LEA蛋白的同源性及其应用潜力

湖南林业科技 2010年第37卷第2期

研究报告

收稿日期:2010 03 19修订日期:2010 03 25

LE A 蛋白的同源性及其应用潜力

裴 培

(北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083)

摘 要:LEA 蛋白(晚期胚胎丰富的蛋白质)是一种植物在干旱条件诱导下产生的蛋白[1]。本文使用软件绘制出它的结构图,并对可以产生LEA 蛋白的多种不同植物的基因序列进行了比对,从而找到猜想的保守序列。通过分析一未知的序列和在拟南芥中可以产生LEA 蛋白的基因序列的同源性,从而得出关于二者序列和功能之间的关系的结论。同时,根据多种近似物种LEA 蛋白的保守性和同源性,分析得到其系统进化树。植物LEA 蛋白的研究有助于对植物抗旱性的认识,并为调整种植布局提供参考。关键词:保守序列;LE A 蛋白;系统发生树

中图分类号:Q 943 文献标识码:A 文章编号:1003 5710(2010)02 0020 04

LEA protein hom ol ogy and its application potenti ality

PE I Pe i

(College of B i olog ical Sc i ences and B i otec hno l ogy ,Beiji ng Forestr y U ni versity ,Beiji ng 100083,China)

Abstrac t :LEA pro tein (L ate e m bryogenic abundant pro te i n)i s a k i nd of i nduced prote i n by plants under drough t stress [1].Th is pa per used so ft wa re to m ap out its struct ure d i ag ram and analyzed different plantsw hich can produce LEA prote i n w it h mRNA sequence a

li gn m ent to fi nd con j ec t ured conserved sequences .By ana l y si s o f the homo logy o f the sequences i n some unknown sequences and the o ri g i na l LEA pro te i n i n A rab i dop sis t haliana ,so m e conc l usi ons on t he re l a ti onsh i p be t w een sequence and f unction o f them w ere ob ta i ned .T he phy l ogenetic tree o f LEA prote i ns was a lso obta i ned based on the i r conse rvative property and hom ology .The research result on LEA pro te i n w ou l d benefit t o a w areness on plant drought resistance ,and be a reference f o r ad j usti ng planti ng layout .K ey word s :conserv ati ve sequence ;LEA pro tein ;phylogenetic tree

近年来,由于全球变暖,干旱性自然灾害频繁发生,对植物生长造成了巨大的影响。在植物抗旱性方面进行研究与应用,可调整植物适应性布局,增加土地收入。高等植物在复杂多变的环境生长过程中,阵发性和短暂性干旱经常发生,细胞水分亏缺引起的生

理干旱,影响着植物的正常生长发育[2]

。提高植物对水分亏缺的耐性是一项复杂工程。一般认为,伴随种子成熟过程而形成的LEA (Late e mbryogeni c abundant pr ote i n)蛋白(主要为脱水素)的生理功能与种子耐脱水性形成有关,缺乏这类蛋白使种子对脱水敏感。

具有高度保守的氨基酸序列是LEA 蛋白的一大特征[3]

。植物赖以生存的环境并不总是适宜的,干旱缺水、炎热、霜冻、盐碱、矿质元素过多过少等都会制约植物生长、降低产量。为了适应各种胁迫,植物在长期的进化过程中发展了各种不同的生理生化机制,以抵抗、

适应各种环境胁迫低分子量渗透物质的积累,如糖醇、甘氨酰甜菜碱等,被认为是增强植物对渗透胁迫适应和耐受的主要机制[4-5]

。近年来的研究表明.环境胁迫除了引起代谢变化和低分子保护性化合物的积累外,植物的许多其它基因可被激活,并导致植物营养组织

中新蛋白的积累[6]

。近年来,植物干旱诱导蛋白的研究已受到普遍关注,其中LEA 蛋白是胚胎发生后期种子中大量积累的一系列蛋白质,它广泛存在于高等植物中,且受发育阶段、脱落酸(ABA )和脱水信号的调节,因此成为当前在逆境研究方面的一个热点。

1 LEA 蛋白的抗旱性质

1981年,D ure 等在胚胎发育后期的棉花子叶中分离到一组丰富的mRNA ,命名为L ea mRNA ,即为LEA

蛋白[7-8]

。胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA )是种子发育后期产生的一类小分子,它是伴随着种子成熟过程而产生的。LEA 蛋白有较高亲水性,不仅有序列特异性,空间结构也有特点。在水分缺乏时,此种蛋白在

研究报告

细胞中有增强束缚水的作用[9-10]。Baker等研究证明:缺水条件下,D13和D11LEA蛋白能溶解!在细胞质的结构中,它们的结构中未卷曲部分,能形成适应其它结构的形状;在一般生理条件下,70%以上肽链处于无规则卷曲状态,植物缺水时,这些特殊结构有束缚水分子的作用。

LEA蛋白的抗旱性也可能与它的蛋白质序列和基因序列相关。D29LEA蛋白含有11个氨基酸[11],即T /A,A/T,Q/E,A/T,A/T,K/R,Q/ED,K/ R,A/T,X,ED/Q,这些氨基酸序列能形成盐桥[12-13],可以丰富蛋白质结构,提高细胞液的离子强度,从而抵御或减轻干旱造成的危害[14-15]。

2 材料与方法

2 1 材料

NCB I网站,PDB,晶体结构,DNA MAN,BI OED I T,G e ne D oc,R as M ol2 71,End N ote X(10 0), LEA蛋白在P DB网站上的图片,LEA蛋白序列。

2 2 方法

(1)在NCBI网站上搜索多条不同植物上的可编码LEA蛋白的基因序列并下载LEA蛋白的图片。

(2)使用DNA MAN软件比较所下载编号为1至8号的序列(即花生、芥菜、温州蜜柑、油棕、苜蓿蒺藜、水稻、松、小麦)相似性。

(3)选择最相似序列,再次用DNA M AN比较相似性。

(4)推测保守序列并且在网站上用BLAST软件搜索,比对相关结果。

(5)搜索具有更高分值或低e值的序列并下载该序列。

(6)将该未知序列与拟南芥中可编码LEA蛋白的序列进行各方面比对。

3 结果与分析

3 1 LEA蛋白的空间结构图及相关分析

LEA蛋白共同的结构特征是由氨基酸组成,形成高度亲水性的多肽。大多数LEA蛋白缺乏半胱氨酸和酪氨酸残基,

但富含赖氨酸和甘氨酸。

图1 从NCB I网站上获得的LEA蛋白空间结构图[16]由图1可见:该蛋白质包含A(红)、B(黄)、C (灰)3种肽链,它们之间的角度为90?。该蛋白质由6个 螺旋和6个 转角构成。且A、B、C3种肽链长度均为141个氨基酸,分子量均为15553 23道尔顿。

3 2 与LEA蛋白有关的同源性分析

3 2 1 花生、芥菜、温州蜜柑、油棕、苜蓿蒺藜、水稻、松、小麦8种植物与拟芥南的基因序列比较 用DNA MAN比较1号到8号不同种类的均能编码LEA蛋白的植物的基因序列,见表1。即对花生、芥菜、温州蜜柑、油棕、苜蓿蒺藜、水稻、松和小麦的mRNA序列进行比对,得到其同一性是60 3%。由上述植物绘制的系统进化树看出,芥菜和苜蓿蒺藜差距很小,而芥菜、苜蓿蒺藜、油棕和拟南芥中编码LEA蛋白的序

表1 下载的所有序列

编号植物名称拉丁名基因名称

1花生Arach is hypoga e a蛋白3基因,完整序列

2芥菜B rassi ca juncea胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA1a)mRNA的完整序列3温州蜜柑C itru s un shiu5组胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA5)mRNA的完整序列4油棕E l ae is gu i n ee n sis EM Z08基因,完整序列

5苜蓿蒺藜M e d icag o truncatula Em6基因,完整序列

6水稻(粳稻品种组)Oryza sativa(japonica c u ltiv ar g roup)LEA蛋白12(LEA12)mRNA的完整

7松P i nu s克隆15r的LEA基因,完整序列

8小麦Triti cum ae stivum L inn LEA2蛋白(LEA2)

9拟南芥Arabi dopsis t haliana At1g01470基因,完整序列

10拟南芥Arabi dopsis t haliana At2g23110基因,完整序列

11拟南芥Arabi dopsis t haliana At2g44060基因,完整序列

12拟南芥Arabi dopsis t haliana纤维蛋白1(A t2g19760)mRNA的完整序列

列在系统进化树中距离较近,关系较密切。用DNA M AN对芥菜、苜蓿蒺藜、油棕和拟南芥中编码LEA蛋白的序列进行同一性的比对,同一性较高,基因序列中有多处重复部分(标记蓝色)。从序号为171到217的序列部分重复性较高。47个碱基中,仅仅有11个碱基不同,重复率为76 6%。

3 2 2 对编码LEA蛋白的保守序列的预测和分析 由DNA MAN的同一性比对预测保守序列结果为(从第

#

21

#

裴 培:LEA蛋白的同源性及其应用潜力

171号到第217号可编码LEA蛋白的序列):

CATCTTGCTGAAGGAAGGAGCAAGGGAGGGCAGA CAAGGAAGGAGCA预测的保守序列在NCB I网站上BL A ST所得到的结果,几乎所有得到的序列都与LEA 蛋白相关,从而可以推断,预测的保守序列具有一定的可靠性。而BLAST的结果中有2种未知的基因序列,一是大豆克隆J CV I FLGm 6A14(未知),另一种是大豆克隆J CV I FLGm 5F4(未知)。这两种基因序列登录号分别为:BT094816 1和BT090966 1。

用第一个未知的mRNA,即大豆克隆J CV I FLGm 6A14(未知)的基因与表1中列出的1至8号植物的序列分别进行同一性比对。大豆克隆J CV I FLGm 6A14未知基因与其他序列比对得到同一性为47 33%。然而,大豆克隆J CV I FLGm 5F4未知基因的同一性比较结果较低,最高的同一性仅为13 3%。由此可以推测第一种未知的基因序列与可以表达LEA蛋白的基因序列具有一定的相似性。

从以上分析可以得出预测,大豆克隆J CV I FLGm 6A14未知基因同可以编码LEA蛋白的基因具有一定的相似性,从而推测其可以翻译并表达LEA蛋白,在该植物中表现出LEA蛋白的抗旱性。

3 2 3 大豆克隆JCV I FL Gm 6A14未知基因所表达的蛋白和拟南芥(克隆AT10 3)胚晚期丰富蛋白基因转录的蛋白之间的同源性比较 大豆克隆J CV I FLGm 6A14未知基因表达的氨基酸序列为:

M ESQQANREELDEKARQGETVVPGGTGGKSLEAQ EHLAEGRSRGGQTRKQQLGSEGYHEMGTKGGQTRKEQ M GREGYQEMGRKGGLST M DKSGRERAEEEG IE I DES KF K I T

拟南芥(克隆AT10氨基酸序列 3)胚晚期丰富蛋白(LEA)的基因所表达的氨基酸序列为:

MASKQLSREELDEKAKQGETVVPGGTGG H SLEAQE HL AEGRSKGGQTRKEQL GHEGYQEI GHKGGEARKEQL GHEGYKE M GRKGGLST M EK SGGERAEEEG I EI DES KFT NK

将大豆克隆CV I FLGm 6A14未知基因表达的氨基酸序列与拟南芥(克隆AT10氨基酸序列 3)胚晚期丰富蛋白(LEA)的基因所表达的氨基酸序列进行BL A ST分析得到结果为:score=172bits(437),Expect =9e-49,M ethod:Co mpos iti onal matrix a djust I denti ties=90/109(82%),Positives=100/109(91%), G aps=0/109(0%)。即总分是172,而E值是9e-49,E值相当小。两种蛋白质序列的相似性为82%。从而可以得出结论,大豆克隆J CV I FLGm 6A14未知基因可以编码LEA蛋白或LEA蛋白的类似物。从而可以推测该基因所表达的蛋白具有抗旱功能。

3 2

4 大豆克隆J CV I FLGm 6A14未知基因序列的基本属性 通过BI OED I T分析大豆克隆J CV I FLGm 6A14未知基因序列的长度是569个碱基对,单链分子量为174281 00,双链分子量为345192 00道尔顿。G 和C含量为42 36%,而A和T含量为57 64%。

3 3 系统进化树的构建

利用DNA MAN软件,采取默认参数,选取进化中具有代表性的14个物种构建系统进化树,见图2。结果显示,所有这些物种均属同一分支,且各个物种间的进化距离均在0 001与0 172之间。如果数据库中这几种同源蛋白的序列是正确的,则利用LEA蛋白的保

守性对不同植物物种进行分类的价值有待进一步探讨。

图2 基于LEA蛋白序列构建的物种进化树状图

4 讨论

本文主要讨论了LEA蛋白的同源性,并利用DNA MAN对不同植物能表达产生LEA蛋白的基因序列进行分析比较,预测出保守序列。凭借预测的保守序列BLAST得到一种未知的大豆序列。通过BLAST比较此未知mRNA序列和拟南芥中可表达LEA蛋白的序列(clone AT10 3),认为二者有很大的相似性。从而推测未知的基因序列所表达的蛋白可行使与LEA蛋白相同的功能,即该未知大豆mRNA序列在植物抗旱性方面可能有相关作用。然而,本研究所预测的保守序列未经测试,所得到的结果还须经进一步检验。本研究为该未知大豆mRNA序列(Soybean clone JCV I FLGm5F4 unkno wnmRNA)的功能做了可能性分析,也为大豆的抗旱性机理提供了一种推断,可以在实践中更进一步的探讨和验证。

同时,由于LEA蛋白是一种较保守的蛋白,利用DNA MAN绘制的进化树可以在一定程度上显示不同植物之间的进化关系。因本实验所选取的材料较少,系统进化树可靠性有一定的局限。尽管如此,我们可以运用此方法对众多植物进行抗旱性研究并做出分类,以便我们根据自然环境状况,特别是干旱情况的发生频

# 22 #

研究报告

率,对植物的种植布局做出调整,优化种植结构避免自然灾害带来损失,获取更大社会经济效益。

参考文献:

[1]Yuan,K ,et a l ,A lterations i n human breast cancer ad

hesion mo tilit y i n response to changes i n ce ll surface g lyco prote i n display i ng alpha L fucose m o i e ties[J].Inte rna ti ona l Journa l of O nco logy,2008,32(4):797-807.

[2]W ysock,i R ,e t a l ,T ranscripti ona l A c ti vation of M eta l

l o i d T o l erance G enes i n Saccharom yces ce rev i s i ae R equ ires the AP 1i ke P ro te i ns Y ap1p and Y ap8p[J].M o l ecular

B i o logy of t he

C el,l2004,15(5):2049-2060.

[3]V alente,M A S ,e t a l ,T he ER lu m i nal bi nding pro te i n

(B i P)m ed i a tes an i ncrease i n drought to lerance i n soybean

and de l ays drought i nduced lea f senescence in soybean and tobacco[J].Journa l o f Exper i m enta l Botany,2009,60

(2):533-546.

[4]Ru ijne,N ,et a l ,U nderstand i ng t he I mm une R esponses

to t he M en i ngoco cca l Stra i n Specific V acc i neM e N ZB M eas ured i n Stud i es o f Infants[J].C li n i ca l and V accine I m m uno l ogy,2006,13(7):797-801.

[5]Rodr i gue z,M ,et a l ,Tumo r N ecros i s Facto r is R epara

ti v e v ia TNFR1i n t he H ippoca mpus and v ia TNFR2in the S triatu m a fter V irus Induced Encepha litis[J].Bra i n Pa tho logy,2009,19(1):12-26.

[6]M accon,i D ,e t al ,P er m se lecti ve D ysfunction of Podo

cy te Podocy te Contact upon Ang i o tensin II U nravels t heM o l ecular T arge t fo r R enoprotective Interventi on[J].Am er i can Journa l o f P atho logy,2006,168(4):1073-1085. [7]M atsoso,L G ,et a l ,F uncti on o f the Cy tochro m e bc1

aa3B ranch o f the R esp ira t o ry N e t w ork i n M ycobacte ria and N et wo rk A daptati on O ccurr i ng i n R esponse t o Its D isrupti on Bacte ri o l[J].Am er i can Soc i e ty for M icrobio l ogy2005,

187(18):6300-6308.

[8]Jansson,L ,et a l ,T he M ajor Subun it,C faB,of Co l oni

zati on F actor A nti gen I fro m Enterotox i genic Escherich i a co li Is a G l ycosph i ngoli p i d B i nd i ng P rote i n[J].Infec tion and I mmunity,2006,74(6):3488-3497.

[9]D eane,J E ,et a l ,S tructures o f t he Shigell a flexner i

T ype3Secreti on System P rote i n M x i C R eveal Confor m ation

a l V aria

b ility Am ongstH o m o l ogues[J].Journal ofM o l ec

u l ar B io l ogy2008,377(4-3):985-992.

[10]Beeson,J G ,et a l ,P las m odi um falc i paru m Iso lates

fro m Infected PregnantW omen and Chil dren A re A ssoc iat

ed w ith D isti nct A dhesi ve and An ti gen ic Properties[J].

T he Journal o f Infectious D iseases.1999 180(2):464-

472.

[11]L,i L ,e t al ,M A I GO2Is Invo lved i n Ex it o f Seed Stor

age P rote i ns from t he Endop l as m i c R eticulu m in A rab i dop

si s thali ana[J].P lant C el,l2006,18(12):3535-

3547.

[12]A bdo,M ,et a l ,The expressi on o f t umo r necrosis fac

tor a l pha,its recepto rs and stero i dogen i c acute regu l a t o ry

prote i n dur i ng co rpus l uteu m reg ressi on[J].R eproduc

ti ve Bio l ogy and Endocr i no logy,2008,6:50.

[13]马建华,郑海雷.植物耐盐的分子生物学基础[J].生物学

杂志,2007,24(1):5-8.

[14]俞磊宁.山仑 LEA蛋白与植物的抗旱性[J].生物工程进

展,2002,22(2):10-14.

[15]鲁刚宁 植物抗性与农业[J].中国科技信息,2006(3A):

73.

[16]LEA蛋白空间结构图[OL].http://www ncb i n l m

n i h gov/Structure/mmdb/mmdbsrv cg?i uid=76476.

(责任编辑:谭著明)

#

23

#

临床微生物检测的基因同源性分析

临床微生物检测的基因同源性分析 医院感染的流行病学研究是临床微生物学工作者的重要课题，在医院感染监测的研究中，一个很重要的问题就是如何确定感染途径和传播途径，以采取有效预防和控制措施，从而防止医院感染或者暴发流行，因此对微生物鉴定和菌株同源性分析提出了更高的要求。 目前，传统的细菌鉴定和同源性分析技术已不能很好地满足医院感染诊断和流行病学调查的需要，从型、亚型、株，甚至分子水平上去认识细菌变得愈来愈重要了。近年来分子生物学的理论和技术在细菌感染诊断中的渗透和广泛应用，使得细菌鉴定、耐药基因的检测、分子流行病学调查变得更加准确、简洁和快速。细菌DNA同源性分析技术如脉冲场凝胶电泳、聚合酶链反应、DNA探针杂交以及序列分析等方法是目前在分子水平上分析细菌的主要手段，它在鉴定细菌感染的爆发、确定院内交叉感染、感染病原菌之间的基因同源性等方面有着重要的作用，本文将对常用基因同源性分析方法的机理和过程做简要综述。 一、质粒分型(Plasmid profile assay)： 1、原理： 质粒是可移动的染色体外元件，可以自发丢失或者被宿主稳定地获得，因此流行病学上相关的分离菌株有可能表现出不同的质粒图谱。把质粒提取出来，进行常规的琼脂糖电泳分析，就可以知道分离菌株携带质粒的大小和数目。 2、实验过程：a.质粒抽提；b.0.8%琼脂糖电泳；c.EB染色、凝胶成像。 3、实验方法的评价： 优势： a.步骤比较简单，对实验仪器要求不高。 b.在评价那些从局限的时间和地点（如一个医院中的急性爆发）分离出来的菌株非常有效。 缺点： a.实验结果的重复性不好。 b.分辨力不高。 二、染色体DNA的限制性内切核酸酶分析 (Restriction Endonuclease Assay REA) 1、原理： 限制性内切核酸酶（REA）在特异的核酸识别序列切割DNA，DNA被消化后，所得到的限制性片段的数目和大小是由酶的识别位点和DNA的组成共同决定的。在传统的限制性内切核酸酶分析中，人们用含有相对多的限制性位点的内切核酸酶消化细菌的DNA，这样就会得到成百上千条长度在0.5-50Kb范围内的DNA 片段。恒定的电场琼脂糖电泳，可以根据分子质量的大小将这些DNA片段分开，然后通过EB染色并在紫外灯下观察其图谱。同一种的不同分离菌株的DNA序列的变异可造成限制性位点数目和分布的变化，所以可以导致其REA图谱出现差异。 2、实验流程：a.染色体DNA抽提；b.限制性内切酶消化DNA（主要是Hind III）； c.0.7%琼脂糖电泳； d.EB 染色、凝胶成像。

花生profilin蛋白的生物信息学分析

·论著·[文章编号]1000-8861（2011）02-0158-04花生profilin蛋白的生物信息学分析 肖杰，吴序栎，王琳琳，LU Jun，徐宏* [摘要]目的生物信息学预测profilin蛋白的结构和功能。方法通过Genbank搜索profilin蛋白的氨基酸序列，采用生物信息学方法分析预测profilin蛋白信号肽、疏水性、跨膜区、二级结构。结果通过DNAStar软件分析得到了该蛋白的B细胞表位。结论利用生物信息学预测出的结构和功能信息，能为profilin蛋白的相关过敏研究提供信息基础。 [关键词]花生；profilin；过敏；生物信息学 [中图分类号]Q71[文献标识码]A Bioinformatics of profilin protein from peanut XIAO Jie,WU Xuli,WANG Linlin,LU Jun,XU Hong College of Chemistry and Chemical Engineering,Shenzhen University,Shenzhen518060,China [Abstract]This paper focuses on the prediction of structures and functions of peanut allergen profilin using bioinformatics methods.The amino acid sequence of profilin was searched in Genbank.Meanwhile,its signal pep－tides,hydrophobicities,transmembrane domains and the secondary structures were predicted and analyzed by us－ing bioinformatics methods.Furthermore,B-cell epitopes for the protein was predicted with DNAStar.These pred－icated structures and functions lays down a solid information foundation for the allergic investigation of profilin protein. [Key words]Peanut;Profilin;Allergy;Bioinformatics Profilin是一种存在于几乎所有真核细胞的一种蛋白，它最初是在1977年作为肌动蛋白的结合蛋白被报道的。1991年，当桦树花粉次要过敏原被证明为profilin时，该蛋白才引起了变态反应学家的重视[1]。profilin蛋白是微丝快速重组的关键因素[2-3]，在植物中肌动蛋白抑制蛋白序列的同源性很高，一般在71%～85%。然而，在低等真核生物、真菌和动物中profilin的序列同源性却很低，约25%～40%[4]。植物profilin有一个保守的序列长度，含131～134个氨基酸，相对分子质量约（14.0～14.5）×103，等电点在4.6～5.4之间。由于它们是广泛存在，并且是氨基酸序列高度保守（大于70%的同源性）的过敏原，因此被认为是引起花粉和植物性食物之间发生交叉反应的主 要因素之一。实验证明，肌动蛋白抑制蛋白广泛存在于花粉、水果、蔬菜、香料、种子、坚果、乳汁等致敏物质中，因此被称为泛变应原（pan-allergen）。近年来，科学家们已经认识了部分植物的profilin蛋白特征，并将它们的cDNA克隆出来了，如梨（Pyr c4），樱桃（Pru av4），桃（Pru p4），花生（Ara h5）等。 花生过敏原是目前世界上最主要的8中食物过敏原之一，据统计有超过0.2%～1.5%的儿童对花生过敏[5-9]。目前国际免疫学会（https://www.wendangku.net/doc/5b18898588.html,）已经公布了Ara h1到Ara h11的11种花生过敏原蛋白，profilin是其中的一种，即Ara h5。它作为泛过敏原，是Ⅰ型交联过敏反应的关键因素[10]。 花生profilin蛋白（Ara h5）共128个氨基酸残基，相对分子质量为14100，在基因库中的登录号为AAU81921[11]。对花生profilin蛋白的研究很少，Tamara等克隆表达出花生profilin蛋白，发现它与其他植物的profilin蛋白有超过80%的相同氨基酸序列[12]，花生profilin蛋白的蛋白结构及其功能性的研究均未见报道。本文以花生profilin蛋白为研究对象，运用生物信息学的方法对花生profilin蛋白的结 基金项目：国家自然科学基金(30871752,30570421)；The International Science and Technology（ISAT）Linkages Fund,Royal Society of New Zealand(ISATB09-33)；广东省科技重点专项(2003A3080502)；教育部留学回国人员科研启动基金 作者单位：518060，深圳大学化学与化工学院（肖杰，徐宏），深圳大学医学院（吴序栎，王琳琳）；1142Auckland,New Zealand,NCIECP, Auckland University of Technology（LU Jun） *通信作者：徐宏，Tel:0755-********;E-mail:szuxuhong@https://www.wendangku.net/doc/5b18898588.html,

植物生理学

光合作用 1、光合作用的气孔限制与非气孔限制，判断。气孔限制值的计算，优缺点？ 2、叶绿素荧光诱导动力学曲线，可以测定哪些叶绿素荧光参数？有什么生理意义？ 叶绿素荧光诱导动力学是指当暗适应的绿色植物材料转至光下时，其体内叶绿素荧光强度会产生有规律的随时间的变化 3、光合作用的光抑制，衡量指标，植物光保护机制？ 4、水孔蛋白的种类和功能? 5、渗透调节，植物相容性物质的作用机理？ 6、植物激素的研究进展？测定植物激素的方法？优缺点 7、根系化学信号，植物感知土壤干旱信息并调控气孔运动 8、植物次生代谢物，植物次生代谢物的合成途径及生理功能 9、植物热激蛋白，LEA蛋白质 10、 11、植物的抗盐性，antiport 简述植物光系统的结构和功能 矿质离子营养 1、什么是离子吸收动力学曲线，其参数意义是什么？ 2、为什么低亲和力的硝酸盐吸收也需要H+--ATPase的参与？ 3、与其他的养分离子相比，硝酸盐转运蛋白基因表达的调节有何特点？ 4、钾离子运输蛋白有哪几类？有何特点？ 5、不同植物铁吸收运输机制有什么不同，有哪些基因参与？ 光受体 1、光敏色素发现的意义何在？举例说明PHY在植物的个体发育过程中有哪些作用？例：、1、光敏色素与植物光周期反应 2、光敏色素与生理节律现象 3、避阴反应 4、光敏色素对植物激素等成分的调节作用 1.种子萌发 2.弯钩张开 3.节间延长 4.根原基起始 5.叶分化和扩大 6.小叶运动 7.膜透性11.光周期 12.花诱导 13.子叶张开 14.肉质化 15.偏上性 16.叶脱落 17.块茎形成 18.性别表现 19.单子叶展叶 20.节律现象 8.向光敏感性 9.花色素形成 10.质体形成 2、简述PHY的三种反应类型VLFR、LFR、HIR的作用特点 光敏色素的反应可按它们对光量的需求进行区分 每个光敏色素的反应都有特定的光通量范围，在此范围内，反应幅度与光通量成正比。这些反应根据所需要的光量可分为三个类型： 极低辐照度反应(VLFR） 这类反应可以被10-4～10-2μmol/㎡的红光或远红光诱导，但红光反应不能被远红光所逆

人NIRF基因真核表达质粒的构建及其蛋白产物的生物信息学分析

中国图书分类号Q784R318.04文献标识码Ａ文章编号1004-5503（2009）01-0006-04【基础研究】人NIRF基因真核表达质粒的构建及其蛋白产物的生物信息学分析 常蕾钱冠华段昌柱 【摘要】目的克隆人NIRF基因，构建其真核表达质粒，并运用生物信息学方法对NIRF蛋白进行分析。方法应用RT-PCR技术，从HeLa细胞中扩增NIRF基因，插入到真核表达载体pcDNA3.1-Flag中，双酶切鉴定并测序。在NCBI蛋白质结构数据库中寻找与NIRF具有较高同源性的1WY8和1Z6U，并利用Insight II结构生物信息学分析软件分析NIRF蛋白的结构和功能。结果扩增出约2400bp的人NIRF全长cDNA；重组真核表达质粒pcDNA3.1-Flag-NIRF酶切后，可见约2400bp的目的片段；测序结果表明NIRF全长cDNA与GenBank中NIRF序列完全一致。1WY8片段有3个赖氨酸残基，主要位于蛋白空间构象的表面；1Z6U片段含有Ring finger结构域，具有ligase活性。结论已成功克隆了人NIRF基因全长cDNA，构建了其真核表达质粒，并利用生物信息学方法，初步分析了NIRF蛋白泛素化作用的机理。 【关键词】NIRF基因；克隆；真核表达质粒；生物信息学 Construction of Eukaryotic Expression Vector for Human NIRF Gene and Bioinformatics of Deduced Expressed Protein CHANG Lei,QIAN Guan-hua,DUAN Chang-zhu（Cell Biology Institute of Chongqing Medical University, Chongqing400016,China） 【Abstract】Objective To clone human NIRF gene,construct its eukaryotic expression vector and analyze the bioinformatics of deduced expressed protein.Methods NIRF gene was amplified from HeLa cells by RT-PCR and inserted into eukaryotic expres－sion vector pcDNA3.1-Flag.The constructed recombinant plasmid pcDNA3.1-Flag-NIRF was identified by restriction analysis and se－quencing.Fragments1WY8and1Z6U highly homologous to NIRF were screened from NCBI protein structure data bank for analyzing structure and function of NIRF protein by InsightⅡsoftware.Results The NIRF cDNA fragment at a full length of about2400bp was amplified.The target gene fragment at a length of about2400bp was recovered from recombinant plasmid pcDNA3.1-Flag-NIRF digested with restriction endonuclease,and its sequence was completely identical to that of NIRF reported in GenBank.1WY8frag－ment contained3lysine residues which was mainly located on the surface of spatial conformation of protein.1Z6U fragment contained a ring finger structural domain and showed the activity of ligase.Conclusion The full-length cDNA of human NIRF was successfully cloned,and its eukaryotic expression vector was constructed.The mechanism of ubiquitination of NIRF protein was preliminarily ana－lyzed by bioinformatical method. 【Key words】NIRF gene;Cloning;Eukaryotic expression vector;Bioinformatics Np95／ICBP90-like RING finger protein（NIRF）是近年发现的一种核蛋白，其基因定位于9p24.1，全长NIRF含有802个氨基酸残基。研究表明，NIRF具有E3（Ubiquitin／UBL-protein ligase，泛素／类泛素连接酶）功能，在细胞内能与Cd k2-cyclin E2和PCNP （PEST-containing nuclear protein）结合，并参与PCNP 的泛素化。同时，该蛋白在细胞内能将肿瘤抑制蛋白P53直接泛素化［1］。最新研究表明，NIRF可能是癌症治疗的靶基因［2］。本研究克隆了人NIRF基因，构建其真核表达载体，并应用生物信息学方法，对其蛋白的空间结构及泛素化作用机理进行分析，为进一步探索NIRF在癌症治疗中的作用奠定基础。1.材料与方法 1.1细胞、质粒及菌株 HeLa细胞、pcDNA3.1-Flag质粒和大肠杆菌DH5α为本室保存。 1.2试剂 DMEM培养基和胎牛血清（FCS）为HyClone公司产品；Trizol试剂盒和superscriptⅡ反转录酶购自Invitrogen公司；oligodT购自TaKaRa公司；DNA高保真酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA marker、质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒和DNA 片段纯化试剂盒均购自Promega公司。 1.3细胞培养及总RNA的提取 用DMEM培养液及10％FCS常规培养HeLa 细胞，每3d换液传代。取约106个细胞，提取总RNA，逆转录反应按试剂说明进行。 基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.30872248）；重庆市科技委员会资助（CSTC，2008BB5400）；重庆市教育委 员会资助（KJ080326）. 作者单位：重庆医科大学细胞生物学教研室（重庆400016）. 通讯作者：段昌柱，E-mail：shebeichu@https://www.wendangku.net/doc/5b18898588.html,

水分子通道蛋白的结构与功能的关系

水分子通道蛋白的结构与功能的关系 姓名：王国栋 院系：基础医学院中西医结合1班 学号：20141025 水分子穿越双磷脂生物膜的输运机理是生理学和细胞生物学中一个长期未能解决的重要问题。AQP1水通道蛋白的发现和鉴定使得人们确认出一个新的蛋白质家族———水通道蛋白家族。正是这一蛋白家族的存在，使得水分子可以进行快速的跨膜传输。由晶体学方法解出的哺乳动物AQP1水通道蛋白的原子结构，最终揭示了水通道蛋白只允许水分子快速传输而阻挡其他的小分子和离子（包括质子H+）的筛选输运机理。本文概述了水通道蛋白对水分子筛选传输的机理。 一、水通道蛋白的重要性 活细胞外面有一层由磷脂组成双层膜，称为双磷脂细胞膜。它将细胞的内环境物质及细胞器等与外部环境区分开。水、离子以及其他极性分子一般不能透过这层双磷脂细胞膜。但是细胞生命活动经常需要有选择性地对这些物质进行快速跨膜传输。这是通过镶嵌在细胞膜上具有输运化学物质功能的膜蛋白来实现的，不同膜蛋白具有输运不同化学物质的能力。 水是活细胞的主要组成部分。在活细胞中，水的比例占总重量的70%左右。大多数的细胞生化反应都是在水环境中进行的。水分子的跨膜输运是如何实现的是生命科学中一个非常重要的基本问题。水分子虽然可以以简单渗透扩散方式通过细胞膜，但是扩散速度非常缓慢。科学研究证明，水分子跨越细胞膜的快速输运是通过细胞膜上的一种水通道蛋（aguaporin ，AQP ）实现的。一个AQP1 水通道蛋白分子每秒钟可以允许30 亿个水分子通过。水通道蛋白大量存在于动物、植物等多种生物中。在哺乳动物中，水通道蛋白大量存在于肾脏、血细胞和眼睛等器官中，对体液渗透、泌尿等生理过程非常重要。在植物当中，水通道蛋白直接参与根部水分吸收及整个植物的水平衡。由于水通道蛋白的存在，细胞才可以快速调节自身体积和内部渗透压。由此可见，水通道蛋白对于生命活动至关重要。 二、水通道蛋白的结构 蛋白质的功能是通过其结构来实现的。 要解决一个蛋白的功能机理问题，必须首先 解出它的原子结构。 AQP1 在细胞膜中以四聚体形式存在 （图1）。每个单聚体（即一个AQP1 分子） 是一个独立功能单元，中心存在一个通道管。它由6 个贯穿膜两面的长ɑ螺旋构成基本骨架，其中间有两个嵌入但不贯穿膜的短ɑ螺旋几乎顶对顶地放置着（图2）。在两个短ɑ螺旋相对的顶端各拥有一个在所有水通道家族蛋白中都保守存在的Asn-Pro-Aia （NPA ）氨基酸组单元。它们使得这种顶对顶结构得以稳定存在。从两个螺旋的顶端分别延生出一条氨基酸残基松散链条分别回绕，走向各自的膜面。后面我们会看到这种短ɑ螺旋结合松散链条组成的结构单元对水通道功能非常重要。事实上，这种结构单元不仅存在于水通道蛋白中，还在其图1 水通道蛋白的投影密度图。 在双磷脂膜中，4个AOPI 水通道蛋白分子构成一个四聚体。每个水通道分子单体的中心存在一个只允许水分子通过的通道管。

核酸和蛋白质序列分析

核酸和蛋白质序列分析 在获得一个基因序列后，需要对其进行生物信息学分析，从中尽量发掘信息，从而指导进一步的实验研究。通过染色体定位分析、内含子／外显子分析、ORF分析、表达谱分析等，能够阐明基因的基本信息。通过启动子预测、CpG 岛分析和转录因子分析等，识别调控区的顺式作用元件，可以为基因的调控研究提供基础。通过蛋白质基本性质分析，疏水性分析，跨膜区预测，信号肽预测，亚细胞定位预测，抗原性位点预测，可以对基因编码蛋白的性质作出初步判断和预测。尤其通过疏水性分析和跨膜区预测可以预测基因是否为膜蛋白，这对确定实验研究方向有重要的参考意义。此外，通过相似性搜索、功能位点分析、结构分析、查询基因表达谱聚簇数据库、基因敲除数据库、基因组上下游邻居等，尽量挖掘网络数据库中的信息，可以对基因功能作出推论。上述技术路线可为其它类似分子的生物信息学分析提供借鉴。本路线图及推荐网址已建立超级链接，放在北京大学人类疾病基因研究中心网站 （https://www.wendangku.net/doc/5b18898588.html,/science/bioinfomatics.htm）,可以直接点击进入检索网站。 下面介绍其中一些基本分析。值得注意的是，在对序列进行分析时，首先应当明确序列的性质,是mRNA序列还是基因组序列？是计算机拼接得到还是经过PCR扩增测序得到？是原核生物还是真核生物？这些决定了分析方法的选择和分析结果的解释。 （一）核酸序列分析 1、双序列比对（pairwise alignment） 双序列比对是指比较两条序列的相似性和寻找相似碱基及氨基酸的对应位置，它是用计算机进行序列分析的强大工具，分为全局比对和局部比对两类，各以Needleman-Wunsch算法和Smith-Waterman算法为代表。由于这些算法都是启发式（heuristic）的算法，因此并没有最优值。根据比对的需要，选用适当的比对工具，在比对时适当调整空格罚分（gap penalty）和空格延伸罚分（gap extension penalty），以获得更优的比对。 除了利用BLAST、FASTA等局部比对工具进行序列对数据库的搜索外，我们还推荐使用EMBOSS软件包中的Needle软件 （http://bioinfo.pbi.nrc.ca:8090/EMBOSS/），和Pairwise BLAST

植物中的水孔蛋白

植物中的水孔蛋白 目录 1、植物中的水孔蛋白简介 2、植物水孔蛋白的发现 3、植物水孔蛋白的结构及生化特性 4、植物水孔蛋白的分类 5、植物水孔蛋白的功能 5.1水孔蛋白促进植物体内水分运输的功能 5.2水孔蛋白对细胞的渗透调节作用 5.3参与气孔运动 5.4参与光合作用 5.5调节植物对中性分子(甘油、NH 、尿素)和营养元素(硼、硅)的吸收 5.6参与开花生理 5.7参与果实的发育与成熟、种子的成熟与萌发 5.8还参与栓塞的修复 5.9还能防止渗透伤害 6、水孔蛋白的调控 6.1基因表达 6.2翻译后修饰 6.3调控 6.3.1转录水平调控 6.3.2磷酸化调控 6.3.3 pH调控 6.3其他调节机理 7、水孔蛋白与植物抗旱性、抗盐性

一、植物水孔蛋白简介 水孔蛋白(aquaporin，AQP)是指细胞膜上能选择性地高效转运水分子的膜内在蛋白，属于MIP(major intrinsic protein)超家族，分子质量在23～31 ku[1]．1988年，Agre研究小组最先从人红细胞质膜中分离得到水孔蛋白CHIP28蛋白，即AQP1[2]．1992年他们在爪蟾卵母细胞表达系统中对所得蛋白质进行功能鉴定，第一次从分子水平证实细胞膜上存在蛋白质介导的水分跨膜转运[3]．1993年，Maurel等[4]从拟南芥中分离得到第一个植物水孔蛋白γ-TIP．迄今，已在真细菌、古生菌、真菌、动物和植物等几乎所有生物中发现AQP[5]．AQP的发 现及其结构和功能的研究，为人们从分子水平认识和阐明细胞内水分运输及其调控的分子机制奠定了基础．本文着重就植物AQP的多样性与分类、结构特征、生理功能、活性调节及基因表达调控等方面的最新研究进展作简要综述． 二、植物水孔蛋白的发现 在植物中发现水孔蛋白并不是由于寻找有水分转运活性的蛋白，或者研究植物水分生理的结果。而只是因为这些蛋白在细胞膜上丰度比较高而发现了这些膜内在蛋白(MIP,major intrinsic membrane protein)。α-TIP是一种种子特异性表达的液泡膜内在蛋白，占蚕

DNA序列比对同源性分析图解BLAST

1、进入网页：https://www.wendangku.net/doc/5b18898588.html,/BLAST/ 2、点击Search for short, nearly exact matches 3、在search栏中输入引物系列： 注：文献报道ABCG2的引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’; 5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’ （1）输入方法可先输入上游引物，进行blast程序，同样方法在进行下游引物的blast程序。 这种方法叫繁琐，而且在结果分析特异性时要看能与上游引物的匹配的系列，还要看与下游引物匹配的系列——之后看两者的交叉。

（2）简便的做法是同时输入上下游引物：有以下两种方法。输入上下游引物系列都从5’——3’。 A、输入上游引物空格输入下游引物 B、输入上游引物回车输入下游引物 4、在options for advanced blasting中： select from 栏通过菜单选择Homo sapiens Expect后面的数字改为10

5、在format中： select from 栏通过菜单选择Homo sapiens Expect后面的数字填上0 10

6、点击网页中最下面的“BLAST！” 7、出现新的网页，点击Format！

8、等待若干秒之后，出现results of BLAST的网页。该网页用三种形式来显示blast的结果。（1）图形格式： 图中①代表这些序列与上游引物匹配、并与下游引物互补的得分值都位于40～50分 图中②代表这些序列与上游引物匹配的得分值位于40～50分，而与下游引物不互补 图中③代表这些序列与下游引物互补的得分值小于40分，而与上游引物不匹配 通过点击相应的bar可以得到匹配情况的详细信息。

水通道蛋白的发现及对人体的作用

水通道蛋白的发现及对人体的作用 刘彦成 （渭南师范学院环境与生命科学系陕西渭南 714000）摘要：水通道蛋白(aquaporin，AQP) 是一种对水专一的通道蛋白。具有介导水的跨膜转运和调节体内水代谢平衡的功能。水通道蛋白调节失控与水平衡紊乱等一系列疾病密切相关。 关键词：细胞膜；水通道蛋白（AQP）；跨膜转运；疾病；调节 Abstract:The pass of water protein (aquaporin, AQP) is one kind of adding water single-minded channel protein.Has lies between leads the water the cross membrane transportation and the adjustment body domestic waters metabolism balance function.Pass of water protein adjustment out of control and level balance disorder and so on a series of disease close correlation. Key word:Cell membrane pass of water protein (AQP) cross membrane transportation disease adjusts 1 水通道蛋白的发现 1.1 细胞膜的运输方式 细胞是构成生物的基本单位，细胞与细胞之间则是通过细胞膜来沟通和实现基本的生命活动。细胞膜的主要成分为磷脂和蛋白质，其结构为磷脂双分子层，磷脂双分子层上有糖蛋白，糖蛋白所在一侧为细胞外侧。物质跨膜运输可分为自 图1 细胞膜的立体结构 由扩散（不需能量、载体），协助扩散（不需要能量、需载体），主动运输（要能量、需载体）三种。还有一些大分子物质是通过胞吞、胞吐方式通过细胞膜，它们需要能量、不要载体。另外还有一种很主要的方式就是通道蛋白。 1.2 生物膜水通道的发现【1】 长期以来对于水的运输方式研究者普遍认为主要有两种：即简单的扩散方式和借助离子通道通过磷脂双分子层。 近些年研究者发现某些细胞在低渗溶液中对水的通透性很高, 很难用简单扩散来解释。如将红细胞移入低渗溶液后，很快吸水膨胀而溶血，而水生动物的

同源性分析标准操作规程

同源性分析标准操作规程 持有部门：检验科 制定部门：丰都县人民医院医院感染管理科执行时间： 2013年11月1日 一、同源性分析的应用 包括感染暴发的判断，感染病原菌的确定及感染源的寻找。 二、基本方法 1．细菌的表型特征分型技术(如血清型、耐药表型等)。 2．基因分型技术(如．PFGE、Rep—PCR、AFLP等)。 三、操作步骤 (一)表型分型(血清型、耐药表型) 1．标本孵育：从患者感染部位采集标本，并接种于相应培养基(培养瓶)中孵育。 2．分离菌种：分离病原菌(细菌或真菌)，并鉴定细菌(真菌)种类。 3．血清分型：如可能则对同种细菌进行血清分型，如军团菌等。 4．药敏试验：根据细菌(真菌)种类选择药敏卡(纸片)，进行药敏试验。 5．结果分析：分析血清型和药敏谱，如结果相同或药敏相差不大则提示有同源性。 (二)基因分型(PFGE) 1．菌栓制备：将细菌悬液与2％低熔点琼脂糖凝胶混合，制备菌栓。 2．细菌消化：分别用含溶菌酶和(或)蛋白酶K的裂解液对菌栓进行消化。 3．洗涤菌栓：可用无菌水反复清洗或PMSF中和多余的蛋白酶K。 4．酶切：按照各种不同限制性内切酶的说明进行酶切。 5．制胶：用PF(讵电泳凝胶模具制备：PF(逼级琼脂糖凝胶。 6．电泳：根据不同细菌酶切片段的大小选择适当的脉冲参数，进行电泳。 7．凝胶成像：胶块染色后在凝胶成像仪下成像。 8．结果分析：根据Tenover等制定的标准对凝胶图像进行分析，判断菌株之间的同源性。 四、注意事项 1．不同的分型方法，在分型能力、重复性、分辨能力、操作和成本等方面都不尽相同，可根据情况进行选择。 2．表型分型方法的分辨能力普遍比基因分型方法低，但简便、快速，适用于对感染暴发的初筛。

水孔蛋白部分

1．水孔蛋白的结构、特征、功能及在农业上的指导意义。 答：水孔蛋白是存在于生物膜上的一类具有选择性，高效转运水分的内在功能蛋白。 结构： 活体生物膜中的水孔蛋白四级结构是由四个对称排列的圆筒状亚基包围形成的四聚体，每个单体上有一个独立的水通道，这个水通道在胞外部分较窄而在胞内部分较宽，水通道的收缩区域形成了一个选择性过滤器，他对水的转运具有选择作用，尿素等大分子将被排斥而不能通过。 特征： A、所有生命形态中都具有水孔蛋白，是水跨膜运输的最主要通道 B、是高丰度蛋白，传输快，有264个氨基酸残基。 C、主要是内在蛋白。 D、6个跨膜区，4个单体形成水孔蛋白，以四聚体存在于膜上，多数是异源 四聚体。 E、在质膜和液泡膜分为四个家族。 功能： A、是水的特异性通道，其他分子、离子不能通过。 B、水孔蛋白与自交不亲和性有密切关系。 C、水孔蛋白与胞间连丝有关系。 D、水孔蛋白不但能透过水而且能透过二氧化碳 E、PH降低能抑制其活性。 在农业上的应用: 水孔蛋白可增加植物对水分的吸收，促进植物生长。在干旱盐碱胁迫下，使水孔蛋白表达受抑制或降低其活性，可提高植物的抗逆性。农业上可利用水孔蛋白基因沉默或超表达的方法对植株进行改造，在适宜环境下，水孔蛋白基因的超表达可提高植物对水分的吸收。 2、如何运用生物学手段证明一个蛋白是水孔蛋白？ 水孔蛋白能高效运输水分，因此，可通过转基因技术将编码水孔蛋白的DNA 序列转移到爪蟾的卵母细胞中，使其在爪蟾卵母细胞膜上表达，再将其放入水中，观察其生物膜是否吸水膨胀，若吸水膨胀体积增大，则证明该蛋白是水孔蛋白。 3、如何给水孔蛋白进行细胞学定位？ 确定水孔蛋白的细胞学定位，可采用基因标记的方法。用限制性内切酶将水孔蛋白基因的启动子切下，连接一个绿色荧光蛋白基因作为标记基因，然后通过转基因技术，把其基因转移到大肠杆菌细胞中，，使其重组基因在细胞中复制，并表达。通过标记基因判断水孔蛋白的具体位置，若蛋白定位在细胞膜上，则会在细胞膜上发现有荧光，若在细胞质内，则细胞质内有荧光。 4、高等植物硝酸还原酶结构与功能，硝酸还原酶基因的表达是如何被调控的？ 在高等植物中硝酸还原酶是同型二聚体，每个亚基分子量为100-120kb，主要存在于根和叶片中；其功能是利用NADPH或NADH为电子供体，还原游离的硝酸根为亚硝酸根，进而在亚硝酸还原酶作用下，将亚硝酸根还原为可利用的氨。 硝酸还原酶的基因表达及调控：

植物热激转录因子在非生物逆境中的作用

分子植物育种，２００６年，第４卷，第１期，第８８－９４页 ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００６，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．１，８８－９４ 专题介绍 Ｒｅｖｉｅｗ 植物热激转录因子在非生物逆境中的作用 翁锦周洪月云＊ 福建省农业科学院闽台园艺研究中心，漳州，３６３００５ ＊通讯作者，ｈｏｎｇｙｈｋ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ 摘要非生物逆境通常导致生物体内蛋白变性。热激蛋白（Ｈｓｐ）作为分子伴侣协助蛋白的重新折叠、稳定、胞内运输和降解，以阻止受损蛋白的累积，维护细胞内环境的稳定。而热激蛋白的表达是通过热激转录因子（Ｈｓｆｓ）结合于热激蛋白基因的启动子的热激元件上（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｅｌｅｍｅｎｔ，ＨＳＥ），以募集其它转录因子而形成转录复合体，促进热激蛋白基因的表达。植物热激转录因子比动物系统更为多样性。根据其基本的结构域，植物热激转录因子可分为三类：ＨｓｆＡ、ＨｓｆＢ、ＨｓｆＣ。Ａ类Ｈｓｆｓ已有大量深入的研究和报道，特别是在番茄方面。ＨｓｆＢ和ＨｓｆＣ的作用尚不清楚。在其复杂的网络中，每一热激转录因子均有其独特的作用，取决于其表达模式、亚细胞定位、聚合化、活性及与其他蛋白的相互作用。在非生物逆境，尤其是热激逆境下，Ａ类热激转录因子在调节热激蛋白的表达起着重要作用。番茄的ＨｓｆＡ１起着主导作用，其缺失无法被其他相近的Ｈｓｆｓ所取代，但在持续热逆境下，在ＨｓｆＡ１的配合下，ＨｓｆＡ２可成为主要调节因子。Ｂ类热激转录因子可作为Ａ类Ｈｓｆｓ的阻抑蛋白。然而，基于对不同的单个突变体的研究，以及对酵母Ｈｓｆ１致死突变体的拯救恢复，一些热激转录因子的作用又是丰余的。此外，热激蛋白也对热激转录因子起负反馈调节作用。 关键词热激转录因子（Ｈｓｆｓ），热激蛋白（Ｈｓｐｓ），热胁迫，非生物逆境 ＴｈｅＲｏｌｅｓｏｆＰｌａｎｔＨｅａｔＳｈｏｃｋＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒｓｉｎＡｂｉｏｔｉｃＳｔｒｅｓｓ ＷｅｎｇＪｉｎｚｈｏｕＨｏｎｇＹｕｅｙｕｎ＊ Ｆｕｊｉａｎ－ＴａｉｗａｎＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，ＦｕｊｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｚｈａｎｇｚｈｏｕ，３６３００５ ＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ｈｏｎｇｙｈｋ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ ＡｂｓｔｒａｃｔＡｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｒｅｓｕｌｔｓｉｎｐｒｏｔｅｉｎｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ．Ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｐｅｒｏｎｅｓｉｎｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇｔｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｄａｍａｇｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｔｏｍａｉｎｔａｉｎｃｅｌｌｕｌａｒｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓｂｙｒｅｆｏｌｄｉｎｇ，ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ｉｎ－ｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎａｎｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｈｓｐｓ）ｉｓｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｔｈｅｈｅａｔｓｈｏｃｋｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ（Ｈｓｆｓ）ｖｉａｂｉｎｄｉｎｇｔｏｔｈｅｈｅａｔｓｈｏｃｋｅｌｅｍｅｎｔ（ＨＳＥ）ｏｆＨｓｐｓｇｅｎｅｓｔｏｒｅｃｒｕｉｔｏｔｈｅｒｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ，ｃａｕｓｉｎｇｔｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆＨｓｐｓ．ＴｈｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｔｈｅＨｓｆｓｙｓｔｅｍｉｎｐｌａｎｔｓｉｓｅｖｉｄｅｎｔｌｙｍｕｃｈｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆａｎｉｍａｌｓ．Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｉｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｏｍａｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ｐｌａｎｔＨｓｆｓｃａｎｂｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｈｒｅｅｃｌａｓｓｅｓ，ＨｓｆＡ，ＨｓｆＢ，ａｎｄＨｓｆＣ．ＣｌａｓｓＡＨｓｆｓａｒｅｗｅｌｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｉｎｔｏｍａｔｏ．ＴｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｃｌａｓｓＢａｎｄＣａｒｅｓｔｉｌｌｎｏｔｃｌｅａｒ．ＩｎｔｈｅｃｏｍｐｌｅｘｎｅｔｗｏｒｋｏｆＨｓｆｓ，ｅａｃｈｏｆＨｓｆｓｈａｓｉｔｓｕｎｉｑｕｅｒｏｌｅ，ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｎｔｈｅｅｘ－ｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎ，ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ａｎｄｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｏｔｈｅｒｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＣｌａｓｓＡＨｓｆｓｐｌａｙａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＨｓｐｇｅｎｅｓｉｎａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｉｎｈｅａｔｓｔｒｅｓｓ．ＨｓｆＡ１ｉｎｔｏｍａｔｏａｃｔａｓａｍａｓｔｅｒｒｅｇｕｌａｔｏｒ．ＴｈｅｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｔｏｍａｔｏＨｓｆＡ１ｃａｎｎｏｔｂｅｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄｂｙａｎｙｏｆｏｔｈｅｒｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄＨｓｆｓ．ＨｓｆＡ２ｍｉｇｈｔｂｅｃｏｍｅｄｏｍｉｎａｎｔｒｅｇｕｌａｔｏｒｕｎｄｅｒｐｒｏｌｏｎｇｅｄｈｅａｔｓｔｒｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ａｌｔｈｏｕｇｈｉｔｓｆｕｎｃｔｉｏｎｒｅ－ｑｕｉｒｅｓｃｏｏｐｅｒａｔｅｗｉｔｈＨｓｆＡ１．ＣｌａｓｓＢＨｓｆｓｍｉｇｈｔｆｕｎｃｔｉｏｎａｓｒｅｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｌａｓｓＡｏｆＨｓｆｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｓｏｍｅＨｓｆｓａｒｅａｌｓｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙｒｅｄｕｎｄａｎｔｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｓｔｕｄｉｅｓｏｎｓｉｎｇｌｅｍｕｔａｎｔｏｆｉｎｄｉｖｉｄｕａｌＨｓｆａｎｄｒｅｓｃｕｅｏｆｙｅａｓｔＨｓｆ１ｌｅｔｈａｌｍｕｔａｎｔ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ＨｓｐｓａｌｓｏａｃｔａｓｎｅｇａｔｉｖｅｆｅｅｄｂａｃｋｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＨｓｆｓ． ＫｅｙｗｏｒｄｓＨｅａｔｓｈｏｃｋｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ（Ｈｓｆｓ），Ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｈｓｐｓ），Ｈｅａｔｓｔｒｅｓｓ，Ａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓ

蛋白质分析数据库

表1蛋白质相互作用分析相关数据库及网站 208

v/Entrez）； （2）在Search后的选择栏中选择protein； （3）在输入栏输入homo sapiens adiponectin； （4）点击go后显示序列接受号及序列名称； （5）点击序列接受号NP_004788 （adiponectin precursor；adipose most abund ant gene transcript 1 [Homo sapiens]）后显示序列详细信息； （6）将序列转为FASTA格式保存（参考上述步骤使用SRS信息查询系统检索人脂联素蛋白质序列）； 2、使用BioEdit软件对人脂联素蛋白质序列进行分子质量、氨基酸组成和疏水性等基本性质分析： 打开BioEdit软件→将人脂联素蛋白质序列的FASTA格式序列输入分析框→点击左侧序列说明框中的序列说明→点击sequence栏→选择protein→点击Amino Acid Composi tion→查看该蛋白质分子质量和氨基酸组成；或者选择protein后，点击Kyte & Doolittle Mean Hydrophobicity Profile→查看该蛋白质分子疏水性水平； 3、人脂联素蛋白质序列的蛋白质同源性分析： （1）进入NCBI/Blast网页； （2）选择Protein-protein BLAST （blastp）； （3）将FASTA格式序列贴入输入栏； （4）点击BLAST； （5）查看与之同源的蛋白质； 4、人脂联素蛋白质序列的motif结构分析： （1）进入http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN网页； （2）将人脂联素蛋白质序列的FASTA格式序列贴入输入栏； （3）点击Scan； （4）查看分析结果（注意Prosite Profile中的motif information）； 5、人脂联素蛋白质序列的二级结构预测： （1）进入下列蛋白结构预测服务器网址： http://www.embl-heidelberg.de/predictprot ein//predictprotein.html （The PredictProtein Server）； （2）在You can栏点击default； （3）填写email地址和序列名称； （4）将人脂联素蛋白质序列的FASTA格式序列贴入输入栏点击Submit； （5）从email信箱查看分析结果；

小麦TaeEF1β基因的克隆、同源性及表达分析

浙江农业学报ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＺｈｅｊｉａｎｇｅｎｓｉｓ?２０１９?３１(１):９８－１０３ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｚｊｎｙｘｂ.ｃｎ陈炫?张天烨?羊健?等.小麦ＴａｅＥＦ１β基因的克隆二同源性及表达分析[Ｊ].浙江农业学报?２０１９?３１(１):９８－１０３. ＤＯＩ:１０ ３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００４￣１５２４ ２０１９ ０１ １３ 收稿日期:２０１８￣０３￣２５ 基金项目:国家自然科学基金(３１５０１６０)?国家农业产业体系(ＣＡＲＳ￣３￣１)?国家小麦转基因专项(２０１６ＺＸ０８００２００１) 作者简介:陈炫(１９９２ )?女?陕西咸阳人?硕士研究生?主要从事植物病理学研究?Ｅ￣ｍａｉｌ:ｖｉｖｉａｎｃｃｘ＠１６３.ｃｏｍ?通信作者?陈剑平?Ｅ￣ｍａｉｌ:ｊｐｃｈｅｎ２００１＠１２６.ｃｏｍ小麦ＴａｅＥＦ１β基因的克隆二同源性及表达分析 陈一炫１?张天烨１?羊一健２?张恒木２?陈剑平２?? (１.浙江农林大学林业与生物技术学院?浙江杭州３１１３００?２.浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所?浙江杭州３１００２１) 摘一要:真核翻译延伸因子(ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ?ｅＥＦｓ)是一种重要的多功能调控蛋白?ｅＥＦ１β是ｅＥＦ１的组成部分?在蛋白质生物合成过程中发挥着重要的作用?本文通过ＲＴ￣ＰＣＲ扩增克隆小麦(ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ.)的ｅＥＦ１β基因?并命名为ＴａｅＥＦ１β?氨基酸同源性分析发现?ＴａｅＥＦ１β具有高度保守性?且其保守结构域位于１３７~２２６ａａ处?ｑＲＴ￣ＰＣＲ结果表明?中国小麦花叶病毒(Ｃｈｉｎｅｓｅｗｈｅａｔｍｏｓａｉｃｖｉ￣ｒｕｓ?ＣＷＭＶ)侵染小麦植株后?可以诱导ＴａｅＥＦ１β基因转录水平的上调表达?另外?本文也进一步分析了ＴａｅＥＦ１β基因在小麦根二茎二叶的表达水平和ＣＷＭＶ侵染不同时间点的表达情况? 关键词:真核翻译延伸因子?中国小麦花叶病毒?同源性分析 中图分类号:Ｓ４３５ １２文献标志码:Ａ文章编号:１００４￣１５２４(２０１９)０１￣００９８￣０６Ｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇ?ｈｏｍｏｌｏｇｙａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＴａｅＥＦ１βｉｎＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ.ＣＨＥＮＸｕａｎ１?ＺＨＡＮＧＴｉａｎｙｅ１?ＹＡＮＧＪｉａｎ２?ＺＨＡＮＧＨｅｎｇｍｕ２?ＣＨＥＮＪｉａｎｐｉｎｇ２?? (１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ?ＺｈｅｊｉａｎｇＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ?Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１１３００?Ｃｈｉｎａ?２.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｉｒｏｌｏ￣ｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ?ＺｈｅｊｉａｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ?Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００２１?Ｃｈｉｎａ) Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ(ｅＥＦｓ)ｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｒｏｔｅｉｎ.ｅＥＦ１βｗａｓｓｕｂ￣ｕｎｉｔｏｆｔｈｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ￣１(ｅＥＦｓ￣１)ｃｏｍｐｌｅｘａｎｄｐｌａｙｅｄａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｐｒｏｔｅｉｎｂｉｏ￣ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ.ＴｈｅｅＥＦ１βｇｅｎｅｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｃｌｏｎｉｎｇｗｉｔｈＲＴ￣ＰＣＲｆｒｏｍｗｈｅａｔａｎｄｎａｍｅｄａｓＴａｅＥＦ１β.ＴｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＴａｅＥＦ１βｗｅｒｅｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｎｄｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎｗａｓｌｏｃａｔｅｄｉｎ１３７￣２２６ａａ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｑＲＴ￣ＰＣＲｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＴａｅＥＦ１βｗｅｒｅｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｔｈｅＣＷＭＶ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄｐｌａｎｔｓ.Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ?ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴａｅＥＦ１βｉｎｔｈｅｓｔｅｍｓ?ｌｅａｖｅｓａｎｄｒｏｏｔｓｏｆｗｈｅａｔａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｇｅｓｏｆＣＷＭＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗａｓａｌｓｏｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｑＲＴ￣ＰＣＲ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ?Ｃｈｉｎｅｓｅｗｈｅａｔｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ?ｈｏｍｏｌｏｇｙａｎａｌｙｓｉｓ 一一真核翻译延伸因子(ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅ￣ｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ?ｅＥＦｓ)最早作为一个对噬菌体Ｑβ 的依赖于ＲＮＡ的ＲＮＡ聚合酶(ＲＮＡ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ?ＲｄＲｐ)活性具有重要作用的辅助因子被发现并鉴定[１]?在真核细胞中包括３类延伸因子?分别为ｅＥＦ１α(ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ１α)二ｅＥＦ１β和ｅＥＦ２[２]?ＥＦ１β在真核生物中的结构比在细菌中更复杂?该蛋白由ＥＦ１β￣ａｌｐｈａ二ＥＦ１β￣ｇａｍｍａ和ＥＦ１β￣ｂｅｔａ三个亚基组成?在蛋白质的合成过程中?ｅＥＦ１β主要作为