鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒三重荧光定
收稿日期：2017-01-19
基金项目：广东省科技计划项目（2013B020307001，2013B020315005，2014A040401048，2015B020203003，2015B050501007，2015B070701015），广东省农业科学院院长基金项目（201412）
作者简介：孙敏华，男，1984.1，湖北荆门人，博士，助理研究员，主要从事水禽病的诊断及疫苗研究。E-mail: smh2002smh@https://www.wendangku.net/doc/63879643.html,
*通讯作者：张春红，女，1969.5，广西桂林人，本科，高级兽医师，主要从事诊断技术及疫苗研究。E-mail: 136********@https://www.wendangku.net/doc/63879643.html,
摘 要： 参考GenBank 上已发表的产蛋下降综合征病毒（EDSV）五邻体（penton）基因序列、H9亚型禽流感病毒的HA 基因和鸭坦布苏病毒（DTMUV）E 基因序列，分别设计了检测EDSV、H9 AIV 和DTMUV 的特异性引物，扩增目的片段大小分别为110bp、281bp 和266bp。通过PCR 验证及引物浓度的优化，建立了针对这3种病毒的三重荧光PCR 检测方法。特异性试验结果表明，该方法可以同时检测EDSV、H9 AIV 和DTMUV，且不与鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒和大肠杆菌基因组DNA 以及鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒和新城疫病毒的RNA发生交叉反应；敏感性试验表明，该方法对EDSV、H9 AIV和DTMUV核酸的检测下限分别为8.0、4.8和1.3个拷贝，该方法比常规PCR 方法敏感10倍；该方法重复性良好，对不同批次的样品扩增效果良好。通过标准曲线的建立以及临床样品的检测表明，该方法可以用于EDSV、H9 AIV 和DTMUV 的定性和定量检测。
关键词：鸭坦布苏病毒；产蛋下降综合征病毒；H9亚型禽流感病毒，三重荧光PCR
中国分类号：S855.3 文献标识码：A 文章编码：1005-8567（2017）04-0037-06
鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒
三重荧光定量PCR 检测方法的建立
孙敏华，李林林，董嘉文，刘志成，孙俊颖，沈海燕，张建峰，张春红*
（广东省农业科学院动物卫生研究所，广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广东省兽医公共卫生公共
实验室，广东 广州 510640）
鸭坦布苏病毒病（Duck Tembusu Virus Disease）是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu Virus，DTMUV）引起的一种急性传染病[1-2]。该病可导致蛋鸭，种鹅在短时间内出现明显的产蛋下降症状，且病程可长达数周。近来，也有蛋鸡和肉鸭感染的报道[3-4]。该病病原属于黄病毒科（Flaviviridae），黄病毒属（Flavivirus），坦布苏病毒（Tembusu virus）。尽管该病死亡率不高，但病程长，潜在危害巨大。鸭坦布苏病毒基因组长约11 kb，顺序为5'-C-prM-E- NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3' [5]，其中NS5非常保守。
产蛋下降综合征（Egg Drop Syndrome , EDS）是由禽腺病毒引起的，导致种蛋禽产蛋量下降的一种传染病。该病毒仅有一个血清型，主要引起种鸡的产蛋性能下降，同时其的自然宿主还包括鸭和鹅，并且也有引起鸭产蛋下降，蛋壳变粗糙、软化和变薄的报道[6]。该病能够垂直传播，因此准确检测种禽的带毒及发病情况有助于减少由此带来的经济损失。
H9亚型禽流感病毒（H9 Subtype AIV）通常可由禽类携带，大部分野鸟感染后一般不出席临床症状，但可导致鸭产蛋下降，而鸡则可以表现出呼吸道、消化道、泌尿生殖器官的病变（通常表现为产蛋下降）[7]。
本研究针对引起蛋种禽产蛋下降常见的鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒，建立了一种能够同时检测这三种病原的荧光定量PCR 检测方法，为产蛋下降病原的快速诊断提供了物质基础。
1 材料和方法
1.1 病毒
鸭坦布苏病毒JM株、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒由本研究室保存。
1.2 试剂
One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit II、DNA分子量标准、pMD18-T载体、Takara MiniBEST DNA/RNA提取试剂盒，胶回收试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，DH5α感受态购自天根公司，其它试剂均为分析纯。
1.3 引物设计与合成
下载GenBank中鸭坦布苏病毒全基因序列、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒基因序列，利用Oligo 6.0设计针对它们保守区域的特异性引物。引物由Invitrogen公司合成，序列见表1。
表1 三重PCR特异性引物
引物名称引物序列（5’→3’）片断
大小（bp）
DTMUV 954-U GCTTCAGCTGTCTGGGGATGCAGAAC
266 DTMUV 1194-L AGCATAAGTTGCCTTGGGATTATGAG
EDS-488U AGGTGTCTGATATTGGAGTG
110
EDS-578L TGGATGAAACGCTTTATAAG
H9-1027U GCCATAGCTGGATTCATAGA
281
H9-1288L AACTCTGCATTRTATGCCCA
1.4 病毒核酸扩增及标准品构建
根据Takara MiniBEST DNA/RNA试剂盒说明书分别提取鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒的核酸，利用这三种病毒特异性引物分别对基因序列进行扩增。PCR反应体系见表2。PCR反应条件为：42 ℃ 10 min，94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 sec，55 ℃ 30 sec，72 ℃ 30 sec，30 cycles；72 ℃ 10 min。经1 %琼脂糖凝胶电泳，胶回收，与pMD18-T载体连接，转化DH5α后，PCR鉴定为阳性的菌液，由Invitrogen公司进行序列测定。所获得的阳性质粒分别命名为pDTMUV、pEDS和pH9，并测定质粒的浓度。
1.5 三重荧光PCR 方法的建立 将DTMUV、EDSV和H9 AIV的上下游引物（每条引物的浓度均为10 μM）分别等体积混合后，在25 μL PCR反应体系内，三种病毒检测引物（上下游混合物）的终浓度均为20 pmol，每种病毒核酸量均为1μL（反应体系见表3），然后按照如下条件进行反应：42 ℃ 5 min；95 ℃ 10 sec；95 ℃ 5 sec，55 ℃ 10 sec，72 ℃ 10 sec，45 cycles（在每个延伸时采集荧光信号）；再进行95 ℃ 180 sec，40 ℃ 240 sec，95 ℃ 1 sec的融解曲线分析程序（连续采集荧光信号）。确定该反应体系下能否扩增出这3种病毒的核酸。
表2 PCR扩增DTMUV、EDSV和H9 AIV核酸的反应体系PCR反应成分体积
2× Ex Taq premix10μL DTMUV 954-U/EDS-488U/H9-1027U(10μM each)1μL DTMUV 1194-L/EDS-578L/H9-1288L(10μM each)1μL
DNA/cDNA2μL
dH2O6μL
表3 三重荧光PCR扩增DTMUV、EDSV和H9 AIV核酸的反应
体系
荧光PCR反应成分体积
2×One Step SYBR RT-PCR Buffer 412.5μL
PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 21μL
DTMUV 954-U+EDS-488U+H9-1027U
(10μM each)
1μL+1μL+1μL DTMUV 1194-L+EDS-578L+H9-1288L
(10μM each)
1μL+1μL+1μL
RNA/DNA1μL
Rnase Free dH2O 4.5μL
1.6 引物浓度的优化
将每种病毒特异性上下游引物（10 μM）等体积混合后，按照0.4 μL、0.8 μL和1.6 μL 共3个加样体积，即4 pmol、8 pmol和16 pmol 这三种不同含量进行组合，确定最佳引物含量。随后在引物含量最佳的条件下，对单个病毒核酸以及不同组合的核酸进行单一或者多重检测，以验证引物的效果。
1.7 特异性
将本实验室保存的鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒和大肠杆菌基因组DNA，以及鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒和新城疫病毒RNA进行多重荧光PCR反应，以验证所建立方法是否与这些病毒的核酸之间存在交叉反应。
1.8 敏感性和重复性
提取1.4中构建好的pDTMUV、pEDS和pH9质粒，经DNA浓度测定后，按照质粒拷贝数计算公式。即，拷贝数（copies/μL）=6.02 × 1023 （copies/mol）×质粒浓度（g/μL）/（碱基数）×660 （g/mol）。随后，将质粒分别用超纯水10倍倍比稀释，即从10-1一直稀释到10-11后，取10-6-10-11这6个梯度的质粒进行敏感性试验。随后，取10-5-10-10这6个梯度的质粒进行3个重
复，确定方法的重复性。同时，利用单个引物进行常规PCR扩增，比较三重定量PCR方法与常规PCR方法的敏感性差异。
1.9 临床样品检测
将本研究室保存的40份DTMUV泄殖腔拭子和2份EDSV、H9 AIV阳性病料的核酸，进行三重荧光PCR验证。
2 结果
2.1 DTMUV、H9 AIV和EDSV的扩增
经PCR扩增、1 %琼脂糖凝胶电泳及DNA序列测定，证实所使用的引物能够特异性扩增各自对应的病毒核酸（图1）。
2.2 三重荧光PCR 方法的建立
经荧光PCR反应及融解曲线分析，可以发现该方法能够扩增EDSV、H9 AIV和DTMUV 的核酸，融解曲线分析显示所扩增产物的Tm值分别接近81 ℃、84 ℃和87 ℃（图2，图3，图4）。经10份样品重复验证，并按照Tm平均值±3倍标准差来确定三种产物的Tm值范围，结果显示EDSV、H9 AIV和DTMUV扩增产物Tm值范围分别为：81.2±0.5，83.8±0.4，86.9±0.5。
2.3 引物最佳浓度筛选
在4 pmol、8 pmol和16 pmol这三种不同引物含量的排列组合下，最终确定DTMUV最佳引物含量为4 pmol，EDSV 最佳引物含量为8 pmol，
图1图2图3图4
图5
图6
H9 AIV 最佳引物含量为16 pmol。在此情况下，可以检测出任意两种或者3种病毒核酸的混合样品（图5，图6，图7，图8）。经1 %琼脂糖凝胶电泳证实，所有融解曲线分析结果与电泳结果完全一致。
2.4 三重荧光PCR 方法的特异性
经三重荧光PCR 验证，鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒和大肠杆菌基因组DNA，以及鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒和新城疫病毒RNA 不与EDSV、H9 AIV 和DTMUV 特异性引物发生交叉反应，即不出现明显的S 型扩增曲线（图9）；同时融解曲线分析显示，EDSV、H9 AIV 和DTMUV 分别在81 ℃、84 ℃
和87 ℃左右出现明显的融解峰（图10）。因此
综合扩增曲线和融解曲线的结果确定，三重荧光PCR 方法的特异性良好。
2.5 三重荧光PCR 方法的敏感性和重复性 经DNA 浓度测定，pEDS 质粒浓度为247 ng/μL，pH9质粒浓度为156 ng/μL，pDTMUV 质粒浓度为425 ng/μL，经计算确定这三个质粒的拷贝数分别为8.0×1010 copies/μL、4.8×1010 copies/μL、1.3×1011 copies/μL。通过三重荧光PCR 方法与常规PCR 方法对上述质粒10-5～10-10稀释度后的核酸进行检测下限比较发现，本研究所建立的三重荧光PCR 方法对EDSV 核酸的检测下限为8.0个拷贝（图11），对H9 AIV 核酸的检测下限为4.8个拷贝（图12），对DTMUV 核酸的检测下限为1.3个拷贝（图13），这比常规PCR 方法敏感10倍。取10-5～10-10这6个稀释度的质粒进行3重复PCR 反应并建立标准曲线后，结果显示，图14中8.0×105～8.0拷贝的pEDS 质粒平均Cq 值分别为15.12±0.11、18.17±0.14、21.42±0.12、24.63±0.08、28.15±0.34和31.64±0.27。图15中4.8×105～4.8拷贝的pH9质粒平均Cq 值（或称Ct 值）分别为：
图7
图9
图11
图12
图13
图10
图8
15.94±0.24、19.30±0.21、22.86±0.20、26.62±0.76、29.95±0.10和33.84±0.60；图16中1.3×106～1.3×101拷贝的pDTMUV质粒平均Cq值分别为：13.35±0.19、16.65±0.10、20.13±0.04、23.55±0.11、26.90±0.14和30.80±0.41；通过线形回归证实，标准曲线的扩增效率分别为2.08，1.87和2.03；R2分别为0.99，0.98和1.00；线形回归方程的斜率分别为-3.14，-3.68和-3.26，Y轴的截距分别为37.13，36.55和36.87。
2.6 临床样品检测
40份DTMUV泄殖腔拭子经过三重荧光PCR检测及融解曲线分析后发现，阳性样品数为31份，阴性样品数为9份；常规PCR检测及电泳结果显示阳性样品数为26份，阴性样品数为14份。2份EDSV、H9 AIV阳性病料的核酸与常规PCR符合率为100 %。
3 讨论
鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒均能感染蛋鸡、鸭和鹅，并导致产蛋下降。由于这3种病毒危害的宿主范围较广，因此，快速检测引起产蛋下降的病原具有重要的临床意义。目前，曾婷婷等[8]已经建立了检测坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒的二重荧光定量RT-PCR方法，其敏感度比普通PCR高10～100倍。而三重检测方法还未见报道。
本研究设计了针对EDSV的penton基因、H9 AIV的HA基因和DTMUV的E基因的特异性引物，通过常规PCR和荧光PCR验证，证实所设计的引物对这3种病毒的核酸均能获得较好地扩增。荧光PCR融解曲线分析显示EDSV、H9 AIV和DTMUV 扩增产物的Tm值范围分别为：81.2±0.5，83.8±0.4和86.9±0.5。通过在不同型号的荧光定量PCR仪上进行反应发现，不同仪器之间的产物Tm值存在一定差异，这可能和仪器自身的参数有关。因此，在进行结果判定时，必须结合质粒标准品的Tm值来进行确认，并且必须是扩增曲线和Tm值均为阳性才能判定为阳性结果。
通过棋盘法，最终确定DTMUV最佳引物含量为4 pmol，EDSV最佳引物含量为8 pmol，H9 AIV 最佳引物含量为16 pmol。在此条件下，所建立的三重荧光PCR方法不仅能够扩增EDSV、H9 AIV 和DTMUV其中任何一种核酸，而且对任意组合的核酸样品均能获得良好的扩增，这为检测产蛋下降病例的病原提供了分子生物学的手段。特异性试验表明，所建立的三重荧光PCR方法不与鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒和大肠杆菌基因组DNA，以及鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒和新城疫病毒的RNA发生交叉反应，证实该方法特异性良好。敏感性试验结果表明，所建立的三重荧光PCR方法对EDSV、H9 AIV和DTMUV核酸的检测下限分别为8.0、4.8和1.3个拷贝，该方法比常规PCR方法敏感10倍。重复性试验结果表明，三重荧光PCR方法重复性良好，每10倍稀释标准品的平均Cq值之间差接近3.3，并且标准曲线的R2均大于0.98。通过建立线形回归方程，本研究所建立的三重荧光PCR 方法不仅可以进行病原的定性，还能对EDSV、H9 AIV和DTMUV的核酸进行绝对定量。
通过对临床样品的检测证实，三重荧光PCR 方法比常规PCR具有更高的敏感性，因此在检测
图14图15图16
早期感染时具有明显优势。该方法具有操作简单、快速，提高检测效率、缩短检测周期、降低检测成本等优势，具有较好的临床检测应用前景。
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