20130708-质粒转化细菌实验操作
质粒转染大肠杆菌
材料试剂：胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCl，NaOH（调pH），氨苄青霉素，卡那霉素，质粒提取试剂盒
仪器：高压灭菌锅，42℃恒温水浴锅，，恒温摇床（37℃,225rpm），无菌培养板，消毒1.5ml离心管，消毒枪头，无菌操作台
实验步骤：
1.LB培养基的配制：
在950 ml去离子水中加入: 胰化蛋白胨10g 酵母提取物5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.0.
用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min.
固态培养基
LB固体培养基及倒板：
（1）.配制：100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉
（2）.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为50μg/ml），以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
（3）.倒板：一般10ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。
（4）.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。
2.从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻
后立即置冰上。
3.加入质粒DNA溶液（含量不超过50ng，体积不超过10μl），轻轻
摇匀，冰上放置30分钟后。
4.42℃水浴中热击45s/90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
5.向管中加入1ml LB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培
养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr ）。
6.将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上，正面向
上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。
同时做两个对照：
对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
大肠杆菌的扩增
1.从LB平板上挑取新活化的单个菌落，接种于3-5ml LB液体培养
基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该
菌悬液以1：100-1：50的比例接种于100ml LB液体培养基中，
37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
2.取上述培养液置于冰中10min，之后转移到已灭菌的50ml离心
管中再于冰上放置5min
3.于4℃离心，2700rmp，10min，弃上清，收集细菌
4.质粒的提取
准备大肠杆菌质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液
5.质粒鉴定（琼脂糖凝胶电泳）
质粒转染细胞株
材料
细胞株、质粒、培养基、链霉素/青霉素（双抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸盐缓冲溶液）、胰酶/EDTA消化液、转染试剂（Lipofectamine TM2000）
实验步骤
Ⅰ.准备细胞：
贴壁细胞：转染前 24 h，在500 μL无双抗完全培养基中接种
0.5-2×105个细胞，转染时细胞融合度为80 - 90% 。 ( 注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆积生长。)
II ．对于每个转染样品，按下面的方法准备：
（1）用50 μL Opti-MEM稀释0.8 μg质粒DNA，轻轻吹吸3 - 5 次混匀，室温下静置5 min。
（2）轻轻颠倒混匀转染试剂，用50 μL Opti-MEM 稀释2.0 μL Lipofectamine TM2000，轻轻吹吸3 - 5 次混匀，室温下静置5 min。
（3）混合转染试剂和质粒DNA稀释液，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 20 min。注: 转染复合物一旦形成，应立即加入培养皿中进行细胞转染。
（4）转染复合物加入到24孔细胞板中，100 μL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。
（5）将细胞板置于37℃、5% CO2 培养箱中培养6 h左右，进行换液，换成含10%血清的普通培养基，在37℃，5％CO2孵育箱中继续培养24h左右。
稳定转染细胞株的筛选（各种细胞用什么抗生素筛选呢）从37℃，5％CO2孵育箱中取出培养皿，弃去含转染试剂的培养基，用PBS冲洗细胞2遍，胰蛋白酶消化，接种1/2的细胞到100 mm 培养皿中，加入含500 μg/ml G418的新鲜培养基，每2-3天更换一次新的筛选培养基，每天观察细胞的死亡情况。当正常细胞完全死亡后，换用新的不含G418的培养基培养。每天观察细胞生长状态。在细胞达到60%汇合率时再用含500 μg/ml G418的培养基筛选一次。当细胞达到90%以上汇合率时将细胞转移至培养瓶中继续培养（转染后10-12天左右）。以后每隔4-5天再用含500 μg/ml G418的培养基筛选。直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量后可以收集样品（约转染后15天左右）。以后继续培养时加入的G418浓度降一半。
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血
真菌学实验报告
真菌学实验报告 一.实验目的： 1.1了解真菌形态的基本特征。 1.2掌握丝状真菌制片方法。 1.3掌握内生真菌的分离方法 1.4掌握真菌的鉴定方法。 二.前言： 真菌广泛分布于地球表面,从高山、湖泊到田野、森林，从海洋、高空到赤道、两极，到处都有真菌。真菌虽然不在空气中生长繁殖，但它的孢子却成群的漂浮在天空，只要稍微注意你会发现人类原来生活在真菌的汪洋大海中。 当今世界，生物技术已迈入世界经济的支柱产业，真菌学在生物技术的大潮中得到了长足的发展。真菌是原始的真核生物，具有广泛的多样性，真菌生长我繁殖迅速，在很短的时间内就可以得到比动物和植物多得多的后代，能够直接、快速地进行遗传性状分离的
分析。因此，真菌可以作为研究基础生物学过程中的一个重要工具，真菌基因的多样性以及真菌分子生物学的发展，为生物技术产业提供了一个广阔的天地。 植物的生长环境直接影响内生真菌的生物多样性，植物物种的年代越久远，其生物内生真菌的多样性越丰富：抗病原性能越强的植物，其所含的内生真菌具有抗菌活性的可能行就越大；其所含的内生真菌有可能产生与植物相同或相似的抗菌无知或产生抗菌活性物质可能参与了药用植物的抗菌过程，本实验通过植物病原真菌和G+、G-细菌的抑制实验发现茎，根，花，种子或果实内生真菌的代谢产物具有不同程度的抑菌能力，并且对G+、G-有普片遍的抑菌作用。研究和开发内生真菌的寻找新的抗菌活性物质具有广泛的应用前景。 三.材料与方法： 3.1.1材料： 在校园内采集银杏、喜树、桂花树样品包括叶、茎、根、花、种子或果实。 3.1.2.药品与试剂： 葡萄糖、蛋白胨、KH2P04·3H2O、MgSO4·7H2O，马铃薯、琼脂。孟加拉红，青霉素，链霉素，甲基蓝，蛋白胨，酵母膏，蔗糖，磷酸盐，葡萄糖，琼脂条，无菌水等。消毒剂：75%的乙醇，0.1%升汞（HgCl2），次氯酸钠溶液（含活性氯10%），30%双氧水。双
DNA使R型细菌转化为S型细菌的原理
DNA使R型细菌转化为S型细菌的原理 实质是基因重组 R型活肺炎双球菌（受体菌）在对数期后期（生长后期）约40分钟内处于“感受态”，吸收外源DNA的能力比其他时期大1000倍。此时，R 型活肺炎双球菌（受体菌）细胞膜表面有30-80个“感受态因子”位点。感受态因子是一种胞外蛋白，它可以催化外来DNA片段的吸收或降解细胞表面某种成分，从而使细胞表面的DNA受体显露出来（也可能是一种自溶酶，可特异性地结合双链DNA）。被加热杀死的S型肺炎双球菌（供体菌）自溶，释放出自身的DNA片段（已经失活，但双链结构尚存在，分子量小于1×107，约含15个基因），称为“转化因子”。当“转化因 子”遇到感受态的R型活肺炎双球菌（受体菌）时，就有10个左右这样的双链片段与R型活肺炎双球菌（受体菌）细胞膜表面的“感受态因子”位点相结合，在位点上进一步发生酶促分解，形成平均分子量为4-5×106的DNA片段，然后双链拆开，其中一条降解，另一条单链逐步进入细胞，与受体菌染色体组上的同源区段配对，并使受体染色体组的相应单链片段被切除，从而将其替换，于是形成一个杂种DNA区段（它们间不一定互补，故可呈杂合状态）。随着受体菌染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一类似供体菌，另一类似受体菌。当细胞分裂后，此染色体发生分离，于是就由R型肺炎双球菌产生出S型肺炎双球菌的后代。这个过程称为原核生物的转化，其实质是基因重组。 转化之所以会发生： 一、因为R型与S型的DNA可以同源区段配对，形成杂合细菌，通过分裂生殖形成R型和S型两种后代，不象许多人认为的（R型直接变成S 型）； 二、无荚膜的R型有非常重要的感受态，保证了S型的DNA可以进入。反之则不会发生：S型有荚膜，无感受态，不能作为受体菌，若人为除去荚膜，培养出无荚膜的后代，它就同时丧失了毒性，变成R型，当然就会有了感受态。
实验诊断学重点
1、红细胞及血红蛋白绝对性增多 ①继发性红细胞增多症 ②真性红细胞增多症 2、红细胞及血红蛋白生理性减少： 婴幼儿和15岁以下儿童、部分老年人、妊娠中、晚期 3、红细胞结构异常 嗜碱性点彩、染色质小体、卡—波环、有核红细胞 4、白细胞减少：白细胞总数低于正常值 5、中性粒细胞数量变化的临床意义 （1）中性粒细胞增多： 急性感染、严重组织损伤及大量血细胞破坏、急性大出血、急性中毒、白血病、骨髓增殖性疾病、恶性肿瘤（ （2）中性粒细胞减少： 感染、血液系统疾病、物理化学因素损伤、单核-吞噬细胞系统功能亢进、自身免疫疾病 6、粒细胞缺乏症：中性粒细胞绝对值低于*109/L 7、核左移：周围血中出现不分叶核粒细胞（杆状核粒细胞、晚幼粒、中幼粒、早幼粒等）的百分率增高（超过 5%）时称为核左移 核右移：周围血中若中性粒细胞核出现5叶或更多分叶，其百分率超过3%者称为核右移 8、中性粒细胞中毒性改变： 细胞大小不均中毒颗粒空泡形成杜勒小体核变性 9、中毒颗粒：中性粒细胞胞质中出现粗大，大小不等、分布不均、染色呈深紫红或紫黑色，谓之为~ 10、淋巴细胞增多的临床意义 感染性疾病、肿瘤性疾病、急性传染病的恢复期、移植排斥反应 11、网织红细胞：是晚幼红细胞脱核后的细胞。 [ 12、血小板减少的临床意义： （1）血小板的生成障碍 （2）血小板破坏或消耗增多 （3）血小板分布异常 13、血细胞比容：又称血细胞压积（PCV），是指血细胞在血液中所占容积的比值 14、溶血性贫血：是指各种原因导致红细胞生存时间缩短、破坏增多或加速，而骨髓造血功能不能相应代偿而 发生的一类贫血。 15、血细胞发育过程中形态演变的一般规律 （1）细胞体积 胞体逐渐大→小 （2）细胞质 量：少→多 染色：深蓝→浅染，甚至淡红 颗粒：无颗粒→嗜天青颗粒→特异性颗粒 （3）细胞核 · 大小：大→小 形态：规则→不规则 染色质：细致疏松→粗糙致密
大肠杆菌电转化感受态细胞制备.
大肠杆菌电转化感受态细胞制备 第一天: 1.将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°C 下过夜培养 2.高温灭菌大的离心瓶(250-500ml以备第二天摇瓶用 3.准备几瓶灭菌水(总量约1.5升,保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用 第二天: 4.转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基的1-2升挡板摇瓶中 5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时 6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次 7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时 8.细胞在4°C 5000g下离心15分钟,弃上清液(如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天 9.用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升,然后加水稀释至离心管的2/3体积。 10.照上面步骤重复离心,小心弃去上清液 11.照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞 12.离心,弃上清液
13.用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14.照上面步骤离心,小心弃去上清液(沉淀可能会很松散 15.用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml 16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管,于-80°C保存 转化方法: 1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ,冰上培育约5分钟 2. 添加1-3μl DNA ,冰上培育约5分钟 3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡中 4. 加载P1000,准备好300μl LB 或2xYT 5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏(检查时间常数,应该在3以上 6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中 7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原 8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养 大肠杆菌感受态细胞制备及转化中的影响因素 1、感受态细胞的概念 重组DNA分子体外构建完成后,必须导入特定的宿主(受体细胞,使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DNA 分子的转化。
《人类对细菌和真菌的利用》教学反思
《人类对细菌和真菌的利用》教学反思 本节课是《生物学》人教版第五单元第五章第二节的第一课时内容，教学目标是举例并尝试发酵技术在食品制作中的应用；通过发酵实验和尝试制作甜酒、酸奶等食品，提高动手实践和理论联系实际的能力。内容涉及的是细菌和真菌对人类有益的方面，与实际生活的联系极为密切。学生不仅对本节课内容感到新颖、好奇，而且对制作发酵食品还有一种跃跃欲试的冲动。本节虽然知识结构并不复杂，但从科学技术与生活实际的角度看，内容和形式不容忽视，因为它为提高同学的实践能力、体验知识与技术在实际生活中的应用提供了非常好的机会和素材。高效课堂的学习特别强调学生的经历，强调学生的学习体验，增加学生在高效课堂中的参与度。 授课过程中，在老师的引导下，通过小组合作、动手实验、表达交流等活动环节，看到了学生的反应积极踊跃，兴趣浓厚，并且能够联系生活经验利用发酵技术制作食品。由此不仅提高了学生语言表达、逻辑推理等多方面的能力，而且培养了学生的相互协作的精神，更重要的是使学生真正体验到知识与技术在实际生活中的应用。 在教学实施过程中，有下面几个方面处理的较好： 1、在教学中，我把“发酵现象”演示实验改成了学生分组实验，并进行了改进和拓展，教学效果很明显。分组实验进一步培养了学生的实践动手能力，增加了学生的感性认识和小组成员合作探究的意识。并且我对书上实验进行了适当的改进，把装好材料的瓶子放在保温桶中水浴保温，温度保持在40 ℃左右，让学生更快看到实验现象，提高了课堂的实验效率。而且拓展了实验，把气球收集的气体通向澄清的石灰水检验产生的气体成分，并请同学闻一闻产物的气味。通过上述处理，学生对“酵母菌发酵”所需要的原料、条件及产生的物质都有了较直观的认识和感受，比较容易理解课本上阐述的“酵母菌可以把葡萄糖转化为酒精和二氧化碳”等相关内容，留下了深刻的印象。 2、甜酒的制作这一环节，充分利用了教学资源。课前把这一制作过程录成了教学短片，而不是利用网上下载的视频资源，这样更贴近学生生活，让学生在课堂上对甜酒的制作过程加以解说、品尝甜酒，大大激发了学生学习兴趣，增加感性认识，让学生充分体验知识与技术在生产生活中的作用。并且鼓励学生课下亲手制作酸奶，在课外活动中进一步发展自己的实践能力。 3、新旧知识的联系。本节知识性内容不多，但与前后知识联系很密切。在教学过程中，
R型细菌如何转化成S型细菌
R型细菌如何转化成S型细菌 R型活肺炎双球菌（受体菌）在对数期后期（生长后期）约40分钟内处于“感受态”，吸收外源DNA的能力比其他时期大1000倍。此时，R型活肺炎双球菌（受体菌）细胞膜表面有30-80个“感受态因子”位点。感受态因子是一种胞外蛋白，它可以催化外来DNA片段的吸收或降解细胞表面某种成分，从而使细胞表面的DNA受体显露出来（也可能是一种自溶酶，可特异性地结合双链DNA）。被加热杀死的S型肺炎双球菌（供体菌）自溶，释放出自身的DNA片段（已经失活，但双链结构尚存在，分子量小于1×107，约含15个基因），称为“转化因子”。当“转化因子”遇到感受态的R型活肺炎双球菌（受体菌）时，就有10个左右这样的双链片段与R型活肺炎双球菌（受体菌）细胞膜表面的“感受态因子”位点相结合，在位点上进一步发生酶促分解，形成平均分子量为4-5×106的DNA片段，然后双链拆开，其中一条降解，另一条单链逐步进入细胞，与受体菌DNA的同源区段配对，并使受体DNA的相应单链片段被切除，从而将其替换，于是形成一个杂种DNA区段（它们间不一定互补，故可呈杂合状态）。随着受体菌DNA进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一类似供体菌，另一类似受体菌。当细胞分裂后，此DNA发生分离，于是就由R型肺炎双球菌产生出S型肺炎双球菌的后代。这个过程称为原核生物的转化，其实质是基因重组。 转化之所以会发生： 一、因为R型与S型的DNA可以同源区段配对，形成杂合细菌，通过分裂生殖形成R型和S型两种后代，不象许多人认为的（R型直接变成S型）； 二、无荚膜的R型有非常重要的感受态，保证了S型的DNA可以进入。反之则不会发生：S型有荚膜，无感受态，不能作为受体菌，若人为除去荚膜，培养出无荚膜的后代，它就同时丧失了毒性，变成R型，当然就会有了感受态。 三、真核生物的细胞膜表面结构与原核生物的大不相同，不会发生转化（转化本身只发生在同种菌株间或近缘菌株间）。我们可以放心去吃想吃的东西，包括被加热杀死的S型肺炎双球菌。 四、S型可以变成R型吗？当然可以！产荚膜细菌由于有黏液物质，菌落表面湿润、有光泽、黏液状，称光滑型—S型（smooth）；无荚膜细菌由于无黏液物质，菌落表面干燥、粗糙，称粗糙型—R型（rough）。自然状态下通过基因突变来完成，不是转化。人工方法是诱变，物理、化学方法都行，变过来的还能再变回。
布鲁氏菌病实验室诊断技术
龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/661106335.html, 布鲁氏菌病实验室诊断技术 作者：王勤 来源：《湖北畜牧兽医》2018年第04期 摘要：对实验室常用的几种布鲁氏菌病检测方法进行了分析，为实验室检测不同动物群体选择相应的诊断方法提供参考。 关键词：实验室；布鲁氏菌病；检测方法 中图分类号：S858 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2018）04-0025-01 布鲁氏菌病（简称布病）是一种危害性极大的传染性人兽共患病，在世界范围内广泛流行。其主要临床症状为雌性动物流产、生育力下降，雄性动物睾丸炎，甚至不育，给畜牧业造成严重的损失。 1 病原学方法 从疑似感染布病的个体中提取血液或其他样本，对样本处理后在选择培养基上培养，如有菌落生长则通过细菌染色、生化试验等方法鉴别是否为布鲁氏菌，该方法准确性高，但危险性高、操作难度大、分离时间长，对试验环境要求严格，需在特定试验条件下进行。 2 PCR技术 随着分子生物学技术的发展和普及，可通过 PCR、荧光定量PCR以及环介导等温扩增（LAMP）等技术对布病进行诊断。其中PCR技术具有特异性高、灵敏度好、操作较简单等优点，可用于鉴别不同种属的布鲁氏菌。荧光定量PCR 技术相较于传统 PCR 技术具有灵敏度高、高通量和方便快捷等优势，但由于其引物和探针设计较为困难，且限制较多，对专业技术有较高要求。LAMP可用于对奶、组织等样本的检测，具有操作方便、可视性强、特异性高和试验条件要求低等优点，其灵敏性可达10 pg/反应，且可以在普通水浴下完成反应，适于基层检测使用。但是LAMP存在多重扩增较为困难，样本污染等问题，且对引物设计要求很高限 制了该技术的进一步使用。 3 血清学检测方法 3.1 虎红平板凝集试验（RBPT） BRPT是在平板上将30 μL抗原与30 μL血清样品混合，4 min内观察是否出现凝集来判定阴阳性，该法使用方便、结果判定简单、价格低廉，适用于各种家畜布病的田间筛选，在国际上广泛应用，但是特异性较差，易出现假阳性。
细胞转染操作步骤
RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix
加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection 中板密度*Culture vessel Surf. area per well Vol. of plating medium Vol. of dilution medium DNA Lipofectamine ?2000 cell/well 96-well0.3cm2100ul2X25ul0.2ug0.5ul 0.5-2X105 cell/well 24-well2cm2500ul2X50ul0.8ug 2.0ul 1-3X105 cell/well 12-well4cm21ml2X100ul 1.6ug 4.0ul 2-3X105 cell/well 6-well (35mm) 10cm22ml2X250ul 4.0ug**10ul 8-10X105 cell/dish 60mm20cm24ml2X0.5ml8.0ug***20ul 2-3X106 cell/dish 10cm60cm215ml2X1.5ml24ug60ul *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参
“细菌和真菌的分布”探究实验设计
“细菌和真菌的分布”探究实验设计 一、教材分析与设计思路 1、教材分析 本节的知识背景是，细菌分布极广，地球上人迹所到之处都有细菌。甚至在5m多深的土壤中，1000m以下的深海中，盐分很高的盐湖中，也都有细菌。空气中，各种物体的表面，包括人的外表，以及动物的消化道内，也都有细菌。深海中热泉口附近的水温可达300℃以上，竟也有细菌存在，它们和外周的其他生物组成一个特殊的没有日光的生态系统。关注学生的学习和生活经验。 本节的探究实验是在学生已有一定的探究性实验技能的基础上进行的。如学生会“提出问题，作为假设”。 2、设计思路 本节课着重体现从生物圈的角度认识细菌和真菌的思路。让学生按照从宏观到微观的顺序进行观察。即通过“探究实验”由学生亲自体验细菌和真菌的广泛分布入手，认识细菌的生活环境和生活特点。激发学生的学习兴趣，于无声处走进教学内容，乐于探索生命的奥秘，逐步养成良好的生活与卫生习惯，确立、健康的生活态度。在学法指导中，改变以往讲述细菌的知识内容的做法，侧重引导学生自己设计和探究，符合从感性到理性的规律。同时，让学生在探究实验过程中，学习接种和培养细菌和真菌的操作，为学生学习生物技术打下了一定基础。 3、教学中应注意的的问题 （1）培养基和培养皿要严格高压灭菌，这是探究实验成功的关键。 （2）鼓励学生大胆设计多种实验方案，珍惜实验机会。 （3）提示学生为什么要选取两套培养皿，目的是设置实验组和对照组。 （4）强调此探究实验是属于单因素。除采样地点是变量外，进行微生物培养的条件，如温度等要保持一致。 （5）做好标记，设计好实验方案之后，方可打开培养皿。 二、教学目标 1、知识目标 说出细菌和真菌的分布特点；尝试采用细菌和真菌培养的一般方法，探究细菌和真菌的分布；探讨细菌和真菌的分布条件。 2、能力目标
肺炎双球菌转化实验和噬菌体侵染细菌实验的比较.doc
一、肺炎双球菌转化实验和噬菌体侵染细菌实验的比较 （1）肺炎双球菌转化实验中的相互对照 S DNA R 型 糖类 + 型 相互对照 ○ 1DNA 是遗传物质 细 蛋白质 脂质 细 ○ 2其他物质不是遗传物质 菌 DNA 分解物 菌 肺炎双球菌转化实验的结论：证明DNA 是遗传物质，蛋白质不是遗传物质。 噬菌体侵染细菌实验结论:证明DNA 是遗传物质，不能证明蛋白质不是遗传物质，因蛋白质没有进入细菌体内。 二、有关碱基数量计算的归类与应用 1. DNA 分子自我复制的碱基配对 A-T,G-C,T-A,C-G 。 （2）“转录”中的碱基互补配对：A-U,G-C,C-G,T-A 。 (3)“翻译”时的碱基互补配对：A-U,G-C,U-A,C-G 。 (4) “逆转录”时的碱基互补配对:A-T,U-A,G-C,C-G 。 3． DNA 复制过程中的碱基数量计算
某DNA分子中含某碱基a个， （1）复制n次需要含该碱基的脱氧核糖核苷酸数为a(2n-1); (2) 第n次复制，需要含该碱基的脱氧核苷酸数为a2n-1 4.碱基比例的运用 由核酸所含碱基种类及比例可以分析判断核酸的种类。 （1）若有U无T，则该核酸为RNA。 （2）若有T无U，且A=T,G=C，则该核酸一般为双链DNA。 （3）若有T无U，且A≠T,G≠C，则该核酸一般为单链DNA。 三、与中心法则相关的几个问题 1．中心法则中遗传信息的流动过程为： RNA 蛋白质（性状） （1）在生物生长繁殖过程中遗传信息的传递方向为 （基因） mRNA 蛋白质 (2)在细胞内蛋白质合成过程中传递信息的传递方向（如胰岛细胞中胰岛素合 DNA mRNA 蛋白质 （含胰岛素基因） (3)含逆转录酶的RNA病毒在寄主细胞内繁殖过程中，遗传信息的传递方向的 为 RNA DNA mRNA蛋白质 （4）DNA病毒(如噬菌体)在寄主细胞内繁殖过程中，遗传信息的传递方向为（基因）mRNA蛋白质 （5）RNA病毒（如烟草花叶病毒）在宿主细胞内繁殖过程中，遗传信息的传递方向为 RNA蛋白质 2．中心法则体现了DNA的两大基本功能 （1）图中○1体现了对遗传信息的传递功能，它是通过DNA复制完成的，发生于 亲代产生子代的生殖过程或细胞增殖过程中。 逆转录
实验四 细菌、真菌、放线菌的分离与培养
实验报告 课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验 实验项目名称：微生物的分离与培养与菌落观察 学生姓名：专业：环境工程学号： 同组学生姓名： 指导老师： 实验地点：实验日期：2018 年 10月16日 一、实验目的和要求 1.掌握微生物接种培养技术 2.掌握微生物分离纯化技术 3.学习并掌握放菌落形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。 二、实验内容和原理 土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现具有重要价值微生物的主要菌源。在不同土壤中，各类微生物的数量千差万别。为了分离获得某种微生物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗生素抑制不需要的微生物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL 抑制霉菌。通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。挑取单个菌落转接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯化。 1.菌种的分离纯化：从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离 与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分 离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“单一性”，防止其他微生物的 混入。 2.平板涂布法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且 采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微 生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。用途上，一般多用于从菌种的纯化;优点是可 以观察菌落特征，对混合菌进行分离;但不能计数 3.平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表 面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落 的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。用途一般多用于筛选菌株。一般用 于平板培养基的回收率计数。优点是可以计数，可以观察菌落特征。缺点是吸收量较少，较麻烦，平板不于燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度天的话，长不出单菌落。 4.稀释倒平板法：稀释倒平板法是将细菌与液态的培养基混合后倒入培养皿再冷却凝固，使样品中 的微生物细胞充分分散开，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，单个细胞及聚在一起 的细胞可以生长繁殖，形成一个肉眼可见的菌落，统计菌落数目，即可用以评价样品中的微生物 的数量。所以细菌在培养基的内部和表面都有,适合厌氧型微生物。 5.菌种保藏：菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征 和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。保藏菌种一-般是选用它的休眠休，如孢 子;芽孢等等，并且要创造一一个低温;干燥; 缺氧;避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体 能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，
病毒转染原理及步骤
病毒转染原理及步骤 在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。 病毒转染包括以下步骤：1构建载体2包装提纯病毒3感染靶细胞。以慢病毒为例。 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 一、慢病毒载体构建原理： 慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
湖北省武汉市为明实验学校八年级生物《人类对细菌和真菌的利用》导学案(无答案) 新人教版
一、学习目标 1、举例说出发酵技术在食品制作的应用 2、说出食品腐败的原因，运用食品保存的一般方 和真菌与人类防治疾病的关系 、说明细菌在环境保护的作用。 5 、关注因技术在医药生产上的应用。 二、学习重难点 1、说出食品腐败的原因，运用食品保存的一般方法保存食品。 、举例说出细菌和真菌与人类防治疾病的关系 三、预习检查 、有的真菌体内含有大量的酶，可以把分解为，如曲霉；有的真菌可以把葡萄糖转化为并产生，如酵母菌。有的细菌含有的酶把转化为，如乳酸菌，还能使牛奶变成，使蔬菜变成酸味的泡菜。 2、食品的腐败主要是由于和引起的，它们可以从食品中获取，并在食品中和，导致食品腐烂，因此，食物保鲜中的一个重要问题就是，所依据的主要原理是。 3、科学家利用现代技术手段，把其他生物的某种转入一些细菌内部，使这些细菌能够生产药品，这种技术手段叫。 四、学习过程 学习任务一：认识细菌、真菌在食品的制作上的应用 1、展示“发酵实验”过程、现象及结论。讨论并表述出发酵的原理。 2、观察掰开的面包、馒头中的小孔就是二氧化碳形成的，思考课本P75练习第一题。 3、通过观察、讨论，列举日常生活中的发酵食品。总结发酵食品的制作原理。 4、制作：根据教材P72制作甜酒 学习任务二：认识细菌、真菌与食品保存的关系 1、观察教材第73页“观察与思考”，讨论并交流各种食品的保存方法。 2、补充归纳出保存食品的主要方法和原理，以及注意事项。 拓展反思：列举本地人们保存食品的一些方法，如腌制品、咸菜等，思考：怎样保存更有利于健康？ 学习任务三：列举细菌、真菌与疾病防治的关系 1、阅读课本76页“抗生素今昔”，然后讨论完成课本75页练习第2题。 2、结合教材P74，表述科学家是如何通过转基因技术进行胰岛素生产的。 学习任务四：认识细菌与环境保护 1、认真阅读教材，举例说明细菌是如何净化污水的。 2、各小组交流调查的本市有关生活污水和工业废水排放情况及垃圾处理情况。利用所学知识为家乡的建设和发展出谋划策。 五、系统总结： 1.细菌、真菌与食品的制作 有的真菌（如曲霉）含有的酶可以把淀粉分解成_________ 有的真菌（如酵母菌）可以把葡萄糖转化为酒精并产生________ 有的细菌（如乳酸菌）含有的酶可以把葡萄糖转化为_________ ___________可用于做馒头、面包；
格里菲思肺炎双球菌体内转化实验结论的有关解释
格里菲思肺炎双球菌体内转化实验出现S型活细菌的可能性及排除 Yong037整理 实验目的：研究肺炎双球菌是如何使人患肺炎的 实验材料：小鼠、肺炎双球菌（S型和R型） 实验过程： 实验结论：第一组说明R型肺炎双球菌无毒性，不会使小鼠患败血症死亡； 第二组说明S型肺炎双球菌有毒性，使小鼠患败血症死亡； 第三组说明加热杀死的S型肺炎双球菌无毒性，不会使小鼠患败血症死亡； 第四组说明已经被加热杀死的S型细菌中，必然含有某种促成将R型细菌转化形成有毒性的s型活细菌的活性物质——转化因子，这种转化因子将无毒性的R型活细菌转 化为有毒性的S型活细菌。 第四组出现S型活细菌的可能性及排除： 1、基因突变：R型活细菌和S型活细菌均有三种亚型：I-R型、Ⅱ-R型、Ⅲ-R型和I-S型、Ⅱ-S 型、Ⅲ-S型（构成各亚型S细菌荚膜的多糖存在差异）；格里菲斯通过实验发现，某亚型的S型菌通过连续的多代培养，其中极少数可能突变成相应亚型的非致病的R型肺炎双球菌，即I-S型—I-S型、Ⅱ-S型一Ⅱ-R型、Ⅲ-S型一Ⅲ-R型；他还发现，向小鼠皮下注射大量R型活细菌，有时可获得相应亚型的S型菌；即R型肺炎双球菌与S型肺炎双球菌只能发生同型突变。格里菲斯在进行实验时，采用的是Ⅱ-R型菌与加热后杀死的Ⅲ-S型菌，将它们混合后注入小鼠体内培养，最终在小鼠体内只分离得到了Ⅲ-S型的活细菌。如果S型菌是R型菌通过基因突变产生的，则分离得到的应该是Ⅱ-S型细菌，而实际得到却是Ⅲ-S型的活细菌，故第四组出现的有毒性的S型菌不是R型菌通过基因突变而来的。 2、S型细菌“复活”：加热会破坏蛋白质的空间结构，且该过程不可逆；也会使DNA变性：加热会使氢键断裂，DNA双螺旋解开成单链，当温度缓慢降低时单链又可以重新形成双链，称为DNA复性，但蛋白质变性失活后，降温也不可能再恢复其功能，所以，加热杀死的S菌的蛋白质失活了，生命活动就不可能再恢复，而其DNA还是有作用的；再者，1933年，阿洛维将Ⅱ-R型细菌和Ⅲ-S型细菌的无细胞提取液（所有完整细胞、细胞碎片、荚膜分子都通过离心和过滤从提取物中去掉）混合，培养皿上仍长出了Ⅲ-S型细菌。这否认了R型细菌以某种方式使加热杀死的S型细菌“复活”。 3、转化（基因重组）：R型活肺炎双球菌（受体菌）在对数期后期（生长后期）约40min内处于“感受态”，吸收外源DNA的能力比其他时期大1000倍。此时，R型菌（受体菌）细胞膜表面有30-80个“感受态因子”位点。感受态因子是一种胞外蛋白，它可以催化外来DNA片段的吸收或降解细胞表面某种成分，从而使细胞表面的DNA受体显露出来（也可能是一种自溶酶，可特异性地结合双链DNA）。被加热杀死的S型肺炎双球菌（供体菌）通过自溶过程，释放出自身的DNA片段（已经失活，但双链结构尚存在，分子量小于1×107，约含15个基因），称之为“转化因子”。当“转化因子”遇到“感受态”的R型活肺炎双球菌（受体菌）时，就有10个左右这样的双链片段与R型活肺炎双球菌（受体菌）细胞膜表面的“感受态因子”位点相结合，在位点上进一步发生酶促分解，形成平均分子量为4×106～5×106的DNA片段，然后双链拆开，随后其中一条链被细胞膜上的核酸酶降解，降解产生的能量协助把另一条单链推进受体细胞（该过程称为DNA的结合和摄取），与受体菌DNA上的同源区段配对，并使受体菌DNA的相应单链片段被切除，从而将其替换，形成一个杂种DNA区段（它们间不一定互补，可能呈
脂质体转染实验原理与操作步骤总
脂质体转染的实验原理与操作步骤大全 日期：2012-06-25 来源：互联网作者：青岚点击：3644次 摘要： 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 找产品，上生物帮>> >> 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n，n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1：1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。 细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 一、脂质体(liposome)转染方法原理 脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体((Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。 中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 二、脂质体转染操作步骤 1、操作步骤[方法一]：
真菌学实验指导
本课程，本课程是大学本科生物技术、生物科学专业的选修课程。介绍真菌分类现状、分类方法（包括传统与现代分类方法的比较）、分类依据及其原则。本课程的教学不限于介绍研究的成果，重在介绍分析和解决问题的方法，以培养学生分析问题和创新的能力。所以在理论学习的同时开设综合性实验，培养学生观察、分析和动手能力。基本掌握真菌分离、鉴定的方法，并应用于真菌其它领域的研究。 本指导书适用于生物技术和生物科学专业。
1、实验：内生真菌的分离及鉴定 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????3 2、实验报告基本内容要求 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????7 3、实验报告格式????????????????????????????????????????????????????????????????8
实验内生真菌的分离及鉴定 实验学时：18 实验类型：综合 实验要求：选修 一、实验目的 1.了解真菌形态的基本特征。 2.掌握丝状真菌制片方法和真菌鉴定方法。 二、实验内容 采集植物样品包括叶、茎、根、花、种子或果实，然后对分离样品的内生真菌，并进行形态和分子生物学方法的鉴定。 三、实验原理、方法和手段 （一）实验原理 根据真菌的形态特征和ITS序列等分子证据对分离到真菌进行归类和鉴定。 （二）实验手段和方法 1、内生真菌分离纯化方法 1.1样品的表面消毒及预处理 分别取根、茎、叶、果实，用洗涤剂在自来水下洗净。 老树皮用75%酒精进行表面消毒后，用镊子取出，于酒精灯上烧灼15秒至表面焦糊，切成1×1cm2大小置于PDA固体培养基上。 对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒： 75%的酒精漂（浸）洗2-3min→无菌水冲洗4-6次→0.1%升汞不同的消毒时间（共设置7个梯度）→无菌水冲洗4-6次→用灭菌滤纸吸干多余水分→无菌刀片将材料切成小块 将根、茎的表皮、韧皮部、木质部大致分开，并切成0.5×0.5cm2大小。将果实的外种皮去掉，消毒之后将内种皮去掉。 灭菌时，沥干的植物材料转放到烧杯中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻
细菌学诊断技术
细菌学诊断技术 随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，新的细菌诊断技术和方法已广泛用于食品微生物的鉴别。传统的细菌分离、培养及生化反应，已远远不能满足对各种病原微生物的诊断以及流行病学的研究。近年来国内外学者不断努力，已创建不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的细菌学诊断方法，尤其是DNA探针和多聚酶链反应技术的发展和应用，明显提高了细菌的诊断水平。 一、快速酶触反应及细菌代谢产物的检测 快速酶触反应是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，按酶的特性，选用相应的底物和指示剂，将他们配制在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变化，确定待分离的可疑菌株，反应的测定结果有助于细菌的快速诊断。这种技术将传统的细菌分离与生化反应有机的结合起来，并使得检测结果直观，正成为今后微生物检测发展的一个主要发展方向。Rosa 等将样本直接接种于Granda培养基，经18小时培养后，B群链球菌呈红色菌落且可抑制其他菌的生长。 Delise等新合成一种羟基吲哚-β-D葡萄糖甘酸（IBDG），在β-D葡萄糖苷酶的作用下，生成不溶性的蓝，将一定量的IBDG加入到麦康盖培养基琼脂中制成MAC-IBDG平板，35℃培养18小时，出现深蓝色菌落者为大肠埃希氏阳性菌株。其色彩独特，且靛蓝不易扩散，易与乳糖发酵菌株区别。 二、免疫学方法检测细菌抗原或抗体的技术 在细菌诊断中利用免疫学的各种方法日益受到人们的极大关注，从而简化了病原微生物的鉴定手续。 1．抗血清凝集技术 早在1933年，Lancefield就成功地用多价血清对链球菌进行了血清分型。随着抗体制备技术的进一步完善，尤其是单克隆抗体的制备，明显提高了细菌凝集实验的特异性，今天广泛用于细菌的分型和鉴定，如沙门氏菌、霍乱弧菌等。 2．乳胶凝集实验 将特异性的抗体包被在乳胶颗粒上，通过抗体与相应的细菌抗原结合，产生肉眼可见的凝集反应。通常此法需获得细菌纯培养物，再将培养物与致敏乳胶反应。业已用于鉴定大肠杆菌O157；H7 3．荧光抗体检测技术