whxGE 推出富集多种蛋白的 Mag 磁珠 Sepharose

Protein A Mag Sepharose，Protein G Mag Sepharose和NHS Mag Sepharose是为简化免疫沉淀或pull-down应用中目的蛋白的富集而设计的磁珠。固定在Mag Sepharose磁珠上的抗体或其它蛋白用于目的蛋白的捕获，随后利用磁性装置收集磁珠。

Mag Sepharose磁珠的主要优势在于：

? 可见且密度大，易于辨认和收集结合的目的蛋白

? 非附着的磁珠避免了剪切作用和聚集物形成。使用时无需去污剂。

? 轻松捕获小体积或大体积样品中的目的蛋白（低至微升，高至毫升）

? 为富集/免疫沉淀目的蛋白而优化过的容量——只需少量的抗体

? 灵活的步骤，洗脱条件为电泳和质谱分析而优化

每种磁珠目前都有两种包装规格：1×500 μl 浆体，适合20个样品；4×500 μl，适合80个样品。再加上MagRack 6，一种处理微量离心管中磁珠的分离工具，每次能平行处理最多6个样品。

目的蛋白的可靠捕获

Protein A Mag Sepharose和Protein G Mag Sepharose是亲和层析填料（树脂），带有蛋白A 或蛋白G配体，这两者对单克隆或多克隆抗体都有着高亲和力。Mag Sepharose填料的蛋白A或蛋白G配体上固定的抗体可用于免疫沉淀中目的蛋白的捕获。NHS Mag Sepharose是为任何含有自由氨基的蛋白或生物分子的共价偶联而设计的，可用于多种类型的pull-down实验。点击索取说明书

简化的操作

磁珠形式有着适合小规模实验的杰出性质。磁珠的高密度允许磁性装置的快速捕获，而磁珠的可见性确保了免疫沉淀/pull-down应用中所有结合的目的蛋白的可靠收集。这实现了低丰度目的蛋白样品的浓缩，从毫升降至微升。从25 ml样品起始，可以获得体积低至2.5 μl的富集产物。填料的特征总结在表1。

所有产品都提供了为下游分析（如MALDI-ToF和LC-MS）的样品制备而优化的操作步骤。

MagRack 6最多能够制备1.5 ml微量离心管所捕获的6个样品。当离心管放置在架子上时，磁珠在几秒钟内被吸引到磁铁上。这样能轻松去除上清，而磁珠保留在管内。对于更大的样品体积，在结合目的蛋白时可使用50 ml塑料管。在目的蛋白的初次捕获之后，推荐使用磁力贴，将磁珠转移至更小的管中。或者可利用外摆式的离心机让磁珠旋转下沉。

为了操作更方便，还有Protein A/G SpinTrap Buffer Kit和NHS SpinTrap Buffer Kit可供选择。这些缓冲液试剂盒省去了耗时的缓冲液制备，从而促进了快速、重复性高的蛋白富集。

表1. Protein A Mag Sepharose，Protein G Mag Sepharose和NHS Mag Sepharose的特征Protein A Mag Sepharose

? 基质顺磁、高度交联琼脂糖的球形颗粒? 配体天然的蛋白A

? 结合能力8-17 mg人IgG/ml凝胶

? 颗粒大小37-100 μm

? 工作温度室温

? 储存液20%乙醇

? 储存温度4-8 °C

Protein G Mag Sepharose

? 基质顺磁、高度交联琼脂糖的球形颗粒? 配体蛋白G

? 结合能力13-22 mg人IgG/ml凝胶

? 颗粒大小37-100 μm

? 工作温度室温

? 储存液20%乙醇

? 储存温度4-8 °C

NHS Mag Sepharose

? 基质顺磁、高度交联琼脂糖的球形颗粒? 配体N-羟基琥珀酰亚胺

? 结合能力8-14 μmol/ml凝胶

? 颗粒大小37-100 μm

? 工作温度室温

? 储存液2-丙醇

? 储存温度4-8 °C

灵活的操作步骤

对于Protein A Mag Sepharose或Protein G Mag Sepharose，有两种蛋白富集的操作步骤可供选择：(1) 交联步骤，其中目的蛋白被洗脱，而抗体仍通过交联剂共价结合在基质上，(2) 经典步骤，其中目的蛋白与抗体一起洗脱。

NHS Mag Sepharose是预先激活的，来自不同物种的蛋白、抗体和适体（aptamer）可通过主要的氨基共价偶联。在第二步中，目的分子被亲和捕获，并在交联步骤中洗脱。

蛋白富集的最佳参数取决于样品中存在的生物分子的特定组成。因此针对每种特定组成，需要优化缓冲液，以便获得最佳结果。产品操作说明中列出了推荐的缓冲液。

重复性好的蛋白富集：标杆分析

为了展示效率和重复性，通用电气医疗集团的实验室通过运行9次重复，评估了Protein A Mag Sepharose。用Dynabeads? Protein A（Invitroge 公司）设立了平行实验，作为比较。

利用兔抗人转铁蛋白的多克隆抗体，从非标记的大肠杆菌蛋白背景下富集用Cy?5染料标记的人转铁蛋白。对于两种填料，都采用了交联步骤，并根据产品附带的操作指南处理每种填料（表2）。洗脱的组分用SDS-PAGE（ExcelGel?）来分析，用Deep Purple?总蛋白染料进行后染，并用Ettan? DIGE Imager扫描。

Protein A Mag Sepharose与Dynabeads Protein A相比，显示出明显更高的回收率，两者的回收率分别为53%和20%（图1）。纯度与纯度平均值几乎是相同的，Protein A Mag Sepharose为52%，Dynabeads Protein A为50%。

表2. 实验条件

Protein A Mag Sepharose

Dynabeads Protein A 分离填料 25 μl 凝胶浆体，Protein A Mag Sepharose

50 μl 凝胶浆体，

Dynabeads Protein A 样品 5 mg/ml 大肠杆菌蛋白，含有7.5 μg/ml 人转铁蛋白 5 mg/ml 大肠杆菌蛋

白，含有7.5 μg/ml 人转铁蛋白

样品体积 200 μl 200 μl 抗体 兔抗人转铁蛋白的多克隆抗体 兔抗人转铁蛋白的多

克隆抗体

结合缓冲液 Tris 缓冲盐（TBS ）：50 mM Tris ，150 mM NaCl ，pH 7.5

0.1 M 磷酸钠，0.01% Tween? 20，pH 8.2

洗涤缓冲液 TBS ，2 M 尿素，pH 7.5

磷酸盐缓冲液（PBS ）洗脱缓冲液 2×50 μl 0.1 M 甘氨酸/HCl ，2 M 尿素，pH 2.9

2×50 μl 0.1 M 甘氨酸/HCl ， pH 2.9

图1. Protein A Mag Sepharose （蓝色）和Dynabeads Protein A （红色）之间关于人转铁蛋白的(A) 回收率和(B) 纯度的比较。

在复杂的混合物中发现低丰度的酪氨酸磷酸化蛋白

活跃在信号通路中的蛋白一般不会在无样本制备的情况下被SDS-PAGE 或质谱分析检测到，因其丰度低。

Protein G Mag Sepharose 填料及固定的抗-pTyr 抗体用于富集和浓缩酪氨酸磷酸化的蛋白，并以适合质谱分析的体积洗脱。

CHO 细胞（7×107）用100 μM 过钒酸盐预处理3小时，之后收集并裂解。裂解液，包括蛋白酶和磷酸酶抑制剂，通过离心来澄清，并稀释两倍，再与Protein G Mag Sepharose 上固定的抗-pTyr 抗体在室温下共同孵育60分钟（滚动）。用2×100 μl 100 mM 磷酸苯酯洗脱酪氨酸磷酸化的蛋白。在LC-MS/MS 分析之前进行胰酶消化。制备未处理的细胞，作为对照。

质谱鉴定得到76个潜在酪氨酸磷酸化蛋白的hits ，其中54个只在过钒酸盐处理过的细胞中发

现（数据未显示）。这些蛋白中的大部分属于焦点的粘附相关的通路。未处理的细胞只得到22个hits ，大部分是高丰度酶和核糖体蛋白。

结合抗-pTyr 抗体，Protein G Mag Sepharose 是一种很有力的工具，能从大量起始样品中捕获参与了不同信号通路的低丰度蛋白。

从人血浆中富集血纤维蛋白溶酶原（plasminogen ）

NHS Mag Sepharose 显然是血浆样品进行免疫沉淀的首选，因为内源的免疫球蛋白可能会与Protein A Mag Sepharose 或Protein G Mag Sepharose 上剩余的自由配体结合。此外，一些抗体比如小鼠IgG1，众所周知在正常条件下与Protein A 和Protein G 的结合不佳。

人血浆中含有大量蛋白，因蛋白浓度的范围广，可能很难处理。这个免疫沉淀实验显示，利用

NHS Mag Sepharose 上偶联的小鼠单克隆抗体，能有效地从血浆样品中富集血纤维蛋白溶酶原。

利用NHS Mag Sepharose 上共价偶联的抗血纤维蛋白溶酶原小鼠IgG1单克隆抗体，从人血浆中富集血纤维蛋白溶酶原。在平行实验中，相同的抗体被Protein A Mag Sepharose 捕获。抗体首先与1.2 M KH2PO4混合，以便增加小鼠IgG1抗体与蛋白A 配体的亲和力，然后抗体交联。

为了去除内源的IgG ，样品在HiTrap? Protein A HP 柱上澄清。两个富集实验的组分都在SDS-PAGE 上分析（图2）。血纤维蛋白溶酶原进一步由LC-MS/MS 鉴定。

两种实验设置确保了目标蛋白的高水平富集。操作步骤稍作改动后，可克服小鼠单克隆IgG1与蛋白A 的亲和力差。

A. NHS Mag Sepharose

B. ? 亲和填料：25 μl NHS Mag Sepharose

C. ? 样品：人血浆

D. ? 样品体积：6 ml

E. ? 抗体：抗血纤维蛋白溶酶原的小鼠单克

隆IgG1

F. ? 偶联缓冲液：0.15 M 三乙醇胺，0.5 M

NaCl ，pH 8.3

G. ? 结合缓冲液：Tris 缓冲盐（TBS ：50 mM

Tris ，150 mM NaCl ，pH7.5）

H. ? 洗涤缓冲液：TBS ，2 M 尿素，pH 7.5 I. ? 洗脱缓冲液：2×50 μl 0.1 M 甘氨酸

/HCl ，2 M 尿素，pH 2.9

B. Protein A Mag Sepharose

? 亲和填料：25 μl Protein A Mag Sepharose ? 样品：人血浆 ? 样品体积：10 ml

? 抗体：抗血纤维蛋白溶酶原的小鼠单克隆IgG1

? 结合缓冲液：1.2 M KH2PO4，pH 9（增加小鼠IgG1和蛋白A 的亲和力）

? 洗涤缓冲液：TBS ，2 M 尿素，pH 7.5

? 洗脱缓冲液：2×50 μl 0.1 M 甘氨酸/HCl ，2

M 尿素，pH 2.9

图2. 从人血浆中富集血纤维蛋白溶酶原。(A) NHS Mag Sepharose 的SDS-PAGE 结果。(B) Protein A Mag Sepharose 的SDS-PAGE 结果。凝胶用Deep Purple 蛋白染料后染，并用Ettan DIGE Imager 扫描。箭头指示出血纤维蛋白溶酶原的位置。