灵芪加口服液对心脾两虚小鼠益气宁心安神功效研究

失眠是以经常不能获得正常睡眠为特征的一类疾病，主要的3个核心表现为入睡困难、睡眠维持困难和早醒。流行病学调查结果显示，中国普通成年人中失眠的患病率在9.2%-11.2%[1]。长期失眠对人们的生活造成了严重影响，并可产生各种负性情绪甚至诱发疾病。失眠在中医上称为“不寐”，《景岳全书·不寐》：“劳倦、思虑太过者，必致血液耗亡，神魂无主，所以不眠”，劳倦太过则伤脾，脾虚运化失常，气血生化乏源，不能上奉于心，以致心神失养而失眠。故临床从心、脾治疗失眠，以补气健脾、滋养营血、宁心安神为治法治疗心脾气血不足型失眠。

目前临床用药灵芪加口服液，具有扶正固本，滋补强壮，宁心安神之功效；用于治疗心脾两虚所导致的心悸失眠、倦怠乏力、食少便溏。根据中医“方-证-效”的研究思路，本研究以小鼠每日负重游泳法复合药物诱导建立小鼠心脾两虚证候模型，观察灵芪加口服液对心脾两虚小鼠的干预作用，对该复方宁心安神的功效进行研究，为临床应用提供实验依据。

1?材料

1.1实验动物

ICR小鼠，雌雄各半，由斯贝福（北京）实验动物科技有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2011-0004。

1.2药品

灵芪加口服液，本实验用其浓缩浸膏（中间品），生药2.89 g?mL-1（黑龙江珍宝岛药业股份有限公司，批号：20120301）。人参归脾丸，9 g/丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号：2010441）。盐酸普萘洛尔片，10 mg/片（山西云鹏制药有限公司，批号：B120302）。利血平，1 mg/支（上海医科大学

灵芪加口服液对心脾两虚小鼠益气

宁心安神功效研究＊

徐立1，宋文婷1，韩冰2，范晓迪1，韩杰2，王光蕊1，刘建勋1＊＊

（1.中国中医科学院西苑医院 北京 100091；2.黑龙江珍宝岛药业股份有限公司 哈尔滨 158100）

摘?要：目的：通过观察灵芪加口服液对心脾两虚小鼠体质量和行为学等指标的影响，评价灵芪加口服液益气宁心安神功效。方法：小鼠每日负重游泳法复合药物诱导建立小鼠心脾两虚证候模型，并检测其体质量、摄食量、肠推进，以及悬尾和游泳不动时间、睡眠行为学实验及脑神经递质含量测定。结果：小鼠每日负重游泳法复合药物诱导形成心脾两虚证候模型，模型组小鼠体质量下降，摄食减少，游泳不动时间和悬尾不动时间延长，肠推进亢进，入睡时间、苏醒时间明显缩短，脑神经递质含量减少；灵芪加口服液可明显改善以上实验指标。结论：灵芪加口服液改善心脾两虚所致失眠的药效学作用可能与其益气、宁心安神之功效密切相关，同时脑神经递质的改变可能是其发挥益气宁心安神功效的物质基础。

关键词：灵芪加口服液心脾两虚益气宁心安神功效研究

doi：10.11842/wst.2015.07.006 中图分类号：R285.5 文献标识码：A

收稿日期：2015-04-02

修回日期：2015-06-02

＊ 国家重点基础研究发展计划“973计划”（2015CB554405）：气血相关理论的生物学基础研究，负责人：刘建勋；中国中医科学院科技创新团队（YS1303）：中药药效学研究与评价创新团队，负责人：刘建勋。

＊＊　通讯作者：刘建勋，本刊编委，研究员，博士生导师，主要研究方向：中药药理及药效物质基础。

红旗制药厂，批号：20000601）。

1.3HPLC-ECD试剂

去甲肾上腺素（NE），批号：1244195；多巴胺（DA），批号：BCBC7614V；3，4-二羟基苯乙酸（DOPAC）、高香草酸（HVA）、5-羟色胺（5-HT），批号：070M5162V；5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）、磷酸二氢钠（NaH2PO4），批号：054K0144；柠檬酸（CA），批号：058K0033；乙二胺四乙酸四钠盐（EDTA），批号：10K0240（均为AR级美国Sigma公司产品）。辛烷基磺酸钠（OSA），批号：1076225，HPLC级（美国Sigma公司）。乙腈（ACN），批号：116824，HPLC 级；（均为美国Fisher Scientific公司产品）。高氯酸（HClO4），批号：20060033，国产AR级（天津市鑫源化工厂）；硫代硫酸钠（Na2S2O5），均为国产AR级。

1.4仪器

16通道Coularray库仑阵列电化学高效液相色谱仪及色谱工作站、5600A电化学检测器、582二元泵体系、542自动进样器、6210碳石墨电极、CH150型柱温箱（均为美国ESA公司）。色谱柱，C18反相柱（Waters Symmetry 3.9×150 mm 5 μm，美国Waters 公司）。离心机MIKRO 22R（德国Hettich公司）。低温冰箱（法国JOUAN公司）。针筒式微孔滤膜过滤器，（0.22 μm水系膜，天津腾达过滤器厂）。

2?方法

2.1造模及给药方法

除对照组外，所有小鼠每日负重游泳（1 g/只），直至力竭为止。力竭采用2次游泳法，前后相差10 s，以最大限度地耗竭动物的体能。力竭标准为动物明显失调、慌张，鼻部在水面上下浮动，头没入10 s不能上浮。筛选出体质量下降小鼠分组，每组5只，分别为：对照组、模型组、人参归脾丸丸重5.00 g?kg-1组、灵芪加生药2.50 g?kg-1组、灵芪加生药5.00 g?kg-1组，灵芪加生药10.00 g?kg-1组。实验第8天开始灌胃给药，给药体积20 mL?kg-1；实验第11天，在负重游泳的基础上，每日灌服心得安溶液20.00 mg?kg-1（2.00 mg?mL-1，10.00 mL?kg-1），皮下注射利血平0.50 mg?kg-1（10.00 mL?kg-1），连续给药4天。

2.2体质量及摄食量测定

于给药前、给药第4天和给药第7天测定小鼠体质量，并每笼投料100 g，投料后24 h测定余料质量，计算每只小鼠的平均摄食量[小鼠每只的平均

摄食量=（投料量-余料量）÷5]。

2.3睡眠时间测定

末次给药后60 min，60只小鼠腹腔注射0.5%戊巴比妥钠，秒表记录小鼠从注射到翻正反射消失的时间（入睡时间），翻正反射消失至自主翻身的清醒时间（睡眠时间）。

2.4悬尾不动时间和游泳时间测定

60只小鼠末次给药后45 min，测定小鼠5 min 内悬尾的不动时间，及游泳时间（头部没入水中10 s不能上浮的时间）。

2.5肠推进实验

测定前24 h禁食不禁水。次日给药45 min后，对小鼠脱颈处死，打开腹腔，将消化道自幽门至回盲部完整摘出，不加牵引平铺于玻璃板上，测定其全长并记录碳末的前沿到幽门的距离，计算其与肠道全长的百分比。

2.6测定单胺类神经递质

末次测定小鼠摄食量后断头取脑，冰台上迅速取出全脑，称重，液氮快速冷冻，-80℃保存。测定时全脑置4℃预冷的0.15 M高氯酸中匀浆20 s（每0.1 g脑重加入0.15 M高氯酸1 mL）。脑匀浆液于4℃离心机，15 000 rpm，离心20 min。上清液以0.22 μm 水系膜滤过后分装，-80℃冻存。流动相配制：称取磷酸二氢钠5.40 g，柠檬酸2.40 g，再加入0.25 mL的100 μM EDTA水溶液，溶解于约300 mL超纯水中。上述溶液以0.22 μm的水系膜过滤，滤过液中加入0.18 g的辛烷基磺酸钠，50 mL乙腈，滤过后以双蒸水定容至500 mL。色谱条件：流速0.6 mL?min-1，电势：-150，+450，+500，+550 mV，柱温为室温。自动进样器每次进样10 μL，以峰面积计算浓度。2.7统计学方法

实验数据以均数±标准差

表示，采用软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齐时采用Student-Newman-Keuls检验，方差不齐采用Tamhane’s T2（M）检验。P<0.05认为差异性有统计学意义。

3?结果

3.1灵芪加口服液对心脾两虚小鼠体质量的影响

小鼠负重游泳第8天（即给药前），各组雌性和雄性小鼠与对照组相比，体质量均明显下降（P<0.01），并持续至负重游泳第15天（即给药后

7天）。给药后4天，人参归脾丸和灵芪加口服液生药5，10 g ?kg -1明显抑制雄性小鼠体质量下降（P <0.05），人参归脾丸可明显抑制雌性小鼠体质量下降（P <0.05）。给药7天，人参归脾丸和灵芪加口服液低、中、高3个剂量均可明显抑制雌性小鼠体质量下降（P <0.01），灵芪加3个剂量还可明显抑制雄性小鼠体质量下降（P <0.05），结果见表1、表2。3.2 灵芪加口服液对心脾两虚小鼠摄食量的影响

负重游泳8天后（给药前），雌性小鼠摄食量无

明显变化，雄性小鼠摄食量减少。给药后4-7天，

模型组雄性小鼠摄食量维持低水平；雄性小鼠：与模型组相比，灵芪加组和人参归脾丸组摄食量明显增加。雌性小鼠：与对照组相比，模型组摄食量逐渐减少；与模型组相比，灵芪加组和人参归脾丸组摄食量明显增加，结果见表3、表4。

3.3 灵芪加口服液对心脾两虚小鼠睡眠时间的影响与对照组比较，模型组小鼠出现懒动、力竭，入

睡时间明显缩短，苏醒时间明显加快（P <0.01）。给药后，与模型组相比，人参归脾丸组和灵芪加3个剂量组小鼠体力明显增强，人参归睥丸组入睡时间

表1?对心脾两虚雄性小鼠体质量的影响（

）注：与对照组比较，表2?对心脾两虚雌性小鼠体质量的影响（

）注：与对照组比较， 表3?

灵芪加口服液对心脾两虚雄性小鼠平均摄食量的影响表4?

灵芪加口服液对心脾两虚雌性小鼠平均摄食量的影响

明显延长（P<0.05）。与模型组相比，灵芪加组生药5，10 g?kg-1组小鼠苏醒时间明显延长（P<0.05），结果见表5。

3.4灵芪加口服液对心脾两虚小鼠悬尾不动时间的影响

与对照组相比，模型组小鼠悬尾不动时间明显延长（P<0.01）。与模型组相比，给药各组小鼠悬尾失望不动时间均明显缩短（P<0.05），其中人参归脾丸组和灵芪加10.00 g生药组差异性最为明显（见表6）。

3.5灵芪加口服液对心脾两虚小鼠游泳时间的影响

与对照组相比，模型组小鼠出现懒动、搭眼，游泳时间明显缩短（P<0.01）。给药后，与模型组相比，人参归脾丸组和灵芪加组生药5，10 g?kg-1组小鼠游泳时间明显延长（P<0.05）；与模型组相比，灵芪强生药2.5 g?kg-1组游泳时间未见延长（见表7）。

3.6灵芪加口服液对心脾两虚小鼠肠推进的影响

与正常组相比，模型组小鼠造模后表现出现懒动、搭眼，每日排软便或稀便，肠推进程度明显增加（P<0.01）。给药后，与模型组相比，人参归脾丸组和灵芪加3个剂量组小鼠肠推进程度明显减弱（P<0.05），结果见表8。3.7灵芪加口服液对脑内单胺类神经递质的影响

对浓度25，50，100，200，400 ng?mL-1的混合标准品溶液分别进样分析，计算各标准品的峰面积值，以峰面积值对浓度进行回归分析，获得标准曲线（通过原点），NE的r=0.999 9，5-HT的r=0.999 0，DA的r=0.999 3，表明每种单胺类递质在0-400 ng?mL-1有很好的相性关系。研究发现，与对照组相比，模型组小鼠体内单胺类神经递质NE、DA和5-HT水平明显降低（P<0.01）。与模型组相比，人参归睥丸组和灵芪加3个剂量组的NE、DA和5-HT水平均显著升高（P<0.01）（表9）。

4?讨论

目前现代医学治疗失眠多以人工合成的镇静催眠药为主，包括苯二氮卓类、非苯二氮卓类、巴比妥类3种类型，但副作用较大，容易产生药物依赖性或肝肾功能损伤，临床应用有诸多局限。中医药治疗失眠历史悠久，且疗效显著，毒副作用少，无成瘾性，具有独特的优势，在失眠防治中具有不可替代的作用。中医学认为，正常睡眠需要人体阴阳气血的协调和脏腑功能的正常运转。失眠的病因虽多，

表5?灵芪加口服液对心脾两虚小鼠睡眠时间的影响?

（，n=10

）

注：与对照组比较，

0.05，##P<0.01。

表6?灵芪加口服液对心脾两虚小鼠失望不动时间的影响?

（，n=10

）

注：与对照组比较，

0.05，##P<0.01。

表7?灵芪加口服液对心脾两虚小鼠游泳时间的影响?

（，n=10

）

注：与对照组比较，

0.05，##，P<0.01。

表8?

n=10

）

注：与对照组比较，

0.05，##P<0.01。

但其病理变化总属阳盛阴衰，阴阳失交。临床上可分为虚证、实证和虚实夹杂3类。古代医家非常重视从心脾两虚、心胆气虚和心肾不交等虚证方面对不寐的治疗。近10年通过对失眠中医辨证文献资料进行证候规范及计量分析，发现66个证候类型中出现频率前3位的证候是心脾两虚证、痰火扰神证、肝郁气滞证[2]。基于对中国20家三甲综合医院信息管理系统中总共1 081例诊断为失眠患者的诊疗信息进行整合分析，发现失眠患者中医证型以虚证为多，尤其以心脾两虚证居多[3]。临床表现主要可见食少、体倦、面色无华、心悸、失眠、多梦等症状。正如汉代张仲景提出“虚劳虚烦不得眠”。由于劳倦太过则伤脾，脾伤则食少，纳呆，气血生化乏源，不能上奉于心，以致心神失养而失眠。

现代医学研究的失眠动物模型，主要通过剥夺动物的睡眠或干扰睡眠的相关脑区或物质建立[4]，而中医证候失眠动物模型的研究刚起步，朱洁等[5]建立了肝郁失眠大鼠模型，并进行宏观体征观察、行为学评价以及脑神经递质的检测等。本研究采用小鼠负重游泳复合心得安、利血平建立中医心脾两虚的小鼠证候模型，通过中医诊法所涉及的体重，饮食量，疲劳和抑郁状态，睡眠质量等作为气虚的客观化、计量化检测指标[6]，建立“虚劳虚烦”、“心神失养”所致失眠模型。实验结果表明负重游泳及造模给药后导致模型小鼠出现体重下降、饮食减少、悬尾及游泳不动时间延长、肠推进亢进及睡眠时间缩短及苏醒快等症状，表现出心脾两虚的症候特点。

本研究依据中医辨证论治理论思想，通过补益小鼠心脾之气来改善失眠，以扶正固本，滋补强壮，宁心安神为治法，给予灵芪加口服液治疗；通过观察小鼠各气虚指标及小鼠睡眠的改善情况评价中药复方的疗效及中医功效作用。

给药后，实验结果显示：灵芪加口服液3个剂量均可明显抑制雌性和雄性小鼠体重下降、抑制摄食量的下降及肠推进亢进，可显著缩短小鼠悬尾失望不动时间，延长游泳时间及入睡时间；灵芪加口服液生药5,10 g/kg组小鼠苏醒时间明显延长。结果表明灵芪加口服液可改善心脾气虚之体轻、食少、乏力倦怠、失眠等症状，这与该复方具有益气宁心安神之功效密切相关。

现代医学认为大脑皮层细胞调控“兴奋”和“抑制”的平衡状态被打破是失眠发生的机制，该平衡被打破主要与某些中枢神经结构功能异常以及与调节睡眠相关的神经递质和细胞因子等活动异常密切相关。近些年大多数研究表明失眠多与神经递质相关，如单胺类神经递质5-HT、NE、DA参与睡眠机制的调节，任何一种物质含量的变化及不同递质间比例的失调都会影响它们之间的平衡关系而导致失眠[7，8]。本研究检测了调节睡眠相关的神经递质：NE、5-HT、DA，灵芪加3个剂量组的单胺水平可显著增高，使其恢复接近至正常水平，达到“阴平阳秘”的一种状态。结果表明，在心脾两虚小鼠证候模型上，脑神经递质NE、5-HT和DA增加可能是灵芪加口服液发挥益气宁心安神功效的机制之一，同时心脾两虚失眠可能与脑神经递质的改变密切相关。

综上，本研究在小鼠负重游泳复合心得安+利血平方法复制了中医心脾两虚的小鼠证候模型。通过灵芪加口服液的干预作用，发现其可改善心脾两虚小鼠的相关指标，可增加模型小鼠的体重、摄食量，减少其绝望情绪，抑制肠推进亢进，延长睡眠时间等，证明灵芪加口服液具有治疗心脾两虚所导致的失眠、便溏、抑郁、疲劳等药效学作用，其机理可能是通过纠正心脾两虚所致的脑内神经递质水平降低发挥药物益气宁心安神之功效。

表9?灵芪加口服液对心脾两虚小鼠脑内单胺类神经递质的影响（，n=10

）注：与对照组比较，

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4 李海静,高月,刘萍,等.失眠动物模型研究进展.中国药理学通报. 2007, 23(4): 437-440．

5 朱洁,申国明,汪远金,等.肝郁证失眠大鼠模型的建立与评价.中

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7 Steiger A. Neurochemical regulation of sleep. J Psychiatr Res, 2007, 41(7): 537-552．

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Study on Qi-supplementing and Mind-tranquilizing Efficacy of Ling-Qi-Jia Oral Solution

on Heart-spleen Deficiency Mouse

Xu Li1, Song Wenting1, Han Bing2, Fan Xiaodi1, Han Jie2, Wang Guangrui1, Liu Jianxun1

(1. Xiyuan Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100091, China;

2. Heilongjiang Treasured Island Pharmaceutical Co. Ltd., Heilongjiang 158100, China)

Abstract: This study was aimed to observe the body weight and behavioral changes of heart-spleen deficiency mouse and to assess the efficacy of Ling-Qi-Jia(LQJ) oral solution on qi-supplementing and mind-tranquilizing. The heart-spleen deficiency syndrome mouse model was established by using loading swimming and drug daily. The body weight, food consumption, intestine propulsion, tail suspension test(TST), forced swimming test (FST), sleeping time and the amount of brain neurotransmitter were detected. The results showed that mouse suffered loading swimming and drug formed heart-spleen deficiency syndrome model, which were indicated by lowering body weight and food consumption, shortened time in FST, prolonged accumulative immobility time in TST, intestine propulsion hyperfunction, shortened sleeping time and lowering brain neurotransmitter amount. LQJ oral solution can obviously improve experiment indexes mentioned above. It was concluded that LQJ oral solution, which can improve insomnia due to heart-spleen deficiency, might had close relation to the efficacy of qi-supplementing and mind-tranquilizing. Meanwhile, changes of brain neurotransmitters might also be the material basis on its efficacy.

Keywords: Ling-Qi-Jia oral solution, heart-spleen deficiency, qi-supplementing and mind-tranquilizing, efficacy study

（责任编辑：朱黎婷　张志华，责任译审：王　晶）参考文献