乳酸菌1

乳酸菌的耐酸机制

摘要:对乳酸菌耐酸机理进行了初步介绍, 主要从以下几个方面进行

了阐述, 包括质子泵机制、蛋白质及RNA修复、细胞膜及代谢方式的改变和碱生成等, 以期为人们了解乳酸菌耐酸的生理生化机制提供借鉴, 为研究者对乳酸菌耐酸性研究提供理论指导。

关键词:乳酸菌; 耐酸性; 机理

Review on the Mechanism of Acid Tolerance of Lactic Acid

Bacteria

Abstract:This review provided the possible acid tolerance mechanism of Lactic acid bacteria, including proton pump, repair of protein and RNA, cell membrane and metabolic ways change, production of alkali and so on. The purpose of this article was to make comprehensive understandings of the mechanism for acid tolerance of Lactic acid bacteria and provide a theoretical basis for the research work related to Lactic acid bacteria.

Key words:Lactic acid bacteria; acid tolerance; mechanism

引言

乳酸菌是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的细菌的通称。它们在自然界分布广泛，可栖居于人和动物的肠道及其他器官中。在土壤、植物根际和许多的人类食品、动物饲料，还有自然界的湖泊和污泥以及一些临床样品中都发现有乳酸菌的存在。很久以前人们就利用乳酸菌来发酵动物（乳、肉、鱼等）和植物制品（蔬菜、葡萄酒、橄榄等）生产各种各样的产品。随着食品发酵工业的不断发展壮大，乳酸菌的经济效益不断在增长，因为虽然它们在发酵食品中的含量非常少，但是对食品的感官品质和质量却有决定作用。因此，发酵剂菌株的质量功能特性和生长特性对于产品的成功发酵是非常必要的。

乳酸菌不但包括在食品发酵中使用的一般认为安全的微生物，而且还包括胃肠道中普遍存在的共生体和具有潜在益生作用的益生菌。对这些微生物来说，食品和胃肠道中的酸性环境对它们的生存是一个很大的挑战。例如，益生菌的最佳

载体是酸奶和发酵乳制品，益生菌如果想要在其中生存就不得不适应这两类载体的酸性环境。而且，益生菌需要能够在酸度更高的胃酸中生存，以便于它们能够顺利地通过胃到达小肠，并在小肠中生存。因此，人们已经普遍接受耐酸性作为筛选理想的益生菌株的特性之一[1]。因此，我们有必要及时研究乳酸菌的抗酸性机制，并对提高或者抑制其耐酸性的机制进行评价。本文讨论了乳酸菌可能的耐酸机理, 并对其进行了初步分析。

1质子泵

乳酸菌调控其细胞内pH的能力是乳酸菌细胞能够正常生存的重要的生理需求之一。乳酸菌在生长过程或在低pH环境中时，如果它不能够维持其细胞内环境的近中性，那么它就可能会丧失活力或者细胞活性。当环境中的pH低于细胞正常生理范围时，在一定的pH范围内时，乳酸菌能够通过某些机制维持细胞内的pH高于环境中的pH，使其保持在正常的生理范围之内。但是当环境中的pH非常低时，乳酸菌就不能够保持细胞内pH的稳定，胞内的pH也开始下降，最终内外的pH达到一致，乳酸菌生长停滞直至死亡[2]。大量的研究也表明，H+-ATPase 和谷氨酸脱羧酶（GAD）体系是乳酸菌维持胞内pH内稳定所使用的主要机制。

1.1H+-ATPase

多亚基的H+-ATPase（F1F0-ATPase）将ATP的产生和跨膜的质子动力势（PMF）偶联起来，它既可以通过利用细胞呼吸作用产生的PMF来生成ATP,可以利用底物磷酸化产生的ATP来产生PMF[3]。PMF能够促进细胞质中的质子的外排，导致胞内的pH的降低。嵌入细胞中的F0亚基复合体是由a、b和c三个亚基组成的，它是一个通道蛋白，具有质子转运活性。它的活性可以通过一些特定F1蛋白的共同表达而得到提高，这表明F1蛋白可能在F0通道蛋白的装配或开启过程中发挥一定的作用。结合在细胞膜表面的F1亚基复合体是由α、β、γ、δ和ε五个亚基组成的，当它被从膜中释放出来后就具有ATP酶活性。当其同嵌在膜中的F0亚基复合体络合在一起之后就能够醉话偶联的质子转运和ATP的合成或者水解之间的相互转换[4]。大量的科学研究已经表明H+-ATPase能够增强许多不同的乳酸菌菌种对低于环境pH的耐受性，例如对德式乳杆菌保加利亚亚种

（Lb.delbrueckiisubsp.bulgaricus）全基因测序的研究已经证实，在H+-ATPase的作用下，德式乳杆菌保加利亚亚种能够在其代谢过程所生成的乳酸导致的低pH

环境中正常生长。研究还坚定了嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）中受pH 诱导的F1F0-ATPase操纵子，他们发现嗜酸乳杆菌在低pH环境中生长时，不但atp 基因转录的产物会增加，而且细胞膜中H+-ATPase活性也会增加[5]。此外，还有研究者对乳酸乳球菌（Lactococcus latis）中编码F1F0-ATPase的基因进行了克隆和测序。

1.2谷氨酸脱羧酶体系

大约60年前，科学家通过研究发现微生物的氨基酸脱羧酶能够通过在脱羧反应中消耗质子来控制其生存环境中的pH。这些氨基酸脱羧酶包括赖氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶和谷氨酸脱羧酶，它们发挥作用的方式是首先将一个质子结合到摄入细胞内部的氨基酸（赖氨酸、精氨酸或者谷氨酸）底物上，然后再将此合成的产物（尸胺、精胺或者γ-氨基丁酸）同细胞外的另一个氨基酸底物交换。通过这种方式，一分子的胞外氨基酸被转化成一分子的胞外产物，同时消耗的一分子胞内的质子导致胞内pH的升高[6]。在以上所提到的三种系统中，只有GAD系统同乳酸菌细胞的pH调控有关。按照最简单的调控机制模型的描述，GAD系统有一个赖氨酸脱羧酶、一个氨基酸通透酶和一个谷氨酸γ-氨基丁酸反向转运体组成。细胞通过特异的转运体摄入谷氨酸之后，在细胞内经过谷氨酸脱羧酶脱羧消耗一分子的胞内质子，反应的产物γ-氨基丁酸（GABA），通过反向转运体被排到胞外。最终结果是由于胞内氢离子的消耗导致细胞内的pH升高，胞外的谷氨酸被转变成碱性略强的GABA而导致胞外pH的略微升高。人们发现在乳杆菌中，谷氨酸的代谢能够产生ATP。基于此研究结果有人提出GAD系统通过将产生电子的反向转运体和氨基酸的脱羧作用偶联起来，能够提供给细胞所需的代谢能量。人们认为，通过三个连续的脱羧-反向转运偶联循环就能够产生一个足够的PMF供

F1F0-ATPase来合成一分子的ATP[7]。GAD系统的重要性显然同食品中存在的谷氨酸相关。谷氨酸被作为食品风味增强剂来使用具有悠久的历史，在很久以前，亚洲许多国家都有使用富含谷氨酸的海带作为食品风味增强剂的习俗。在现代食品生产中，谷氨酸钠是最常使用的添加剂，虽然钾盐、铵盐和钙盐也使用。在许多食品成分中也含有谷氨酸，它被用来调节这些食品的酸度。蛋白质含量丰富的食品，例如肉类和乳制品，同时还有一些蔬菜也含有较多结合的谷氨酸，这些食品的发酵衍生物也会提高游离的谷氨酸的含量。

2 蛋白质修复

乳酸菌的某些伴侣蛋白、蛋白酶和热激蛋白，当细菌细胞处于酸性环境中时它们会大量表达，从而能够保护蛋白的活性或者降解对细胞有害的蛋白。例如利用蛋白质组学的方法分析某些乳酸菌的酸耐受反应时发现，某些热激蛋白总是增量表达，可能会修复酸诱导损伤的蛋白，和/或有助于新合成蛋白的折叠。然而，在不同种的乳酸菌中，酸诱导表达的热激蛋白种类各不，尽管在不同的乳酸菌菌种中都发现有DnaK和GroEL蛋白的表达。研究者对乳酸乳球菌(https://www.wendangku.net/doc/6110952670.html,ctis)groE和clpP操纵子的特异性研究发现，低pH诱导的酸耐受反应，通常是由它们自身的热激蛋白的调控Hrc和CtsR介导的[8]。

3 DNA修复

由于内部pH降低受损的DNA可以通过错误碱基序列的剪切或已停止的复制叉重新其起始复制而被修复，当乳酸菌细胞内的pH过低时会导致DNA的脱嘌呤和脱嘧啶，这种现象的发生涉及碱基的质子化以及随后的碱基和戊糖之间的糖苷键的剪切，碱基丢失位点处的残基通常称为无碱基或AP（无嘌呤，无嘧啶）位点[9]。通常只有单个碱基缺陷乳酸菌才可以利用碱基切除修复方式来进行修复。如果DNA损伤造成DNA螺旋结构较大变形，则需要以核苷酸切除修复方式进行修复。最常见的是短片段修复；只有多处发生严重的损伤才会诱导长片段修复。损伤由切除酶切除，编码此酶的基因是uvr基因，有多个亚基组成。人们发现，在低pH环境中生存时变形链球菌（S.mutans）的野生型和含有recA基因的菌株中都有具有能切除AP位点的内切酶活性，而且还诱导了uvrA基因的表达[10]。这说明，在细菌的酸应激过程中，它们可能同时使用碱基切除和核苷酸切除修复方式对DNA进行修复。

4细胞膜的改变

细胞膜是细菌生存的外部环境中物理化学压力的首要侵袭目标之一。细菌能够通过改变细胞膜的结构、成分、稳定性和活性来保护细胞，而细胞膜的脂肪酸成分的改变是最常见的细菌对外部环境压力的一种反应。例如，变形链球菌（S.mutans）在低pH环境中生长时，细胞膜中的单不饱和脂肪酸和长链脂肪酸会增多，这会降低细胞膜对质子的通透性，从而抑制质子进入胞内，使得细胞内环

境的pH保持在一个较高的水平而增加菌株的耐酸性[11]。

5产生碱

5.1精氨酸脱亚氨酸酶体系（ADI）

科学家在许多乳酸菌中都发现了ADI体系的存在。ADI体系主要由三种酶组成：精氨酸脱亚氨酸酶、鸟氨酸转氨酶和鸟氨酸氨基甲酸激酶，它们分别是由arc A、arc B和arc C基因编码的，能够催化精氨酸生成鸟氨酸、氨和二氧化碳，产生的氨会中和细胞中的H+,升高胞内pH，从而提高细菌的耐酸性[12]。普遍认为，口腔细菌具有ADI体系对人类来说是有益的，例如格式链球菌（Streptococcus gordonii）、副血链球菌(S.Parasanguis)和血链球菌(S.sanguis)，以及某些乳杆菌都或者利用游离的精氨酸（平均分泌浓度为50μmol/l），或者利用唾液中的多肽和蛋白质中的精氨酸。它能够提高乳酸菌的耐酸性，尤其是对某些很少天生就具有酸抗性的口腔乳酸菌（也就是说非突变体）来说是非常重要的。因为在这些细菌中存在的ADI体系。能够使得那些有益的产酸较少微生物能够同更嗜酸产酸更强的微生物在牙菌斑上共生。虽然具有ADI体系的口腔细菌能够利用宿主膳食中的精氨酸，但是人们还发现唾液中的精氨酸、赖氨酸或者含有这些氨基酸的多肽至少也对抗龋齿人群的低龋齿率有部分促进的作用[13]。

在许多不同发酵食品中的乳酸菌也都含有ADI体系，虽然需要不同。早肉品发酵中使用的米酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）是非常特殊的，因为它是兼性发酵乳杆菌，并且也具有ADI代谢途径。有研究者利用缺少ADI体系的米酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）的突变株来确定米酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）的ADI 体系在肉品发酵中的重要性。虽然在突变株和野生型之间没有明显的不同，但是他们指出，这可能是由于菌株之间蛋白水解酶活性的差异，导致菌株生长环境中的游离精氨酸的浓度有很大的不同。还有研究者从来源于酸面团的70株乳酸菌中筛选具有ADI、鸟氨酸转氨酶和鸟氨酸氨基甲酸激酶的菌株，结果发现只有专性异型发酵的菌株同时具有这三种酶。他们对这些菌株中的旧金山乳杆菌（Lactoacillus sanfanciscensis）进行了详细的研究，结果发现ADI体系不但能够增加菌株的耐酸程度，而且还有助于细胞的生长，有助于细胞在70℃储存时的存活以及促进一种重要风味化合物前提物质-鸟氨酸的产生[14]。

5.2脲酶体系

脲酶能够催化一分子的尿素水解成一分子的CO2和一分子的氨，而氨可以中和H+升高pH。人们已经在嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和唾液链球菌（Streptococcus salivarius）中发现了脲酶的存在。研究者发现，当培养基中的尿素浓度为25mol/L、pH为3时，唾液链球菌（Streptococcus thermophilus）能够将胞外的pH升高为7.6,同不添加尿素的对照组相比，存活率提高了1000倍[15]。由于在唾液中存在尿素，因此尿素水解可能对唾液链球菌（Streptococcus thermophilus）在其他嗜酸的乳杆菌和口腔链球菌正常生长导致的极低pH环境中生存尤其重要。

6 代谢方式的改变

虽然人们已经了解了微生物在温和环境中生长，适应酸性环境和在极端pH 下存活的抗酸性机制，但是对人们对其发酵过程中的非常重要的自酸化作用的响应机制还不是很了解。但是人们发现，随着生存环境的酸化，乳酸菌改变了ATP 的代谢方式，它们利用ATP来产生质子梯度，同时伴随着供给细胞用于生物量合成和新陈代谢的能量的减少，直到最后细胞的生长被抑制。代谢的紊乱是由于同主要代谢途径相关基因的转录方式改变导致的，令人感到惊讶的是，虽然这些转录方式的改变在pH剧烈降低的过程中并不明显，但是在某些情况下，这种改变可能是由于mRNA稳定性的增加所致。实际上，在酸化后期同糖酵解相关的几种酶的浓度开始增加，这有利于细胞在生存环境中的pH回复正常之后快速恢复生长。

7总结

乳酸菌可以利用的耐酸性机制有很多种。乳酸菌在低pH下生存的最有效的途径就是完全避免在极端环境中生长，显然这种方式不可能所有的乳酸菌都具有。因此，当乳酸菌在低pH环境中生长时，它们就不得不使用自身的耐酸性机制来维持细胞内pH稳定，使细胞代谢能够正常进行而不受外界低pH环境的影响，从而能够低pH环境中存活。在食品工业的生产过程中以及在通过人和动物的胃肠道时，乳酸菌都不得不暴露在低pH环境中，这就使得只有对地pH环境具有耐受性的乳酸菌菌株才能够存活以及生长繁殖。因此通过对乳酸菌耐酸性机制的了解使得我们能够通过特异性的筛选方法以及分子生物学的手段来获得具有较高耐酸性的菌株，从而能够应用于工业化生产。对于提高食品安全来说，可以筛选

具有较高GAD活性的发酵剂菌株，能够最大程度地降低食品中残留谷氨酸的含量，从而减少可供不良细菌代谢的谷氨酸，这些细菌通过分解谷氨酸而延长在低pH下生存的时间。当然也可以合成谷氨酸类似物，能够特异性地抑制或者竞争细菌的脱羧酶，从而使得我们可以不依赖发酵剂菌株的GAD活性来生产更安全的食品。对于解决酸奶后酸化来说，可以筛选低H+-ATPase活性的发酵剂菌株或者使用分子生物学方法减少发酵剂菌株中H+-ATPase在低pH下的表达，从而降低其耐酸性，使其在低pH下生长停滞甚至死亡，这就可以避免酸奶在发酵成熟后发生后酸化。本综述中阐述了许多乳酸菌的抗酸性机制，但是开发新的技术来增加或者减少微生物在低pH下的存活率，仍然会受益匪浅。

参考文献

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MTT法测定乳酸菌活菌数的研究

62 MTT法测定乳酸菌活菌数的研究 黄立坤，杜鹏2，霍贵成* 乳品科学教育部重点实验室（东北农业大学） (哈尔滨 150030) 摘要建立一种快速、稳定、灵敏并可反映细菌活性的细菌计数方法。以乳酸菌中的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌为研究对象，探讨MTT法用于细菌计数的可行性及测量细菌数量的范围、反应时间、MTT 的用量、是否加入溶解剂等实验条件。结果：保加利亚乳杆菌在(1.0×105～2.18×107) cfu/mL内测出的OD 570值与细菌浓度呈良好的正相关，反应时间1.5 h，MTT添加量20 μL，测量前用DMSO溶解；嗜热链球菌在(2.0×105～5.12×107) cfu/mL范围内测出的OD 570值与细菌浓度呈良好的正相关，反应时间2.0 h，MTT添加量20 μL，可不添加溶解剂直接测量。MTT比色分析法可用于检测乳酸菌活菌数量。关键词MTT；保加利亚乳杆菌；嗜热链球菌；活菌计数 Inquiring into the Method of Counting Live Germ with MTT Abstract To establish a rapid, steady and sensitive bacteria-counting method that could reflect the bacteria’s activity. Lactabacillus delbrueckii ssp. bulgaricus and St reptococcus thermophilus were employed to discuss the feasibility of application of MTT method to bacteria-counting and determine the conditions of the assay, including linear range, reaction time, MTT dosage and whether solvent is added etc.. Results: The optical density at 570 nm is positively related to the concentration of L.delbrueckii ssp. bulgaricus when the number of the bacteria is in the range of (1.0×105~2.18×107) cfu/mL, and reacting time is 1.5 h, MTT dosage is 20 μL, and DMSO is used as solvent before assay; For St.thermophilus , the optical density at 570 nm is positively related to the concentration of the bacteria when the number of the bacteria is in the range of (2.0×105~5.12×107) cfu/mL, and reacting time is 2.0 h, MTT dosage is 20 μL and solvent is not added.. Conclusion: MTT colorimetry could be used to measure the viability of lactic acid bacteria. Keywords MTT colorimetry ；lactobacillus bulgaricus ；Streptococcus thermophilus ；live germ counting 基金项目：国家科技基础条件平台项目（2005DKA21204-08）资助。* 通讯作者 活菌计数在科研生产中有着广泛的应用，用于细菌计数的常规方法有平板稀释计数法(SPC)，自动菌数测定仪法，浊度法，菌体干重法等。SPC法为经典方法，但方法繁琐，耗时长，不能及时反映菌体生长情况，不适合于做大批量的实验；后几种方法不能区分细胞的死活，且测定结果受培养基、代谢产物的影响较大[1]。试验用MTT快速活菌计数法，以克服上述缺点，且工作量小，操作简单，快速，重复性好，能区分死活菌等。 MTT是一种噻唑盐，化学名3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑，结构式如图1。MTT法基本原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT的四唑环还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲臜（Fonmazan），而死细胞无此作用[2]。形成的甲臜颗粒沉积于细胞内或细胞周围，在一定细胞浓度范围内，其生成量与细胞数目和/或细胞活性呈正相关，用二甲亚砜(DMSO)溶解所生成的甲臜，通过检测光密度值变化，可间接反映细胞生长及增殖活性[3]。1 材料与方法 1.1 材料 图1 MTT的分子结构式 1.1.1 菌种 保加利亚乳杆菌（L . delbrukki subsp. bulgaricus ，L.b ）1.8501菌株和嗜热链球菌（S .thermophilus ，S.t ）3.8501菌株，均为乳品科学教育部重点实验室（KLDS ）提供。1.1.2 试剂及溶液 （1）试剂：MTT，二甲亚砜(DMSO)。 （2）MTT溶液配制：称取100 mg MTT (Amresco 分装)于小烧杯中。加20 m L P B S (0.0l m o l /L ，pH=7.2)，使其充分溶解，用0.22 μm微孔过滤器除菌，分装于1.5 mL的EP管中，4℃避光保存。两周内使用，时间过长，溶液中易进微生物起反应，改变MTT溶液的浓度。

乳酸菌菌种的分离筛选方法

乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养

常用乳酸菌培养基

常用乳酸菌培养基 SANY GROUP system office room 【SANYUA16H-

M R S培养基的组织成分（百度知道）：组成成重量(g) 牛肉蛋白粉10 鱼肉汁10 酵母浸出汁粉5 葡萄糖20 醋酸钠5 柠檬酸二铵2 吐温800.1 硫酸镁0.58 硫酸锰0.28 蒸溜水1000ml 备注：用高压锅在121℃灭菌15min，调节pH6.2～6.4 1．改良的MRS培养基（用于保加利亚乳杆菌的生长繁殖）： 胰陈10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、吐温80ml、K2HPO42g、乙酸钠5g、柠檬酸胺2g、MgSO4·7H2O0.02g、MgSO4·4H2O0.05g、蒸馏水1000ml、pH(5.6～5.8)。 3.葡萄糖-酵母膏培养基（用于嗜热链球菌的生长繁殖）： 酵母膏2.5g,蛋白胨5g,葡萄糖1g,蒸馏水1000ml,pH7.0。 4.改良M17基础培养基(用于嗜热链球菌的平板计数):

胰陈10g、牛肉膏5g、酵母膏2.5g、磷酸甘油二钠10g、MgSO4·7H2O0.25g、异维C0.5g、琼脂15g、蒸馏水950ml、pH(7.1～7.2)。 2.M17培养基(2号)：大豆胨5g；蛋白胨2.5g；酪蛋白胨2.5g；酵母浸粉2.5g；牛肉粉5g；乳糖5g；抗坏血酸钠0.5g；β-甘油磷酸钠19g；MgSO40.25g；琼脂12.75g；蒸馏水1000ml，pH7.0～7.4；121℃，15min灭菌。 LBS培养基(5号)：酵母浸粉5g；胰酪蛋白胨10g；葡萄糖20g；柠檬酸铵2g；KH2PO46g；FeSO40.034g；MgSO40.575g；CH3COONa25g；MnSO40.12g；Tween801ml；冰乙酸1.3ml；蒸馏水1000ml，pH5.5±0.2；118℃，15min灭菌。 改良MC琼脂（g/l）：用于乳酸菌的培养和计数。大豆蛋白胨5.0，牛肉膏粉5.0，酵母粉5.0，葡萄糖20.0，乳糖20.0，碳酸钙10.0，琼脂粉14.0，中 性红0.05，pH6.0±0.1，121℃、15分钟灭菌 SL培养基：蛋白胨10g；酵母粉5g；葡萄糖20g；柠檬酸二铵2g；醋酸钠 25g；硫酸镁0.58g；硫酸锰0.15g；吐温-80ml；磷酸二氢钾6g；硫酸亚铁 0.03；琼脂15——20g Elliker琼脂培养基（用于乳球菌的分离）：胰蛋白胨20g；蔗糖5.0g；酵母粉5g；氯化钠4.0g；明胶2.5g；乙酸钠1.5g；葡萄糖5g；抗坏血酸0.5g；乳糖5.0g；琼脂15—20g 明串球菌的分离和培养，选择性培养基： 1.HP培养基 植物蛋白胨20g；柠檬酸铵5g；酵母粉6g；硫酸亚铁0.04g；牛肉膏10g硫酸镁0.2g；吐温801ml；硫酸锰0.05g；葡萄糖10g

乳酸菌在泡菜生产中的应用

乳酸菌在泡菜生产中的应用 作者：杨春哲， 冉艳红 作者单位：杨春哲(山东省酿酒葡萄科学研究所,济南,250100)， 冉艳红(华南理工大学食品与生物工程学院) 刊名： 中国食物与营养 英文刊名：FOOD AND NUTRITION IN CHINA 年，卷(期)：2003(1) 被引用次数：18次 引证文献(18条) 1.王琳琳.郑一敏.胥秀英.傅善权.李杰.周慧.曾品涛肠膜明串珠菌的最适发酵培养基筛选[期刊论文]-重庆理工大学学报（自然科学版） 2010(9) 2.盛海圆.郭艳萍.常艳.张明传统泡菜中乳酸菌多样性的分析[期刊论文]-中国微生态学杂志 2010(7) 3.陈飞平微生物发酵对蔬菜腌制品品质的影响[期刊论文]-中国食物与营养 2009(9) 4.刘永娜.燕平梅.李锐绵白糖对发酵白菜中微生物区系的影响[期刊论文]-中国调味品 2009(4) 5.罗凤莲.欧阳建勋.夏延斌.王燕发酵辣椒中主要风味物质的研究进展[期刊论文]-食品工业科技 2009(7) 6.吴海波.张兰威.黄艳玲不同地域发酵蔬菜分离的乳酸菌抑菌效果及降亚硝酸盐能力的研究[期刊论文]-食品工业科技 2009(2) 7.李锐.燕平梅.刘永娜不同贮藏条件下白菜中亚硝酸盐含量的研究[期刊论文]-食品工程 2008(4) 8.胡书芳.王雁萍乳酸菌在泡菜生产中的应用[期刊论文]-安徽农业科学 2008(21) 9.姜彬.陈一.冯志彪黄瓜在纯菌接种恒温发酵过程中的化学成分变化[期刊论文]-食品工业科技 2008(12) 10.孙锦婷.陈一.姜彬.张艳梅.高晨晨发酵过程中蔬菜化学成分的变化研究[期刊论文]-食品工程 2007(2) 11.田永峰.吴天祥.胡晓瑜.赵飞乳酸菌在酿造和食品工业上的应用[期刊论文]-酿酒科技 2007(4) 12.蔡永峰.熊涛.岳国海.李绩.张贵林直投式生物法快速生产泡菜工艺条件的研究[期刊论文]-食品与发酵工业2006(6) 13.杨荣玲.肖更生.吴晓玉.刘学铭我国蔬菜发酵加工研究进展[期刊论文]-保鲜与加工 2006(2) 14.吴祖芳.刘璞.翁佩芳榨菜加工中乳酸菌技术的应用及研究进展[期刊论文]-食品与发酵工业 2005(8) 15.张坤生.刘晨.任云霞复配型防腐剂延长巴氏杀菌鸡肉香肠货架期的研究[期刊论文]-食品科学 2005(8) 16.刘哲君.王海伟.霍建伟.周锐.姜莹.丁玉萍肠膜明串珠菌,植物乳杆菌,短乳杆菌的最适培养基的筛选[期刊论文]-佳木斯大学学报（自然科学版） 2005(4) 17.乳酸菌在果蔬及谷物制品中的应用[期刊论文]-现代食品科技 2005(4) 18.张岩.肖更生.陈卫东.张友胜发酵蔬菜的研究进展[期刊论文]-现代食品科技 2005(1) 本文链接：https://www.wendangku.net/doc/6110952670.html,/Periodical_zgswyyy200301011.aspx

乳酸菌菌种的分离筛选办法

精心整理 乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 时，SL 培养基、MS 对乳酸菌无害。一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH 。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h →挑选产生溶

钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。 2.溴甲酚绿指示剂法： 培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液） 筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。 二.菌种的分离筛选 1.培养基： ★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX）1L预先灭菌碳酸钙5-10g/LPH自然（分离用） ★★1.2吐温 ★1.3 酵母膏（分离用） 1.4 1.5 MgSO 4 1.6 ★★1.7 蛋白胨 葡萄糖、琼 脂18.0g 酸钙, 1.8BCP 乳糖5.0g蛋白胨5.0g酵母膏3.0g0.5℅溴甲酚紫10ml自来水1000ml pH6.5-7.0（分离用） 1.9BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒 精溶液0.07ml，0.075Mpa20min。另取琼脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏 1.0g溶解后调pH6.5-6.8，0.1Mpa20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀， 倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。

常用乳酸菌培养基

常用乳酸菌培养基 集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-

M R S培养基的组织成分（百度知道）：组成成重量(g) 牛肉蛋白粉10 鱼肉汁10 酵母浸出汁粉5 葡萄糖20 醋酸钠5 柠檬酸二铵2 吐温800.1 硫酸镁0.58 硫酸锰0.28 蒸溜水1000ml 备注：用高压锅在121℃灭菌15min，调节pH6.2～6.4 1．改良的MRS培养基（用于保加利亚乳杆菌的生长繁殖）： 胰陈10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、吐温80ml、K 2HPO 4 2g、 乙酸钠5g、柠檬酸胺2g、MgSO 4·7H 2 O0.02g、MgSO 4 ·4H 2 O0.05g、蒸馏水 1000ml、pH(5.6～5.8)。 3.葡萄糖-酵母膏培养基（用于嗜热链球菌的生长繁殖）：酵母膏2.5g,蛋白胨5g,葡萄糖1g,蒸馏水1000ml,pH7.0。 4.改良M17基础培养基(用于嗜热链球菌的平板计数):

胰陈10g 、牛肉膏5g 、酵母膏2.5g 、磷酸甘油二钠10g 、 MgSO 4·7H 2O0.25g 、异维C0.5g 、琼脂15g 、蒸馏水950ml 、pH(7.1～ 7.2)。 2.M17培养基(2号)：大豆胨5g ；蛋白胨2.5g ；酪蛋白胨2.5g ；酵母浸粉2.5g ；牛肉粉5g ；乳糖5g ；抗坏血酸钠0.5g ；β-甘油磷酸钠19g ；MgSO40.25g ；琼脂12.75g ；蒸馏水1000ml ，pH7.0～7.4；121℃，15min 灭菌。 LBS 培养基(5号)：酵母浸粉5g ；胰酪蛋白胨10g ；葡萄糖20g ；柠檬酸铵2g ；KH 2PO 46g ；FeSO 40.034g ；MgSO 40.575g ；CH 3COONa25g ； MnSO 40.12g ； Tween801ml ；冰乙酸1.3ml ；蒸馏水1000ml ，pH5.5±0.2；118℃，15min 灭菌。 改良MC 琼脂（g/l ）：用于乳酸菌的培养和计数。大豆蛋白胨5.0，牛肉膏粉 5.0，酵母粉5.0，葡萄糖20.0，乳糖20.0，碳酸钙10.0，琼脂粉14.0，中 性红0.05，pH6.0±0.1，121℃、15分钟灭菌 SL 培养基：蛋白胨10g ；酵母粉5g ；葡萄糖20g ；柠檬酸二铵2g ；醋酸钠25g ；硫酸镁0.58g ；硫酸锰0.15g ；吐温-80ml ；磷酸二氢钾6g ；硫酸亚铁0.03；琼脂15——20g

乳酸菌维持肠道菌群的微生态平衡

乳酸菌维持肠道菌群的微生态平衡 乳酸菌表面有能与肠粘膜细胞牢固结合的特异性物质，推测可能是脂磷壁酸或肽聚糖，或细胞蛋白，或者其中二者，或三者全部。这些特异性物质被称为粘附素，乳酸菌通过粘附素与肠粘膜紧密结合，在肠粘膜表面定植占位，是形成生理屏障的主要组成部分。该屏障可以抵御外来细菌的入侵，维持肠道内微生态平衡。定植后的乳酸菌在体内发酵乳糖，产生大量的乳酸、乙酸等有机酸，使肠道pH值降低。肠内处于酸性环境，对志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等致病菌有拮抗作用。低pH值有利于肠道蠕动，维持正常生理功能，阻止致病菌的定植。嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌产生的H2O2能抑制葡萄球菌等致病菌的生长。双歧杆菌和某些乳杆菌产生的孢外糖苷酶，可降解肠粘膜上皮细胞的复杂多糖，由于这些糖是致病菌素的潜在受体，所以通过酶的作用，将其分解，阻止致病菌毒素对上皮细胞的粘附。不少乳酸菌产生细菌素如乳酸毒素、双歧杆毒素，对葡萄球菌、棱状芽孢杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌有拮抗作用。此外双歧杆菌还可将结合的胆酸分解为游离胆酸，游离胆酸对致病菌也有一定的抑制作用。 易位是肠道微生态失衡的主要原因之一，易位有纵向转移和横向转移，纵向转移是指正常菌群由原位向周围转移，横向转移是指正常菌群由原位向组织的不同层次转移[3]。正常情况下，只有少量的细菌发生纵向或横向转移，但在原籍菌的生物拮抗和宿主的免疫机制的作用下，不会引起微生态失衡。如果机体免疫功能下降，或者是滥用抗生素，使常驻菌的定植抗力下降，菌群的平衡失调，使致病菌大量繁殖、增生，并不断向周围扩散，使转移的数量过大，易位成为可能，一旦易位发生，微生物屏障就遭受破坏、导致体内微生态平衡的失调、紊乱从而引起疾病发生。易位的另一种情况是，有些细菌在正常情况下对人体是有益的，易位后反而成了致病菌——机会致病菌，对人体有害。如肠球菌在肠道和口腔部位是正常菌群，但由于菌群失衡或宿主免疫功能下降，该菌可通过粘膜渗透，易位（纵向转移）于心脏、脑、尿道、胆道等部位则可分别引起心内膜炎、脑膜炎、尿道炎及胆道炎等疾病。 乳酸菌可防止肠道菌群发生易位，其作用机理有以下几个途径。第一，乳酸菌直接参与构成肠道定植抗力，阻止病原菌的定植和入侵；第二，对肠道有营养作

乳酸菌及其乳酸菌发酵食品

乳酸菌及其乳酸菌发酵食品 发酵是一种古老、传统的食品储存与加工的方法，凡利用微生物的作用而制得的食品都可以称为发酵食品。发酵食品是人类巧妙地利用有益微生物加工制造的一类食品，具有独特的风味和营养价值，丰富了我们的饮食生活。发酵食品因在食品加工过程中有微生物参与作用，进而可以形成一些特异性风味物质和营养因子，如乳酸菌参与牛乳发酵，产生乙醛、丁二酮、丙酮、3-羟基丁酮、挥发性酸等芳香物质，以及胞外多糖、乳酸菌素、γ-氨基丁酸等营养因子。 乳酸菌是发酵食品最主要的有益微生物之一，人类对于乳酸菌的应用历史非常久远，在远古人类就在酿造食品方面不自觉地利用了乳酸菌。但是，人类能主动地去研究和掌握乳酸菌的生活规律，并加以应用，还是近百年的事。 1 乳酸菌 1.1 乳酸菌的分类 乳酸菌是一类以糖为原料产乳酸为主的细菌的总称，乳酸菌不是分类学上的名词，属于真细菌纲(Eubacteriac)真细菌目(Eabacteriales)中的乳酸细菌科(lactobacillaceae)。在伯杰氏系统细菌分类学上，目前已发现的乳酸菌，至少分布于乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Strptococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)，乳球菌属(Lactococcus)等19个属的微生物中。其中，在食品、医药等领域应用较多的乳酸菌主要分布在乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、片球菌属和明串珠菌属等七个属种。 1.2 乳酸菌的基本特性 乳酸菌是革兰氏阳性，不形成芽孢(个别属除外)，不运动或少运动，不耐高温，但耐酸的球菌或杆菌，乳酸菌是一种兼性厌氧菌，适合于在氧含量低或无氧的环境中生长。与其它细菌相比，乳酸菌对营养的要求比较严格，除了要供给适量的水分、充足的碳源、氮源和无机盐类外，还需要加入维生素、氨基酸等生长因子。乳酸菌都能发酵一定的糖类产生乳酸，但分解蛋白质和脂肪能力微弱，过氧化氢酶反应呈阴性，适宜在偏酸的环境中生长，可使培养基pH 值降到5.0以下，产酸及耐酸能力都较强。 1.3 乳酸菌的发酵类型 乳酸菌的发酵根据产物的不同，分为三种类型：同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和双歧发酵。同型乳酸发酵是指发酵终产物中90%以上为乳酸的乳酸发酵过程，以乳酸链球菌和多数乳酸杆菌为主。异型乳酸发酵是指发酵终产物中除乳酸外,还有乙醇、二氧化碳等成分的乳酸发酵过程，以明串珠菌属的乳酸菌以及某些乳酸杆菌,如肠膜明串珠菌、短乳杆菌、甘露醇乳杆菌等。双歧发酵是双歧杆菌的产能模式，双歧杆菌是一类特殊的严格厌氧菌,对营养要求较高,它们对葡萄糖的代谢也可归入异型乳酸发酵,但与其他乳酸菌的异型发酵不同。 1.4 乳酸菌的代谢产物 乳酸菌发酵的代谢产物主要有有机酸类、细菌素类、乙醛等芳香物质、胞外多糖、γ-氨基丁酸等。有机酸类主要有乳酸、乙酸，及少量的甲酸、丙酸等，具有抗菌防腐的作用，并带给食品酸性的口感；细菌素又称乳酸菌素，具有固定抗菌谱，对病原菌和腐败菌具有很强的抑制能力；乙醛等芳香物质给乳酸菌发酵食品带来独特的发酵风味；胞外多糖作为生命物质的重要组成部分，广泛参与细胞的各种生命现象及生理过程的调节；γ-氨基丁酸是神经系统中重要的抑制性神经递质，具有改善脑机能，调节情绪抗焦虑，降低血压等方面具有重要作用。

乳酸菌菌种及发酵乳品

乳酸菌菌种及发酵乳品、乳制品 无铅鹌鹑皮蛋、清凉薄荷水系列项目简介 一、清凉薄荷水 清凉爽口、消暑解渴，不含任何防腐剂及有害物质，口味口感赶上甚至超过南剑牌薄荷水，投资小获利大（利润超过８０％），市场前景（特别是夏季）可观。 二、无铅鹌鹑皮蛋 皮蛋是已消费者广为喜爱的传统食品，无铅鹌鹑皮蛋是近年出现的新兴皮蛋品种。我系研制的无铅鹌鹑皮蛋与传统鸭皮蛋相比，风味更加浓厚、回味更为悠长，营养愈加丰富，成熟期短（１５天左右），以锌代铅，不但去除了传统工艺中的有害物质“铅”，更有补锌功效。可主要以手工操作方式生产，故能减少设备投入，降低生产成本，实为一相投入小、获利大，且投资风险极低的项目。 三、系列乳制品项目简介 “一杯牛奶强壮一个民族”，奶畜饲养及其乳品加工是目前我国农业产业化重点发展的方向。通过近几年来对原料乳（牛乳、羊乳）、乳酸菌选育及其生物学特性、系列乳品加工工艺及配方、乳制品保藏等方面的研究和开发，对凝固型酸奶、搅拌型酸奶、活性乳酸菌饮料、灭菌型乳酸菌饮料、保健型酸奶、酸奶冰淇淋、山药酸奶冰淇淋等具有成熟的成套技术。一些产品技术已在一些乳品企业成功应用，技术可靠，企业经济效益较好。根据投资规模，本技术项目特别适宜于中、小乳品企业。 四、优良乳酸菌菌种及其发酵乳品应用技术项目简介 发酵乳品特别是保健型发酵乳品是乳业发展的方向。10多年来，我们通过引进、筛选、选育获得了应用于发酵乳品生产的各种菌种，类别上有产香型、产粘型、产酸型三类菌种，主要有保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、植物乳杆菌等菌种的不同菌株。可以提供试管菌种、冻干菌种、干粉菌种，满足不同生产的需要。也可提供系列发酵乳品生产的成套技术。 五、全汁猕猴桃酒的生产技术项目简介 猕猴桃誉为“水果之王”，随着退耕还林工程的实施，是近年来发展较快的一类水果。猕猴桃酒正处于研究和开发中，市场上该类产品很少，具有广阔的市场前景。我们通过研究选育获得了适宜于猕猴桃酒酿造的优良酵母菌种（优于其他果酒酵母）、比较了不同的发酵工艺，筛选并组装出了猕猴桃酒的生产工艺技术。本项目可以提供酵母菌种和全汁猕猴桃酒的生产技术。 联系人：秦文蒲彪陈安均 联系电话：0835- 288287528824382882340

常用乳酸菌培养基

常用乳酸菌培养基 MRS培养基的组织成分： 组成成重量(g) 牛肉蛋白粉10 鱼肉汁10 酵母浸出汁粉 5 葡萄糖20 醋酸钠 5 柠檬酸二铵 2 吐温80 0.1 硫酸镁0.58 硫酸锰0.28 蒸溜水1000ml 备注：用高压锅在121℃灭菌15min，调节pH6.2～6.4 1．改良的MRS培养基（用于保加利亚乳杆菌的生长繁殖）： 胰陈10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、吐温80ml、K2HPO4 2g、乙酸钠5g、柠檬酸胺2g、MgSO4·7H2O 0.02g、MgSO4·4H2O 0.05g、蒸馏水1000ml、pH(5.6～5.8)。3.葡萄糖-酵母膏培养基（用于嗜热链球菌的生长繁殖）： 酵母膏2.5g, 蛋白胨5g, 葡萄糖1g, 蒸馏水1000ml ,pH7.0。 4.改良M17基础培养基(用于嗜热链球菌的平板计数): 胰陈10g、牛肉膏5g、酵母膏2.5g、磷酸甘油二钠10g、MgSO4·7H2O 0. 25g、异维C0.5g、琼脂15g、蒸馏水950ml、pH(7.1～7.2)。 5. M17培养基(2号)： 大豆胨5g；蛋白胨2.5g；酪蛋白胨2.5g；酵母浸粉2.5g；牛肉粉5g；乳糖5g；抗坏血酸钠0.5g；β-甘油磷酸钠19g；MgSO 4 0.25g；琼脂12.75g；蒸馏水1000ml，pH7.0～7.4；121℃，15min灭菌。 6. LBS培养基(5号)：酵母浸粉5g；胰酪蛋白胨10g；葡萄糖20g；柠檬酸铵2g；KH2 PO4 6g；FeSO4 0.034g；MgSO4 0.575g；CH3COONa 25g；MnSO4 0.12g；Tween80 1ml；冰乙酸1.3ml；蒸馏水1000ml，pH5.5±0.2；118℃，15min灭菌。 7. 改良MC琼脂（g/l）：用于乳酸菌的培养和计数。大豆蛋白胨5.0，牛肉膏粉5.0，酵母粉5.0，葡萄糖20.0，乳糖20.0，碳酸钙10.0，琼脂粉14.0，中性红0.05，pH6.0±0.1，121℃、15分钟灭菌 8. SL培养基：蛋白胨10g；酵母粉5g；葡萄糖20g；柠檬酸二铵2g；醋酸钠25g；硫酸镁0.58g；硫酸锰0.15g；吐温-80 ml；磷酸二氢钾6g；硫酸亚铁0.03；琼脂15——20g 9. Elliker琼脂培养基（用于乳球菌的分离）：胰蛋白胨20g；蔗糖5.0g；酵母粉5g；氯化钠4.0g；明胶2.5g；乙酸钠1.5g；葡萄糖5g；抗坏血酸0.5g；乳糖5.0g；琼脂15—20g 10.明串球菌的分离和培养，选择性培养基： 1）. HP培养基植物蛋白胨20g；柠檬酸铵5g；酵母粉6g；硫酸亚铁0.04g；牛肉膏10g 硫酸镁0.2g；吐温80 1ml；硫酸锰0.05g；葡萄糖10g 2）. 蔗糖硫胺培养基蔗糖100g ；磷酸氢二钾5g；酵母粉2.5g；硫酸镁0.2g；硫酸铵0.2g；氯化钠0.6g；琼脂15—20g 。

乳酸菌的功效和作用

乳酸菌的功效和作用 乳酸菌是一种发酵制品.一般来说在葡萄糖中发酵的细菌都被叫做乳酸菌.它是一种对人体有益的菌.像人们平时所喝的酸奶,啤酒等等需要用来发酵的都有它的加入.像电视上的酸奶广告,就经常会说此酸奶中添加了活性乳酸菌.这个活性乳酸菌就是对人体很有的益生菌.可以说乳酸菌在生活中被用到的地方很多. 乳酸菌一般被分为两类,一种是从动物中提取的,一种是植物.也就是常说的动物源和植物源的乳酸菌.那么乳酸菌都有什么对人体好的功效和作用呢?今天就来说一下. 乳酸菌在动物体内能发挥许多的生理功能.大量研究资料表明,乳酸菌能促进动物生长,调节胃肠道正常菌群、维持微生态平衡,从而改善胃肠道功能;提高食物消化率和生物效价;降低血清胆固醇,控制内毒素;抑制肠道内腐败菌生长:提高机体免疫力等. 乳酸菌通过发酵产生的有机酸、特殊酶系、酸菌素等物质具有特殊生理功能,可刺激组织发育,对机体的营养状态、生理功能、免疫反应和应激反应等产生作用. 1.提供营养物质,促进机体生长乳酸菌如果能在体内正常发挥代谢活性,就能直接为宿主提供可利用的必需氨基酸和各种维生素(维生素B族和K等),还可提高矿物元素的生物活性,进而达到为宿主提供必需营养物质、增强动物的营养代谢、直接促其生长的作用. 2.改善胃肠道功能,维持肠道菌群平衡动物的整个消化道在

正常情况下都寄生有大量微生物. 3.改善免疫能力.乳酸杆菌和双歧杆菌一方面能明显激活巨噬细胞的吞噬作用,另一方面由于它能在肠道定植,相当于天然自动免疫. 常喝含乳酸菌的酸奶,对身体是非常好的,多吃含有乳酸菌制成的食物,能够帮助身体吸收营养,而且乳酸菌在进入人体内后还可以帮助人们控制自己身体内的毒素,防止毒素继续生长.

DVS乳酸菌种菌株传代过程中遗传稳定性分株中的作用

42卷　2期2002年4月 微生物学报 Acta Microbiologica Sinica V ol.42April N o.2 2002 作者简介:孔　健(1964-),女,山东菏泽人,山东大学微生物技术国家重点实验室副教授,博士,主要从事乳酸菌应用基础性研究。 收稿日期:2001211206,修回日期:2001212219 限制和修饰系统Lla BIII 在构建抗噬菌体菌株中的作用 孔　健1 　Jytte Josephsen 2 　马桂荣 1 (1山东大学微生物技术国家重点实验室　济南　250100)(2丹麦皇家畜牧农业大学乳制品和食品科学系　丹麦) 关键词:乳酸乳球菌,噬菌体,限制和修饰系统,乳制品发酵 中图分类号:Q933 文献标识码:A 文章编号:000126209(2002)022******* 限制和修饰(restriction and m odification ,R ΠM )系统是指由限制性内切酶和甲基化酶组成的单亚基或多亚基复合酶系统,两者通常成对出现,具有相同的DNA 识别位点,其作用相反。R ΠM 系统在原核生物中普遍存在,在保护细胞免遭外源病毒侵害方面具有重要作用[1]。 作为发酵剂的乳酸乳球菌在乳制品发酵中具有重要作用,但这类菌株极易遭受噬菌体感染,导致菌株产酸力降低,甚至发酵失败,造成严重的经济损失。所以在乳制品发酵过程中防止噬菌体感染就成为十分重要的问题。 通过自然筛选或诱变处理等手段筛选噬菌体不敏感突变株以及利用基因克隆技术构建抗噬菌株菌株在发酵过程中起到了良好的抗噬菌体感染效果[2,3]。质粒pJW566分离于乳酪发酵剂乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis subsp.cremoris )W56[4],发现携带有一种新的编码限制和修饰(R ΠM )系统的基因Lla BI 2II [5] (G enBank 注册号为AF347071),本文通过电转化方法将R ΠM 系统Lla BIII 导入到不同的乳酸乳球菌 中,分析含有R ΠM 系统Lla BIII 的工程菌株对噬菌体的抗性。 1　材料和方法 1.1　菌株、噬菌体和培养基 11111　菌株和噬菌体:本实验所有菌株和噬菌体列表于1。 11112　培养基:乳酸乳球菌培养基(G M17)为M17培养基(Difco ),加015%葡萄糖;转化培养基(SG M17) 为M17培养基,加1%葡萄糖,215mm ol ΠL MgCl 2,215mm ol ΠL CaCl 2,5μg Πm L 氯霉素;噬菌体感染培养基为 G M17培养基加5mm ol ΠL CaCl 2。1.2　质粒DNA 的提取 L .Lactis 培养到指数生长期,离心收集菌体。菌体细胞用10mg Πm L 溶菌酶37℃酶解20min ,用GI A 2 GE N plasmid Mini 2prep kit (Chatsw orth ,US A ),按照实验说明提取质粒DNA 。1.3　噬菌体效价(efficiency of plating ,EOP)的测定 噬菌体在抗性菌株中的噬菌斑数与在敏感菌株中的噬菌斑数之比,敏感菌株的E OP 为1。噬菌斑的测定采用双层平板法。 1.4　电转化 参见H olo 和Nes 的方法[6]。电穿孔仪为G ene Pulser (BioRad 公司产品),脉冲参数1125kV Πmm ,25μF 和200 Ω。

36种常用微生物培养基配制汇总

36 种微生物常用培养基配制 1. 牛肉膏蛋白胨培养基（用于细菌培养） 牛肉膏3g,蛋白胨10g, NaCI 5g ,水1000mL pH7.4?7.6。 2. 高氏1 号培养基（用于放线菌培养） 可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCI 0.5g ，K2HPO4?3H2O0.5g，MgS04?7H200.5gFeS04?7H200.01,水1000mL pH7.4?7.6。配制时注意：可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以上培养基中。 3. 马丁氏（Martin ）培养基（用于从土壤中分离真菌） K2HPO41g MgSO4?7H2O0.5g蛋白胨5g,葡萄糖10g, 1/3000 孟加拉红水溶液100mL水900mL自然pH, 121C湿热灭菌30min。待培养基融化后冷却55?60C时加入链霉素（链霉素含量为30 卩g/mL）。 4. 马铃薯培养基（PDA）（用于霉菌或酵母菌培养） 马铃薯（去皮）200g，蔗糖（或葡萄糖）20g，水1000mL配制方法如下： 将马铃署去皮，切成约2cm2的小块，放入1500mL的烧杯中煮沸 30mi n,注意用玻棒搅拌以防糊底，然后用双层纱布过滤，取其滤液加

糖，再补足至1000mL自然pH,霉菌用蔗糖，酵母菌用葡萄糖。 5. 察氏培养基（蔗糖硝酸钠培养基）（用于霉菌培养） 蔗糖30g, NaNO32g, K2HPO41g, MgSO4?7H2O0.5,gKCl 0.5g, FeSO4?7H2O0.1,水1000mL pH7.0?7.2。 6. Hayflik 培养基（用于支原体培养） 牛心消化液（或浸出液）1000mL,蛋白胨10g,NaCI 5g,琼脂15g, pH7.8?8.0，分装每瓶70mL 121C湿热灭菌15min,待冷却至80C 左右，每70mL中加入马血清20mL 25%羊酵母浸出液10mL 15醋酸铊水溶液2.5mL,青霉素G钾盐水溶液（20万单位以上）0.5mL ,以上混合后倾注平板。 *注意：醋酸铊是极毒的药品，需特别注意安全操作。 7. 麦氏（McCLary）培养基（醋酸钠培养基） 葡萄糖0.1g, KCl 0.18g ，酵母膏0.25g，醋酸钠0.82g，琼脂 l.5g，蒸馏水l00mL。溶解后分装试管，1l5 C湿热灭菌15min 8. 葡萄糖蛋白胨水培养基（用于V.P.反应和甲基红试验） 蛋白胨0.5g，葡萄糖0.5g, K2HPO4 0.2g,水100mL pH7.2,

乳酸菌的分离培养

乳酸菌的分离培养 保加利亚乳杆菌 组长： 组员： 实验目的： 1.学习并掌握普通光学显微镜油镜的使用技术及微生物形态观察； 2.学习微生物制片、染色的基本技术，掌握乳酸菌的简单染色法及无菌操作接种技术； 3.通过对培养基的配制，了解配制培养基的一般步骤和方法，掌握微生物实验常用的器皿的清洗与包扎、培养基的制备、消毒灭菌。 4.了解各种灭菌的基本原理和应用范围，以及实验室中常用的灭菌方法。 5.了解酸奶中乳酸菌分离原理, 观察乳酸菌的基本形态,掌握用显微镜测微尺测量微生物细胞大小、数目的测定的方法。 6.了解稀释平板计数的原理，熟练掌握混合平板培养法。明确显微镜计数的原理并学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。 7．初步学会乳酸菌培养的基本技术，了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理和方法，掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。 8.了解并掌握微生物菌种保藏的常用方法及其优缺点，并了解不同微生物对不同的生物大分子的分解利用情况，认识微生物代谢类型的多样性。 实验原理：乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，本实验中 用革兰氏染色法进行染色，革兰氏染色法是根据细菌细胞壁成分不同,脱色效果不同从而可以将细菌区分为G+和G-菌。通过革兰氏染色以及形态学观察，乳酸菌呈紫色，为革兰氏阳性菌；乳酸菌应为乳杆菌和乳球菌的混合体。酸奶中含有乳酸菌，而且目前市场上销售的酸奶中通常含有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌四种菌。细菌及其它一些微生物的大小，通常用测微计来测量，测微计分接目测微计与镜台测微计；培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组份的营养物质调制而成的营养基质；灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物，包括芽孢；自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物的特性或者要大量培养或者使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这些获得纯培养的方法称为微生物的分离和纯化。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。 实验器材： 样品：含乳酸菌的酸奶 ①培养基：改良MRS固体培养基 蛋白胨5g 牛肉膏5g 酵母提取物 2.5g 柠檬酸二铵1g 水500mL 乙酸钠2.5g K2HPO4 1g MnSO4·4H2O 0.125 吐温80 0.5mL 琼脂12.5g MgSO4·7H2O 0.29g CaCO3 5g 葡萄糖10g 。 仪器用品：500ml烧杯一个100ml量筒一个无菌培养皿12个 250ml容量三角瓶2个5ml无菌移液管1ml无菌移液管6只 15ml试管7只高压灭菌锅天平

乳酸菌的分离纯化说课讲解

乳酸菌的分离纯化

乳酸菌的分离与纯化 1.实验目的 2.实验材料 2.1试验设备 天平、牛角匙、电炉、 pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、试管、棉塞、培养基、吸管、牛皮纸、线绳、标签、 500mL 锥形瓶两个、 250mL锥形瓶两个、试管20只、 500mL烧杯两个、 250mL 烧杯两个、 100mL烧杯两个、酒精灯、石棉网、接种针（环）。 2.2实验仪器 50L的高压蒸汽灭菌锅、恒压干热灭菌箱、超镜台、光学显微镜、 75%酒精棉、冰箱。 2.3实验药品 新鲜酸奶、脱脂奶粉或全脂奶粉、蔗糖、 1.6%溴甲酚绿乙醇溶液、酵母膏、琼脂、结晶紫染液、卢戈氏碘液、 95%乙醇、诗坛酸复红染液。 3.试验方法及操作过程 3.1BCG牛乳培养基配方及灭菌 （A）液：脱脂奶粉10克，水50ml，加入1.6%溴甲酚绿乙醇溶液1ml，80℃灭菌20min。 （B）液：酵母膏1克，水50克，琼脂2克，pH6.8，121℃灭菌2.min。 按照配方正确称取所需药品放于烧杯中，在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解，用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照，加琼脂溶化，

加热过程要不断搅拌，可适当补水。琼脂完全溶解后倒入250mL的锥形瓶中，用纱布包扎好（注意不要污染纱布） 再用牛皮纸包扎，贴上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。在高压锅中，在1kg/cm2压力下维持30min。 3.2倒BCG培养基平板的方法 将灭好菌的A液和B液趁热充分混合，点燃酒精灯对周围的空气进行灭菌，并在酒精灯的附近用左手握着平板用拇指和小拇指打开一个小缝，趁热将培养液倒如平板内，倒入的量能使培养基刚要覆盖平板底部，倒好后把平板平放到实验台，轻轻晃动是培养基形成一个平面，等培养基冷却凝固后倒放并贴上标签。（注意：整个实验要在酒精灯附近做，以保证培养基不染菌） 3.3脱脂乳试管的配制与灭菌 直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10克与蔗糖5克，水95克（蔗糖与水的比例在1：10的范围内）的比例配制，装量以试管的1/3为宜，115℃灭菌15min。 3.4乳酸菌的分离纯化 取市场销售的新鲜的酸奶，分别用接种针接入BCG牛培养基琼脂平板上，40℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。 选取乳酸菌典型菌落转致脱脂乳试管中，40℃培养8~24h若牛乳出现凝固，无气泡，显酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色显阳性，则可将其连续传代3次，最终选择出在3~6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。 3.5乳酸发酵及检查

乳酸菌检测国标方法

乳酸菌检测方法 1 适用范围 本方法适用于清谷田园食品有限公司系列产品及原料中的乳酸菌的检测。 2 设备和仪器 2.1 恒温培养箱：36±1℃ 2.2 天平：感量为0.01g 2.3 无菌吸管：1 ml、2ml、10ml 2.4 无菌锥形瓶：500ml 2.5 无菌培养皿：直径为90mm 2.6 无菌试管：18×180mm 2.9 酒精灯 2.10 立式蒸汽压力灭菌器 2.11 超净工作台 2.12 厌氧缸 3试剂 3.1 无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。 3.2 MRS（Man Rogosa Sharpe）培养基 3.2.1 成分蛋白胨 10.0g 牛肉粉 5.0g 酵母粉 4.0g 葡萄糖 20.0g 吐温80 1.0mL K2HPO4.7H2O 2.0g 醋酸钠.3H2O 5.0g 柠檬酸三铵 2.0g

MnSO4.7H2O 0.2g MnSO4.4H2O 0.05g 琼脂粉 15g 3.2.2制法：将上述成分加于1000mL蒸馏水中，调节PH至6.2±0.2，加热煮沸溶解，分装于锥形瓶中，在121℃高压灭菌15-20min。 3.3莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）和半胱氨酸盐酸盐改良 MRS 培养基： 3.3.1 莫匹罗星锂盐储备液制备：称取50mg莫匹罗星锂盐加入到50 mL蒸馏水中，用0.22 mm微孔滤膜过滤除菌。 3.3.2 半胱氨酸盐酸盐储备液制备：称取250mg莫匹罗星锂盐加入到50 mL 蒸馏水中，用0.22 mm微孔滤膜过滤除菌。 3.3.3 制法 将A.1.1 成分加入到950 mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH，分装后121 ℃高压灭菌15 min～20 min。临用时加热熔化琼脂，在水浴中冷至48 ℃，用带有0.22 mm微孔滤膜的注射器将莫匹罗星锂盐储备液及半胱氨酸盐酸盐储备液制备加入到熔化琼脂中，使培养基中莫匹罗星锂盐的浓度为50 mg/mL，半胱氨酸盐酸盐的浓度为500 mg/mL。 3.4 MC培养基 3.4.1 成分