常用的分子生物学基本技术

常用的分子生物学内容和相关技术

常用的分子生物学内容和相关技术 一、分子克隆（分子操作） 大肠杆菌中1．原核表达系统（PET28a，PET30a 等） 融合蛋白抗原免疫动物 原核表达系统蛋白转导系统（TAT） 大肠杆菌中

2．真核表达系统（pcDNA3）：用于transfection（基因转染） 在培养的动物细胞中 分子克隆的方法： ●选择合适的表达载体 ●选择酶切位点，设计PCR引物并合成 ●制备待克隆的靶基因

?PCR（来源培养细胞或组织、植物的mRNA cDNA） ?RT-PCR ?质粒中已克隆的目的片段 ?人工合成cDNA片段 退火后形成双链 二、细胞培养 ?动物细胞 ?植物细胞 ?原代细胞培养 ?传代细胞培养 三、探讨功能： 与细胞生长、增殖、凋亡的关系，检测mRNA、蛋白质的表达变化及意义 ?内源基因：或使内源基因表达抑制（RNAi, down-regulation）或缺失、突变 ?外源基因：通过transfection（基因转染）、电转移、显微微注射等方法将外源基因导入培养的细胞中过 表达（overexpression），在mRNA、蛋白质水平上 表达上调（up-regulation） ?信号传导：protein-protein interaction

◆Two hybrid system ◆Western blot ◆免疫荧光双标记图像分析 ?细胞:BrdU,Flow Cytometry（cell cycle，apoptosis） ?动物：成瘤 四、检测表达 ?DNA:Reporter gene(promoter activity),Hybridization （DNA-Southern blot，RNA-Northern blot，tissues or cells-in situ） ?RNA:RT-PCR，Real-time PCR,microRNA Gene chips:cDNA,microRNAs ?Proteins （tissues or cells-Western blot or immunohistochemistry，serum or conditional medium–ELISA）

分子生物学常用技术 习题

第五章常用分子生物学技术的原理及其应用习题（引自网络精品课程） 一、选择题 （一）A型题 1 ．分子杂交实验不能用于 A ．单链 DNA 与 RNA 分子之间的杂交 B ．双链 DNA 与 RNA 分子之间的杂交 C ．单链 RNA 分子之间的杂交 D ．单链 DNA 分子之间的杂交 E ．抗原与抗体分子之间的杂交 2 ．关于探针叙述错误的是 A ．带有特殊标记 B ．具有特定序列 C ．必须是双链的核酸片段 D ．可以是基因组 DNA 片段 E ．可以是抗体 3 ．下列哪种物质不能用作探针 A ． DNA 片段 B ． cDNA C ．蛋白质 D ．氨基酸 E ． RNA 片段 4 ．印迹技术可以分为 A ． DNA 印迹 B ． RNA 印迹 C ．蛋白质印迹 D ．斑点印迹 E ．以上都对 5 ． PCR 实验延伸温度一般是 A ．90 ℃ B ．72 ℃ C ．80 ℃ D ．95 ℃ E ．60 ℃ 6 ． Western blot 中的探针是 A ． RNA B ．单链 DNA C ． cDNA D ．抗体 E ．双链 DNA 7 ． Northern blotting 与 Southern blotting 不同的是 A ．基本原理不同 B ．无需进行限制性内切酶消化 C ．探针必须是 RNA D ．探针必须是 DNA E ．靠毛细作用进行转移 8 ．可以不经电泳分离而直接点样在 NC 膜上进行杂交分析的是 A ．斑点印迹 B ．原位杂交 C ． RNA 印迹 D ． DNA 芯片技术 E ． DNA 印迹 9 ．下列哪种物质在 PCR 反应中不能作为模板 A ． RNA B ．单链 DNA C ． cDNA D ．蛋白质 E ．双链 DNA 10 ． RT-PCR 中不涉及的是 A ．探针 B ． cDNA C ．逆转录酶 D ． RNA E ． dNTP 11 ．关于 PCR 的基本成分叙述错误的是 A ．特异性引物 B ．耐热性 DNA 聚合酶 C ． dNTP D ．含有 Zn 2+ 的缓冲液 E ．模板 12 ． DNA 链末端合成终止法不需要 A ． ddNTP B ． dNTP C ．引物标记 D ． DNA 聚合酶 E ．模板 13 ． cDNA 文库构建不需要 A ．提取 mRNA B ．限制性内切酶裂解 mRNA C ．逆转录合成 cDNA D ．将 cDNA 克隆入质粒或噬菌体 E ．重组载体转化宿主细胞 14 ．标签蛋白沉淀是 A ．研究蛋白质相互作用的技术 B ．基于亲和色谱原理 C ．常用标签是 GST D ．也可以是 6 组氨酸标签 E ．以上都对 15 ．研究蛋白质与 DNA 在染色质环境下相互作用的技术是 A ．标签蛋白沉淀 B ．酵母双杂交 C ．凝胶迁移变动实验 D ．染色质免疫沉淀法 E ．噬菌体显示筛选系统 16 ．动物整体克隆技术又称为

分子生物学常用技术考试题目及答案

1．P C R反应过程中，引物粘合所需温度一般是A．72℃ B．85℃ C．75℃ D．65℃ E．55℃ 2．PCR反应过程中，引物延伸所需温度一般是 A．95℃ B．82℃ C．72℃ D．62℃ E．55℃ 3．PCR反应体系不包括 A．模板DNA B．Taq DNA聚合酶C．特异性引物A、B D．ddNTP E．含Mg2+的缓冲液 4．PCR的循环次数一般为 A．5～10次B．10～15次C．15～20次D．20～25次E．25～30次 5．PCR反应体系与双脱氧末端终止法测序体系不同的是缺少 A．模板B．引物C．DNA聚合酶D．ddNTP E．缓冲液 6．Sanger法测序不需要 A．Klenow小片段B．引物C．dNTP D．标记dNTP E．ddNTP 7．Sanger法测序的基本步骤不包括 A．标记模板B．模板-引物杂交C．引物的延长与合成阻断 D．电泳E．放射自显影直读图 8．Sanger法测序的四个反应体系中应分别加入不同的 A．模板B．引物C．标记dNTP D．DNA聚合酶E．ddNTP 9．人类基因组计划的主要研究内容不包括 A．遗传图分析B．物理图分析C．转录图分析 D．序列图分析E．蛋白质功能分析 10．1996年，英国科学家克隆的Dolly羊所采用的技术是 A．转基因技术B．核转移技术C．基因剔除技术

D．肽核酸技术E．反义核酸技术 11．Maxam-Gilbert法与Sanger法测序的共同点是均需 A．引物B．Klenow大片段C．ddNTP D．化学裂解试剂E．电泳后放射自显影读图 12．Sanger法测序所得直读图像中，由终点至始点所读序列为 A．待测DNA5ˊ→3ˊ的碱基序列B．待测DNA3ˊ→5ˊ的碱基序列 C．待测DNA互补链3ˊ→5ˊ的碱基序列D．待测DNA互补链5ˊ→3ˊ的碱基序列E．引物5ˊ→3ˊ的碱基序列 13．PCR实验的特异性主要取决于 A．DNA聚合酶的种类B．反应体系中模板DNA的量 C．引物序列的结构和长度D．四种dNTP的浓度E．循环周期的次数14．基因剔除（knock out）的方法主要被用来研究 A．基因的结构B．基因的功能C．基因的表达 D．基因的调控E．基因的突变 15．反义核酸作用主要是 A．封闭DNA B．封闭RNA C．降解DNA D．降解DNA E．封闭核糖体的功能 16．有关Sanger法测序的叙述，不正确的是 A．只需标记一种dNTP B．一般应去除DNA聚合酶I 的5ˊ→3ˊ外切酶活性C．与dNTP相比阻断剂应尽可能的多D．反应时间不必太长 E．应采用超薄高压电泳 17．经电泳后将DNA转移至NC膜上的技术是 A．Southern blotting B．Northern blotting C．Western blotting D．Eastern blotting E．in situ hybridization

常用的分子生物学基本技术

常用的分子生物学基本技术 核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。 固相杂交 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交（dot hybridization） 是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交（blotting hybridization） Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析（RELP）等。 Northern印迹杂交:由Southerm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，进行杂交反应，以鉴定基中特定mRNA分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法，可推臬出癌基因的表达程度。 差异杂交（differential hybridization） 是将基因组文库的重组噬菌体DNA转移至硝酸纤维素膜上，用两种混合的不同cDNA探针（如：转移性和非转移性癌组织的mRNA逆转录后的cDNA）分别与滤膜上的DNA杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。适用于基因组不太复杂的真核生物（如酵母）表达基因的比较，假阳性率较低。但对基因组非常复杂的盐酸核生物（如人），则因工作量太大，表达的序列所占百分比较低（仅5％左右），价值不大。

常用的分子生物学基本技术

常用的分子生物学基本技术?核酸分子杂交技术 ?由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性,它已成为分子生物学中最常用的基本技术,被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（ｐrｏbe),待测核酸序列可以是克隆的基因征段,也可以是未克隆化的基因组DＮA和细胞总RNＡ。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的,能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或ＲNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。? 固相杂交 ?固相杂交（soｌｉd－phase ｈｙbｒｉdizatｉon)是将变性的DNＡ固定于固体基质(硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上,再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。? 斑步杂交(dot hyｂrｉｄizａtｉoｎ）??是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或ＲNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单,事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品,可在同一张膜上同时进行多个样品的检测;根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量,而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交(blｏttｉng hybridizatioｎ） ?Southｅrn印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的ＤNA片段，将凝胶上的DＮA变性并在原位将单链ＤNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上,经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色,检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析(ＲELP)等。 ?Ｎortｈeｒn印迹杂交:由Southeｒm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后,转移到固相支持物上，进行杂交反应,以鉴定基中特定mRＮＡ分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法,可推臬出癌基因的表达程度。? 差异杂交(differential hybridｉzatｉon) ?是将基因组文库的重组噬菌体DNA转移至硝酸纤维素膜上,用两种混合的不同ｃDNA探针(如:转移性和非转移性癌组织的mRNＡ逆转录后的ｃDNA)分别与滤膜上的DNA杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。适用于基因组不太复杂的真核生物（如酵母）表达基因的比较，假阳性率较低。但对基因组非常复杂的盐酸核生物(如人),则因工作量太大,表达的序列所占百分比较低（仅5％左右),价值不大。 ?cDＮA微点隈杂交（cDＮＡmiｃroａｒray hybriｄizａtion）? 是指将cDNA克隆或cDNA的ＰCR产物以高度的列阵形式排布并结合于固相支持物上(如:尼龙膜或活化的载玻片)以微点阵,然后用混合的不同DNＡ探针与微点阵上的DNA进行杂交。再利用荧光、化学发光、共聚焦显微镜等技术扫描微点阵上的杂交信息。它比差异杂交技术的效率高、速度快、成本低，适用于大规模的分析。已成商品问世。其缺点是无法克服保守的同源序列及重序对杂交信息的干扰。??寡核苷酸微点隈杂交(oligonucleotｉｄｅmicｒoarraｙhybridizatiｏn)? 是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸,使它共价结合于支持物表面，与平均长度为20-50nt的混合RNA或cDNA探针进行杂交，以提高杂交的特异性和灵敏度。应用共聚焦显微镜可检测跨越三个数量级的杂交信息。适用于低丰度mRNA的检测,以区分基因家族不同成员的差异表达特征，或鉴定同一转录在不同组织和细胞中的选择性剪接。但有工作量较大、

分子生物学常用实验技术

分子生物学常用实验技术 第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定 第二章 DNA酶切及凝胶电泳 第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 第四章 RNA的提取和cDNA合成 第五章重组质粒的连接、转化及筛选 第六章基因组DNA的提取 第七章 RFLP和RAPD技术 第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆 第九章分子杂交技术 第十章测序技术 第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定 第一节概述 把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。 质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。 利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。 质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。 质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检