BD Accuri C6用户指南

科学已很复杂，流式要更简单！

1. CFlow软件介绍

你可以通过Accuri CFlow或者CFlow Plus软件控制C6流式细胞仪，实现数据获取，生成统计数据以及分析结果等操作。CFlow功能强大，而且简单易用。

CFlow软件具有以下特性：

有收集，分析，统计三个查看面板。

Plots可以显示超过106的数据动态范围。

可以随时进行数据分析和补偿调节。

可以拖拉plots。

以FCS 3.0格式输出文件。

C6格式数据可以准确无误的转换为FCS格式数据。

1.1 安装CFlow

这样安装CFlow:

1. 确保没有用USB连接计算机和C6流式细胞仪。

2. 打开计算机和显示器。

3. 插入CFlow软件CD光盘或者Accuri提供的U盘，当准备完毕，双击

CFlowInstaller.exe文件。

4. 按照安装向导的提示进行安装。

1.2 启动CFlow

先安装并设定好C6流式细胞仪，再运行CFlow软件（请参考C6 Flow Cytometer 安装手册）。

这样打开CFlow软件：

1. 双击计算机桌面上的CFlow图标，CFlow会打开一个新的空白的工作面板。

注意：如果CFlow显示信息Extra startup time needed due to cleaning or improper shutdown, C6会比平时多用几分钟完成恢复，然后回到绿灯准备完毕状

态。当对仪器进行首次安装时，你可能会遇到这种情况。如果不小心关闭仪器电源，也会出现这种情况。

1.3 CFlow工作面板（Workspace）

CFlow的主工作窗口叫做CFlow Workspace，这个工作面板包含获取和分析数据所需的所有控制以及显示功能面板。CFlow工作面板分为三个控制面板：

收集面板（Collect）—包括设定数据收集以及数据获取条件的控制命令（第3

章有详细说明）。

分析面板（Analyze）—包含数据分析的控制命令（第4章有详细说明）。

统计面板（Statistics）—显示统计学信息（第5章有详细说明）

1.4 打开一个新的CFlow工作面板

当打开CFlow，会显示一个不带任何用户设置的空白工作面板，你可以使用这个新的工作面板来建立自己的分析模板。

这样打开新的工作面板：

1. 做下列操作之一：

如果CFlow还没打开，双击计算机桌面上的CFlow图标。

如果CFlow已经打开了，选择File>N ew CFlow File。CFlow会提示你保存对之前工作模板所做的任何未保存的改动。

1.5 退出CFlow

这样退出CFlow：

1. 选择File>Q uit

2. 如果被提示保存对CFlow工作模板所做的改动，做下列操作之一：

点击Y es按键保存改动。

点击N o按键关闭CFlow，不做改动。

点击Cancel按键，取消操作，保持CFlow软件打开状态。

1.6 使用CFlow示例文件

你可以从Accuri网站上（https://www.wendangku.net/doc/6e917682.html,/tec h nical in f ormation/tutorials）下载一个对人外周血进行4色分析的CFlow示例文件（H PB4 Color T utorial.c6）。你可以使用此文件数据来熟悉CFlow的各个操作工具，而不用担心破坏或者丢失自己的实验数据。本用户指南中所展示的图片，都是来自于对这个示例文件数据的分析。

这样生成示例文件：使用四管样本来进行CD3+CD4+以及CD3+CD8+细胞群体分析。按照标准方法对这些外周血样本直接进行抗体标记，然后裂解红细胞。

下面的表格描述了实验设计：

T u b e1—背景对照。

T u b e2—白细胞设门对照。

T u b e3—确定CD45+CD3+亚群细胞内CD4+和CD8+细胞百分比的对照。

T u b e4—样本。

表1-1. 人外周血4色分析示例的实验设计

此实验设计不包含单染荧光对照，唯一可能存在荧光溢出导致设门不准的情况来自FI T C通到漏到P E通道，以及P E-Cy7通道漏到FI T C和P E通道。关于调节荧光补偿的细节，请看3.12章节。

2. 校准C6性能

当使用C6时，每天至少保证校准一次液流，这样可以确保在进行实验样本检测时C6工作状态正常。每天使用同样的CFlow文件来收集校准小球的数据，这样你就可以比较机器状态随时间的变化。当运行校准程序时，将下一行空样本孔的A-D设为8-Peak小球检测孔，将空样本孔的E-H设定为6-Peak小球检测孔。在命名时，将日期包含在样本名字中，这样

你就可以追踪每日机器状态。当样本孔设定满之后，再打开一个新的校准文件继续。

需要的试剂：

8-peak校准小球（Accuri Part#Q A-100，随C6仪器一起到货）。

6-peak校准小球（Accuri Part#Q A-110，随C6仪器一起到货）。

鞘液：过滤去离子水（0.2μm滤膜），Bacteriostatic Concentration Solution（8-peak 校准小球（Accuri Part#KR-220，随C6仪器一起到货）

2.1 运行校准小球

这样运行校准小球：

设定：

1. 如果这是第一次运行C6，打开一个CFlow文件，在上样针处放一管过滤去离子

水，运行至少15分钟。

2. 确认被命名为CFlow 8& 6 Peak Bea d T emplate.c6t的文件已被拷贝到CFlow

计算机上，这个文件位于CFlow CD或者U盘上，也可以从Accuri网站上获取：

https://www.wendangku.net/doc/6e917682.html,/tec h nical_in f ormation/templates/

3. 选择File>O pen CFlow File or T emplate。

4. 在打开的对话框中，找到并打开模板文件。

图2-1. 打开模板Bead Template。

清洗上样针：

5. 点击A-D行的第一个空样本孔。

图2-2. 选择空样本孔。

6. 在上样针处放置一个空的12x75mm的管子。

7. 点击Back f lus h按键。

8. Back f lus h结束后，在上样针处放一个装有2 m L过滤去离子水的新管子。

9. 在仪器控制面板取消R un Unlimite d选项。

图2-3. 运行限制：取消Run Unlimited

10. 在仪器控制面板中，激活M in和Sec选项旁边的时间确认框，设定运行时间为2

分钟。

11. 在控制面板的液流控制区选择高速（Fast）。

12. 点击R U N按键，冲洗上样针。

13. 当运行结束，点击Delete Sample Data按键，删除在清洗上样针时收集的数据。

14. 从上样针移去管子。

运行8-peak V ali d ation Bea d s：

15. 取消M in和Sec选项旁边的时间确认框，激活事件确认框，设定当收集特定数目

的事件时停止运行。

16. 在Ev ents编辑框中，输入50000，从下拉菜单中选择Un g ate d Sample。

图2-4. 运行限制：50000事件。

17. 振荡混匀样本管中按说明配制好的8-peak校准小球悬液，放在上样针处。

18. 在控制面板的液流版块选择Slow按键。

19. 点击R U N按键开始获取数据，当获取事件总数达到50000时会自动停止获取。 注意：确认开始运行之前，CFlow中选择的是空样本孔，如果按键显示的是ADD TO，这个孔已经包含数据。

提示：在FSC-H v s. SSC-H散点图中，可能R1区域此时并没有包括主要小球群体，这很常见，在此阶段是允许的。

20. 在样本板上方的文本框内输入样本名称，将日期包含在样本名称中，以便区分不同日期获取的样本数据

提示：你可以在收集样本前，收集样本时，或收集样本后进行命名。

图2-5. 样本名称：8-peak Bea d s。

21. 当数据收集结束，移去样本管，用无尘纸擦拭上样针末端，以最小化交叉污染。

运行6-peak V ali d ation Bea d s：

22. 振荡混匀样本管中按说明配制好的6-peak校准小球悬液，放在上样针处。

23. 点击E-H行的第一个空样本孔。

图2-6. 选择空样本孔。

24. 确认Ev ents依然是在Un g ate d Sample中收集50000。

图2-7. 运行限制：50000事件。

25. 点击R U N按键。

提示：在FSC-H v s. SSC-H散点图中，可能R2区域此时并没有包括主要小球群体，这很常见，在此阶段是允许的。

26. 为样本命名，将日期包含在名称中。

图2-8. 样本名称：6-peak Bea d s。

结束数据收集：

27. 当数据收集结束，移去样本管，用无尘纸擦拭上样针末端。

28. 在上样针处放一管2 m L过滤去离子水，点击一个空样本孔。

29. 在仪器控制面板中选择时间确认框（M in Sec），设定时间为2分钟。

图2-9. 运行限制：2分钟。

2.2 保存校准小球数据

通过默认设置，CFlow会在每个样本收集完毕时自动保存校准小球数据。你也可以随时手动保存数据，请看3.10章节关于保存数据的介绍信息。

2.3 分析并记录校准小球数据

当收集完小球数据后，使用CFlow的Collect面板进行数据分析，这样可以确保C6运行正常。

这样分析小球数据：

1. 点击包含最新8-peak小球数据的样本孔（在A-D行）。

2. 在小球文件的第一个FSC-H v s. SSC-H散点图中，通过拉拽调整预先画的R1

门的位置圈住主要小球群体（看图2-10）。R1应该包括所有事件的75-85%。

注意：通常会有一个“阴影”群体（被称为粘连小球或者小球团块），比主要小球群体的FSC-H值略大一些；这是常见情况，R1中不要包括阴影群体。

粘连小球

图2-10 粘连小球显示图。

3. 确认后三张图（F L1-H, F L2-H以及F L3-H）被g ate到R1门中，在图上G A TE按

键旁会显示R1 in all信息。如果没有出现这样的显示，点击G A TE按键，从弹出的菜单中选择R1 in alle v ents。关于门的信息，请看3.6章节。

图2-11. 应用于8-Peak Bead Plot的门。

4. 测定每个荧光图中top峰（最亮的，最远的）的C V值，将预先画好的水平marker

紧绕在峰周围。

使用Z oom工具来放大top峰（看3.9章节）。

通过点击并拉拽水平marker的边缘，调整marker位置使它紧绕峰周围。

点击E xpan d工具回复到原来的大小。

5. 将运行小球得到的数据与随C6仪器一起运到的出厂数据进行比较，如果C6运转正

常，数据图应该与图2-13中的8-peak b ea d图看起来相似。检查下列信息： 在FSC-H v s SSC-H上图中有主要的小球群体（有一个阴影群体是可接受的）。

在F L1-H在和F L2-H图中有8个清晰可辨的峰。

在F L3-H图中有至少6个峰。

注意：F L4-H的表现通过步骤6-9的6-peak b ea d s图检测。

图2-13. 8-peak校准小球数据

6. 选择包含最新6-peak小球数据的样本孔（在E-H行）。

7. 调整预先画好的R2门在6-peak小球FSC-H v s. SSC-H散点图中的位置，圈

住主要小球群体（与8-peak小球操作程序类似）。这个群体应该看起来像个感叹号，R2门应该包含整个感叹号群体（图2-14）。

图2-14. 6-peak校准小球数据

8. 确认F L4-H图被g ate到R2门中。如果没有，点击G A TE按键，从弹出的菜单中选

择R2 in alle v ents。

9. 通过调整F L4-H图中M arker的位置，使其紧绕top峰（最亮的，最远的），测定

C V值。可以参考图2-14中关于好的6-peak小球数据的例子，检查下列信息：

在FSC-H v s SSC-H上图中有主要的小球群体。

在F L4-H图中有6个峰。

10. 如果你想，可以在Accuri C6流式细胞仪日志中（在CFlow CD或者U盘中可以找到）记录下每个参数的下列信息：

峰的数目。

T op峰的平均道数和FSC值。

T op峰的C V值和FSC值。

2.4 监测校准小球数据

你可以在一个CFlow文件中轻松监测校准小球数据（以及C6运行性能）随时间

的变化，从而轻松判定C6运行状态是否稳定。

这样监测小球数据：

1.在独立的样本空中保存每日获取的8-和6-peak校准小球数据。

2.在Statistics面板建立一个统计表格，包含T op峰的平均道数和C V值，以及

FSC等信息（看第5章关于在Statistics面板建立统计表格的详细信息）。C6

报告算术平均数。

图2-15 Statistics面板：来自连日记录的8-peak小球数据。

3.比较统计数据随时间的变化，根据趋势或者平均值的突然变化来确定仪器性

能。

2.5 校准疑难解答

下列情况可能表明C6仪器或者校准小球存在问题：

非常大的C V（>5.0%），在8-或者6-peak小球FSC-H点图中出现多个群体。

F L-1或者F L-2少于8个峰。

F L3少于6个峰。

F L4少于6个峰。

最亮的峰的C V>5.0%。

解决方法：

1.如果不是用低速收集的数据，选择低速，重悬小球，重新收集数据。

2.如果小球距被稀释已经超过1个星期，或者放在室温，或者被光长时间照射，

它们的表现会达不到标准。制备新的小球悬液，重新收集数据。

3.在流动室可能存在气泡或堵塞物。做下列一项或多项操作：

再跑一次小球样本。

从上样针移去样本管，放上空管子，点击Unclo g按键。当unclo g cycle

结束（CFlow显示绿灯），再跑一次小球样本。

从上样针移去样本管，放上空管子，点击Back f lus h按键。Back f lus h cycle

结束（CFlow显示绿灯），再跑一次小球样本。

3. 收集数据

收集面板（Collect）可以设定数据的收集标准，开始和停止数据获取，以及查看已收集样本的数据。收集面板包括可以实现以下功能的按键和控制组件：

控制样品的收集。

获取数据。

制图（直方图，散点图，或者密度图）用以查看获取的数据。

设定停止收集数据的标准和阈值。

控制液流速度。

使用re g ions和markers命令来设置门（g ates），并得到统计学数据。

保存和打印图形以及数据。

在CFlow中应用下列分析功能：

-设置复杂的门。

-设定荧光补偿。

-生成统计学数据。

3.1 查看收集面板

当打开CFlow软件时，会自动显示收集面板（Collect），你可以通过点击收集（Collect），分析（Analyze）或者统计（Statistics）来看不同的控制面板。

收集面板由两个主要部分组成：

仪器控制面板——位于窗口左侧的面板，包括控制收集数据的各按键。

数据展示面板——位于窗口右侧的大区域，以图形和统计表格形式显示收集的样品数据。

图3-1 收集面板

下面的表格描述了收集面板上每个控制按键和指示器具体功能：

表3-1收集面板控制按键

控制按键功能描述

Sample N amin g Fiel d样品命名区输入你所收集样品的名称。

Sample G ri d 样品格 为了方便给实验样品编组和收集数据，样品格以96孔板的矩阵形式显示，CFlow会获取每个样品的数据并放在96孔样品格对应的孔中，你可以以任意顺序收集每个样品孔的数据。

样品孔是以颜色编码的：

白色——不包含数据。

蓝色——包含数据。

红色边框——目前选定以查看或者收集数据。

T ra ff ic L i gh t an d M essa g e 显示灯和提示信息 是显示CFlow准备情况以及系统信息的指示器，如果要收集数据，CFlow指示灯必须显示为绿色，并且出现提示信息：C6和CFlow 已经连接并准备完毕（C6 and CFlow are connected and ready）。

指示灯的状态是以颜色编码的：

绿色——CFlow已经准备好，可以收集

数据，或者正在收集数据。

黄色——C6正在准备进行操作，或者发

生了一个非关键性错误。

红色——发生了一个关键性错误。

控制按键功能描述

R U N L imits 运行限制 包括一组控制按键，你可以设置自动停止收

集数据的标准，请看3.2.3章节的详细描述。Flu d ics 液流 包括一组控制按键，你可以设置流速和收集

核心样本的大小，请看3.2.3章节详细描述。Back f lus h反冲进行反冲操作，可以从上样针中冲出样品，

请看6.1章节的详细描述。

Unclo g除杂进行除杂操作，可以清除流动室中的样品碎

片残余，请看6.2.1章节的详细描述。

Th res h ol d阈值设置阈值，可以排除细胞样品中碎片和本底

噪音的影响，默认设置阈值是FSC-H设定为

80，000，请看3.2.2章节的详细描述。

R U N/PAUS E/ADD TO 运行/暂停/添加点击按键实现下列功能：

R U N——开始获取样本。

PAUS E——暂停获取样本，点击ADD TO继续获取样本。

ADD TO——你可以在已存在数据的样品孔中继续收集更多数据。

Set Color Compensation 设定颜色补偿 打开颜色补偿对话框，进行荧光补偿，请看

3.12章节的详细描述。

Ac q uisition Counters 获取操作平板 以实时形式显示所选择样本孔最近一次获取

数据的信息（last run），以及所选择样本孔

所有获取的数据信息（Cumulati v e）。

Ev ents——样本获取数据的量。

T ime——已运行样本获取时间。

M icroliters——获取样本体积（微升）。

Ev ents/sec——每秒获取数据量，当运

行结束后，显示的是平均值。

Ev ents/μl——每微升获取数据量，当运

行结束后，显示的是平均值。

Delete Sample Data 删除样本数据 永久删除目前样本所收集的所有数据，在执

行删除数据命令前，会有提示框显示警告信

息。提示信息还包含已用存储数据容量尺，

显示CFlow目前已使用的数据存储容量。 Plots Pane 图形窗口 此区域可以显示两个制图栏，以方便通过图

表分析目前样本所获取的数据，通过拉上或

拉下边条可以看到其他图形。你可以为每个

样本作多张图，在每个图栏下方包括控制按

键，可以分别制作直方图，散点图和密度图。

请看3.4章节的详细描述。

Statistics T a b le 数据统计表格 图下方的表格显示每张图的统计学信息。 3.2 收集样本数据

每个数据孔最多可以容纳1,000,000个数据，你可以随时向每个数据孔添加更多的数据（最多1,000,000个数据），即便数据孔内已经存在数据。当数据孔中已经存在数据时，R U N按键会显示ADD TO

CFlow必须显示绿色提示灯，以及“C6和CFlow已经连接并准备好收集数据”的提示信息后，才可以进行数据的收集。

图3-2展示了一个新的工作窗口，显示了一张FSC-A和SSC-A线性坐标的密度图，FSC-A的线性范围是0 – 1,600,000，SSC-A的线性范围是0 –800,000。

图3-2 新CFlow工作窗口

这样收集样本数据：

1.设定液流速度（看3.

2.1章节），阈值（看

3.2.2章节），和运行限制（看3.2.3章节）。

2.此为可选操作，命名样本（看

3.2.4章节）。

3.收集样本数据（看3.2.5章节）。

4.点击画一张图形（看3.4章节）。

5.设置并应用门（看3.6章节）。

6.命名图的坐标轴（看3.8章节）。

7.应用荧光补偿数值（看3.12章节）。

8.分析样本数据（看第4章）。

另外，你也可以先进行最少的设置，一次收集好所有数据，然后再进行数据处理分析（包括设置门，应用荧光补偿等）。

这样在最少设置条件下收集数据：

1.设置运行限制，流速和阈值。

2.收集所有样本数据。

3.2.1 设定流速

系统最高可以每秒钟收集10,000个数据，但是推荐以每秒2500个或者更低的速度进行收集，以保证最佳数据分辨率。

这样设置流速：

1.在收集面板的液流板块点击低速（Slow），中速（M e d ium）或者高速（Fast）按键。

注意：推荐以低速开始收集数据并观察收集的速度，如果需要，你可以再将速度调整为中速或者高速。

你可以设置常用的流速，以及调整所收集样本的核心颗粒大小范围（core size）。 3.2.2 设定阈值

设定阈值可以排除细胞样本中的碎片和本底噪音的影响，以保证样本数据的可靠性。CFlow 的默认设置阈值是80,000。

你可以在获取数据前/中/后随时改变阈值的设定。主阈值（Primary t h res h ol d）是控制数据收集的主要参数，你还可以选择设置第二阈值（Secon d ary t h res h ol d）来过滤掉更多的背景数据。CFlow默认设定FSC-H阈值为80,000。

注意:如果在收集数据前或者收集数据过程中设定阈值，要特别小心，任何未达到阈值标准的数据都不会被获取或者保存。如果在收集数据之后进行阈值调整，当新设置的阈值会导致永久性数据损失时，CFlow会显示警告信息。

图3-3 阈值设定警告信息

这样设置阈值：

1.做下列操作之一：

选择Instrument>Set threshold。

在仪器控制面板中点击Set Th res h ol d按键。

2.在设置阈值对话框的主阈值（Primary Th res h ol d）下拉菜单中选择主阈值参数。

图3-4 主阈值下拉菜单

3.在less t h an编辑框中输入80,000，将最小阈值设定为80,000。

注意：如果你研究的是较小的细胞（例如血小板或者细菌）或者较大的细胞（例如细胞系），你可能需要分别设置更低或者更高的FSC-H阈值。

4.如果你想要设置第二阈值以过滤更多的数据，做下面操作：

从第二阈值（Secon d ary Th res h ol d）下拉菜单中选择阈值参数。

在less t h an编辑框中输入数值作为阈值最小值。

5.做下列操作之一：

选择应用到所有样本（Apply to All Samples）按键，向所有样本应用此设置，包括以前在其他数据孔收集的数据。

选择只应用到此样本（Apply to O nly t h is sample）按键，只向当前样本应用此设置。

图3-5 设定阈值对话框

6.点击应用（Apply）按键应用设定的阈值。

7.点击关闭（Close）关闭对话框。

3.2.3设定运行限制

设定运行限制指示CFlow何时停止收集数据，你可以以下列任何条件为标准设定运行限制： 运行特定时间后

收集特定体积样本后

收集特定数据量之后

不限时间（直到手动停止运行）

你也可以同时选择多种运行限制（当满足第一个运行限制时，C6就会停止运行）。

推荐为你的第一个样本设置运行限制为收集细胞总数100,000 – 200,000，当你在感兴趣的细胞群体上设置门（g ate）以后，你可以改变运行限制条件。

图3-6 运行限制控制栏

在不设置运行限制条件下，这样收集样本：

1.使收集面板运行限制（R un L imits）板块的选项都处于未激活状态。

2.激活无限制运行（R un Unlimite d）选项。

这样在特定样本量数据被收集后停止运行：

1.激活Ev ents旁边的确认框。

2.在旁边的文本框中，输入你想要停止运行的样本数据量。

3.在文本框的下拉菜单中，做下列操作之一：

选择未设门样本（Un g ate d Sample）.

选择一种设门策略（如果有），当在设门区域内收集的数据量达到设定数值时，停止运行。

3.2.4命名样本

你可以随时命名样本，如果你未给样本命名，CFlow会按样本孔的位置来为样本命名（例：A01）。

这样命名样本：

1. 在96孔板上面的文本框中输入样本名称。

图3-7 样本命名区

3.2.5运行样本

这样运行样本：

1.温和的重悬样品管中的细胞，将样品管放在上样针处。

2.在CFlow中选择一个空的样本孔。

3.点击运行（R U N）按键开始收集样本。

CFlow开始启动液流，在此期间，CFlow的提示灯会显示黄色，并出现提示信息：准备分析样本（Preparin g to analyze sample）。当启动完成，提示灯会变绿，并出现提示信息：C6正在收集数据（C6 is collectin g d ata）。当正在收集数据时，当前的数据孔会闪烁蓝色。当达到运行限制时，数据孔停止闪烁，保持蓝色，表明此数据孔已经包含数据。

4.如果需要，你可以随时通过点击添加（ADD TO）按键，在已经包含数据的数据孔收集

更多的数据。