》，上载明两人在鼓楼医院生殖医学中心实施了试管手术，获卵15枚，移植0枚，冷冻4枚，继续观察6枚胚胎；对于剩余配子(卵子、精子)、胚胎，两人选择同意丢

小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养

小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养 一、实验材料 1.主要仪器设备 (1)倒置显微镜（Olympus，Japan） (2)CO2培养箱（BB16HF，上海力申科学仪器有限公司） (3)100ml的玻璃培养瓶（江苏海门市大路塑料实验仪器厂） (4)6孔培养板（COSTAR，每孔直径为3.5cm） (5)Eppendroff管 (6)1ml,2ml,5ml的玻璃滴管各30支；10ml尖底离心管和直径为8cm的平皿 (7)离心机 (8)5ml冻存管 (9)两套小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊） 2.主要试剂配制 (1)MEF(mouse embryo fibroblast，小鼠胚胎成纤维细胞)培养液 ——低糖DMEM母液 1)用一个1000ml的大烧杯加入1000ml无菌无内毒素的超纯水（购自福州新北生化工业有限公 司）； 2)将一小袋低糖DMEM(GIBCO/BRL,Cat.No.31600-034)全部加入上述水中，同时轻轻搅拌，并 冲洗包装袋的内面以洗下所有的粉未。 3)每升培养基中添加3.7gNaHCO3。 4)搅拌直至完全溶解。 5)用1NHCl或1NNaOH调培养基的pH至比最终的工作液的PH低0.2-0.3，调好PH后，将容 器密封（在该实验中用1NHCl调PH至7.3）。 6)立即用0.22um的滤器过滤除菌，装入高压过的盐水瓶中, 4℃保存(1个月内用完)。 ——MEF培养液 取100ml上述配好的低糖DMEM液体，加入10000IU青霉素钠（6.25mg）和10mg链霉素，溶解后再次调节PH至7.3，经0.22um的滤器过滤至高压过的血清瓶中，再添加10ml分装好的 新生牛血清（Newborn Calf Serum, GIBCO/BRL,需56℃，30min灭活过），4℃保存至使用。 (2)PBS 在500ml超纯水中依次溶入 NaCl 4.0g KCl 0.1g Na2HPO4.12HO2 1.445g KH2PO40.1g 于121℃高压灭菌30min或经0.22um的滤器过滤除菌再分装入100ml洁净灭菌的盐水瓶中，再放入4℃冰箱中保存备用。 (3)0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合消化液 在100ml超纯水中分别溶解 胰蛋白酶干粉(Trypsin, Sigma,T4799) 0.25g EDTA 0.02g

小鼠胚胎成纤维细胞制备

小鼠胚胎成纤维细胞制备 一．取得小鼠胚胎 1.性成熟母小鼠与种公鼠按1公（♂）:2母（♀）比例合笼。 2.每天早上观察母小鼠阴道口。有乳白色或蛋黄色冻胶状物(阴道栓)即确定 为怀孕。见栓当天上午定为怀孕的0.5d。 3.取怀孕12.5～1 4.5d母鼠,断颈处死，无菌条件下暴露子宫。 4.用镊子提起近子宫颈端,分离子宫系膜,剪断子宫角。 5.取出整个子宫,置于有PBS的平皿内。用PBS洗涤三次,弃除表面残余血 迹。 6.沿子宫系膜侧剪开子宫,取出带有胎膜的胚胎,置于另一盛有PBS的平皿 内,充分洗涤,弃除表面红细胞。 7.用小镊子撕破胎膜,取出胎鼠,弃除胎膜,用PBS洗涤三次。 8.去除胚胎头部、内脏和四肢，将躯干部置于另一盛有PBS的平皿内,用PBS 至少洗涤三次,充分弃除红细胞。 二．取得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） 1.用无菌眼科小剪刀或刮胡刀片将鼠胚躯干剪(切)成1mm3以下的碎块, 吸 置于离心管内。 2.加适量胰酶，将离心管置于培养箱中10-20分钟 3.取出离心管，反复吹打，加足量培养液终止消化 4.离心1000转，5分钟 5.弃掉上清，加适量培养液，反复吹打20次 6.分装到T75中，一般每2个胚胎可以制成一个T75的原代细胞 7.置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养 8.待细胞长3-7天细胞互相重叠爬满整个培养瓶底时即可1：3-1：6传代 9.吸弃培养液上清 10.PBS（不含钙镁）冲洗两次 11.加0.25%胰酶-0.02EDT消化

12.在显微镜下观察，当少量细胞漂浮，贴壁的细胞层出现裂隙时，用移液 管吹打冲洗瓶底5-6次 13.即刻加MEF培养液终止消化 14.1000转，5分钟离心。吸弃上清 15.加足培养液，吹打制成单细胞悬液，分装到各T75中。完成传代 16.原代细胞中还有少量组织块未被充分消化，在以后的每次传代过程中要 尽量制成单细胞悬液，组织块会逐渐消失 17.原代细胞中混有一些杂细胞，一般传到第3代时,杂细胞逐渐减少。小鼠 胚胎成纤维细胞为梭状；但连成片时,细胞互相交联，形态不典型。 三．MEF的冻存 1.当细胞90%-100% 融合时,尤其细胞少量堆聚可冷冻。 2.处理方法同二的9－14，每75 cm2的细胞加3ml 冻存液重悬细胞。 3.每个冻存管编号加1ml细胞悬液。 4.置入程序降温盒-800C过夜，放入液氮长期保存。 四．灭活MEF制备饲养层细胞 1.取新的培养瓶，加0.1％Gelatin溶液覆盖预处理30分钟，用前吸掉Gelatin 溶液。 2.取需要处理的MEF细胞，以10ug/ml浓度加丝裂霉素（Mitomycin C）混 匀。 3.置培养箱中3小时。 4.吸弃废液。 5.用DPBS洗5遍。 6.处理方法同二11－14。 7.处理过的MEF加适量培养液重悬计数，以3.0×104/ cm2（MEF）铺在Gelatin 处理过的培养瓶上 8.置培养箱中静置过夜，使其贴壁 9.铺好的饲养层在1-7天内有效，都可以支持mES生长并维持其全能性

首例冷冻胚胎继承案民事判决书

首例冷冻胚胎继承案民 事判决书 Revised as of 23 November 2020

我国首例冷冻胚胎继承案民事判决书江苏省无锡市中级人民法院民事判决书（2014）锡民终字第01235号上诉人（原审原告）沈新南。上诉人（原审原告）邵玉妹。两上诉人的共同委托代理人郭小兵，江苏瑞莱律师事务所律师。两上诉人的共同委托代理人郭伟，江苏瑞莱律师事务所律师。被上诉人（原审被告）刘金法。被上诉人（原审被告）胡杏仙。原审第三人南京鼓楼医院，住所地南京市鼓楼区中山路321号。法定代表人韩光曙，该院院长。委托代理人王玢，该院生殖中心医生。委托代理人郑哲兰，江苏永衡昭辉律师事务所律师。上诉人沈新南、邵玉妹因与被上诉人刘金法、胡杏仙，原审第三人南京鼓楼医院监管权和处置权纠纷一案，不服宜兴市人民法院（2013）宜民初字第2729号民事判决，向本院提起上诉。本院于2014年7月2日受理后，依法组成合议庭审理了本案，现已审理终结。原审法院审理查明：沈杰与刘曦于2010年10月13日登记结婚，于2012年4月6日取得生育证明。2012年8月，沈杰与刘曦因“原发性不孕症、外院反复促排卵及人工授精失败”，要求在南京市鼓楼医院（以下简称鼓楼医院）施行体外受精-胚胎移植助孕手术；鼓楼医院在治疗过程中，获卵15枚，受精13枚，分裂13枚；取卵后72小时为预防“卵巢过度刺激综合征”，鼓楼医院未对刘曦移植新鲜胚胎，而于当天冷冻4枚受精胚胎。治疗期间，刘曦曾于2012年3月5日与鼓楼医院签订《辅助生殖染色体诊断知情同意书》，刘曦在该同意书中明确对染色体检查及相关事项已经了解清楚，同意进行该检查；愿意承担因该检查可能带来的各种风险；所取样本如有剩余，同意由诊断中心按国家相关法律、法规的要求代为处理等。2012年9月3日，沈杰、刘曦与鼓楼医院签订《配子、胚胎去向知情同意书》，上载明两人在鼓楼医院生殖医学中心实施了试管手术，获卵15枚，移植0枚，冷冻4枚，继续观察6枚胚胎；对于剩余配子(卵子、精子)、胚胎，两人选择同意丢弃；对于继续观察的胚胎，如果发展成囊胚，两人选择同意囊胚冷冻。同日，沈杰、刘曦与鼓楼医院签订《胚胎和囊胚冷冻、解冻及移植知情同意书》，鼓楼医院在该同意书中明确，胚胎不能无限期保存，目前该中心冷冻保存期限为一年，首次费用为三个月，如需继续冷冻，需补交费用，逾期不予保存；如果超过保存期，沈杰、刘曦选择同意将胚胎丢弃。2013年3月20日23时20分许，沈杰驾驶苏B5U858车途中在道路左侧侧翻，撞到路边树木，造成刘曦当日死亡，沈杰于同年3月25日死亡的后果。现沈杰、刘