基因工程复习要点
一名词解释：
1基因：是遗传信息的基本单位，携带着某种蛋白质或RNA的遗传信息。从化学本质上看，基因是一段携带特定遗传信息的脱氧核糖核苷酸(DNA)序列，是构成巨大遗传单位染色体的组成部分。
2基因工程：按照人们的愿望，进行严密的设计，利用体外DNA重组和转基因等生物技术，有目的地改造生物性状使之具有满足人们特定需求的能力。最突出的优点：打破了常规育种难以突破的物种之间的界限，使不同的物种之间可以进行遗传信息的重组和转移。
3 Tm：熔点温度或者解链温度，是DNA变性进行到一半时的温度
4同裂酶：有时，一些限制性内切酶虽然来源不同，但是识别序列相同，这样的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。此种酶切割位点可同可不同。
5 PCR技术：是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，即聚合酶链式反应技术。（已知的短片段1kb以内）
6质粒不相容性：不同质粒有的可共存于同一细胞中，但有的不行。不能同寓于一个细胞中的不同质粒称为不相容性质粒。
7转录单元：始于启动子，止于终止子，中间是一段转录区，转录为单链RNA的一段序列8杂种位点：hybrid site：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。
9基因表达：基因通过DNA的转录和RNA的转译等过程，将其所携带的遗传信息转变成蛋白质(或RNA转录本)的过程。
10基因组文库：某一特定生物的很多克隆的集合，其中克隆数足够大以覆盖每一个基因。
11 ORF：开放阅读框，以起始密码子开始终止密码子结束的一串三联体核苷酸序列。
起始密码子：ATG终止密码子：TAA TAC TGA
12克隆：动词：是指从一个共同祖先经无性繁殖得到的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊生命群体；名词：指从同一个祖先产生这类同一的DNA分子群体、细胞群体或个体群体的过程。
13蛋白质印迹杂交技术：将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。
14同尾酶：isocaudamer指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。
二选择题：
1焦磷酸测序中没用到以下什么酶；（dna聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase).荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶都有）
2克隆基因常用强效载体，哪种不适用于大肠杆菌，选Gal；
3质粒克隆载体非必需元件，选融合标签；
4外源基因在下列哪种中表达最完善（哺乳动物细胞）；
5一个完整的转录单位不包括（复制起始位点）。
三简答题：
1简要勾勒一副原核表达载体图。（重点是要包括原核表达载体的６个要素：启动子、核糖
体结合位点、多克隆位点、转录终止子、抗性筛选
基因、复制起始点。）
2以EcoR I为例说明限制性核酸内切酶的命名原则：一般以提取这类酶的生物属名头一个字母和种名的头两个字母以及菌株（型）的代号来命名。第一个字母：大写并斜写，表示所来自微生物的属名的第一个字母。第二、三字母：小写并斜写，表示所来自微生物种名的第一、二个字母。其它字母：大写或小写，表示所来自微生物的菌株号；罗马数字：表示在该菌株发现的限制酶的编号。例：EcoR I: 来自于Escheria coliRY13的第一种限制酶。3.简述α-互补法筛选重组克隆子的原理：噬菌体载体的基因间隔区插入E.coli的一段调节基因及lac Z的N端146个氨基酸残基编码基因，其编码产物为β—半乳糖苷酶的α片段。突变型lac - E.coli 可表达该酶的W片段（酶的C端）。单独存在的α及W片段均无β半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段时，宿主细胞内才有β半乳糖苷酶活性，使特异性作用物变为蓝色化合物。
4.简要比较大肠杆菌表达系统和几种常用的真核细胞表达系统的优缺点：
1.大肠杆菌：最早用于表达外源基因的宿主细胞
优点：具有遗传背景清楚、操作简单、表达效率高、易于纯化等优点；
缺点：缺乏折叠复性系统、无翻译后加工和修饰系统、内源蛋白酶作用。
2.哺乳动物细胞和昆虫细胞：
优点：能够正确折叠、翻译后加工和修饰系统完善，能够表达各种哺乳类细胞蛋白；
缺点：这些表达系统往往操作比较复杂，表达水平低，不易推广使用。
3.酵母细胞
优点：作为单细胞生物，能够像细菌一样在廉价的培养基上快速生长，能方便地操作外源基因。能对翻译的蛋白进行加工和修饰，如二硫键的正确形成、前体蛋白的水解加工，表达产物与天然蛋白相同或相似。可将外源基因与N-末端前导肽等信号肽融合，指导新生肽的分泌，并对分泌蛋白进行糖基化修饰。可采用MOX、AOX、lac 4等高表达的强启动子，并可诱导表达。可移去起始甲硫氨酸，避免了作为药物使用可能引起的免疫反应问题。
缺点及改进措施：表达外源基因时，遗传和翻译的稳定性常受影响，如点突变，可通过高拷贝基因来解决。翻译产物不稳定，可利用液泡蛋白酶缺陷型来解决。选择翻译后具有修饰能力的酵母以及合适的载体。分泌表达时前导肽去除不够完全，可加入间隔序列肽。
糖基化以甘露糖型为主，而且易过度糖基化，可改变宿主糖基化背景。
5.简述用于基因工程中DNA分子改造的四类工具酶及其作用，并举例说明：
1.核酸酶：通过断裂相邻DNA链核苷酸之间的磷酸二酯键而降解DNA分子。切割、缩短、或降解核酸分子，有核酸外切酶和核酸内切酶
2.连接酶：催化相邻核苷酸的游离5'-磷酸基团和3'-羟基形成二酯键的酶。连接核酸分子
3.聚合酶：催化以核酸链为模板合成新核酸链的酶。包括DNA聚合酶和RNA聚合酶。复制核酸分子
4.修饰酶：能催化稀有碱基参入RNA或DNA，或对原有碱基进行修饰的酶，以防止限制性内切酶的破坏。去除或添加化学基团
6.重组克隆载体构建策略：目的基因片段被插入到载体中，生成一个嵌合体或称作重组DNA 分子；载体作为一个运输工具将目的基因转运到一个宿主细胞中；在宿主细胞中载体复制产生大量同一拷贝，同时也使目的基因得到扩增；宿主细胞增殖时，重组DNA分子的拷贝转移到子细胞中，随着载体进行进一步复制；细胞多次分裂后，一个由相同细胞组成的细胞群体，或称作一个克隆被生产出来，每一个细胞都包含一个或多个重组DNA分子的拷贝，此时重组分子所携带的目的基因就被克隆了。
7.基因工程技术路线：通过基因文库筛选、PCR扩增或人工化学合成等手段获得目的基因；构建所需基因载体；目的基因与载体在体外重组后导入受体细胞，进行增值或表达等。基因工程一般包括四个步骤，也即技术路线：一、取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二、构建基因的表达载体；三、将目的基因导入受体细胞；四、目的基因的检测与鉴定。
8.cdna文库的建立：cDNA文库是指某生物某一特定的发育时期、特定的组织或器官所转录的mRNA形成的cDNA片段与载体连接而形成的克隆的集合。cDNA文库是有时效性的，cDNA 文库只反映mRNA的分子结构。文库构建基本程序：①分离提取含有目的基因的组织细胞的总RNA或者总mRNA；②cDNA的第一链的合成；③cDNA的第二链的合成；④将cDNA双链重组到载体上
9简述链终止法测序原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳可以将长度上相差一个核苷酸碱基的
单链DNA分子相互分离开来。
10简述PCR产物克隆过程：①特殊的克隆载体（T载体）；②设计含限制性酶切位点的引物。四论述题：
1.根据自己所掌握的基因工程方面的知识，谈谈IPTG诱导目的基因在pET载体表达系统中高效表达的原理：1)噬菌体DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)是最常用的表达菌株，噬菌体DE3是λ噬菌体的衍生株，构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中，诱导蛋白的表达方式与lac启动子一样都是iptg诱导。2)表达菌株BL21(DE3)上带有lacI基因，T7 RNA 聚合酶编码基因以及lacUV5启动子，lacUV5启动子可以启动T7 RNA 聚合酶的表达;3)表达质粒如pET-28质粒带有T7启动子和编码阻遏蛋白lacI的基因，在插入目的基因后，lacI是失活的;4)在非诱导条件下，表达菌株中表达出的lacI阻遏蛋白可以作用于T7 RNA 聚合酶前的lacUV5启动子，从而抑制T7 RNA 聚合酶的表达。IPTG是乳糖类似物，可以与阻遏蛋白lacI 结合，使其对lacUV5启动子失去阻遏作用，T7 RNA 聚合酶得以合成，继而与pET-28质粒上的T7启动子结合，启动下游基因包括目的基因的表达，从而产生目的蛋白。
2.pcr产物的克隆方法：黏性末端连接，将PCR产物回收后，利用引物中附加在5’端的限制酶切位点，可直接用相应的限制性内切核酸酶酶切后产生黏性末端，与载体连接，产生重组DNA；产物尾部加dT或ddT，Taq DNA聚合酶会在3'端加上多余的非模板依赖碱基,而且对A优先聚合,所以PCR产物末端的多余碱基大部分都是A.。利用这一特点,可以经限制酶切割产生的平末端用酶加上dT或ddT,使载体与PCR产物末端互补并进行连接.载体末端加dT尾可直接用Taq DNA聚合酶和dTTP或ddTTP,ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯键,保证在载体3'端只加上一个ddTTP,而其5'端所含的磷酸基团可与PCR产物的3'端OH 连接,连接产物在载体和PCR产物之间的双链上带两个切口,这种重组DNA仍可转化合适的受体菌,并在细菌体内修复；平末端连接，由于TaqDNA聚合酶能在PCR产物3’端加上非模板依赖的多余碱基，因此可用T4DNA聚合酶处理补平末端，然后用平末端连接克隆PCR产物。
3.题目很长。。。主要就是设计实验方案，包括整套基因工程的具体流程到最后在dna、rna、
蛋白质水平鉴定表达产物和产物活性的鉴定：基因工程基本操作：目的基因的获取（从基因文库，利用PCR技术，人工合成），基因表达载体的构建（目的基因，启动子，终止子，标记基因），将目的基因导入受体细胞（显微注射法，基因枪法，农杆菌转化法），目的基因的检测与鉴定（分子水平的检测——目的基因是否插入，转录，翻译，个体水平的检测）
1PCR实验的基本步骤：模板DNA变性：反应混合物加热到94 ℃，双链DNA分子解链；引物退火：变性后，将温度降低到55℃左右，从而使引物模板DNA特异性互补配对；
延伸：升温到72 ℃，Taq DNA聚合酶结合到引物3’端，合成与模板DNA互补的新链。重复循环。
2为什么基因克隆和PCR如此重要：这两种技术都能够将目的基因从细胞的所有其他基因中分离出来，获得纯的单一基因样品。
3PCR与基因克隆技术的比较：一个PCR可以在数小时内完成一个基因克隆可能要花几周甚至几个月因而，PCR技术比基因克隆要方便快捷的多。PCR技术的局限性：仅用于已知序列的基因扩增，不适用于未知序列的基因扩增。PCR扩增产物长度有限。因而，基因克隆是分离长片段基因或者以前从未研究过的基因的唯一方法。
4Cos位点的作用：环化作用，提供特异性酶切位点；CTAB：十六烷基三甲基溴化铵，一种去垢剂，能与核酸一起形成不溶物。异硫氰酸胍：一种强离序盐，能使除核酸外的所有生化成分变性和溶解，使DNA牢固地吸附在二氧化硅颗粒上。
基因工程考试试题.doc
基因工程 一名词解释 DNA，1、限制与修饰系统：限制酶的生物学功能一般被认为是用来保护宿主细胞不受外源DNA的感染，可讲解外 来 从而阻止其复制和整合到细胞中。一般来说，与限制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶，或者说是甲基化酶，能保护 自身的 DNA不被讲解。限制酶和甲基转移酶组成限制与修饰系统。 2、各种限制与修饰系统的比较 Ⅱ型Ⅰ型Ⅲ型 识别位点4~6bp，大多为回文序列二分非对称5~7bp 非对称 切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性，至少在识别位点外100bp 识别位点下游 24~26bp 简答 1. 何谓 Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法？ 答：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。 pH 引起星星活性的的因素：①高甘油浓度（>5%）；②酶过量（ >100U/μl ）；③低离子强度（ <25mmol/L）；④高(> ；⑤有机溶剂如DMSO （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等；⑥用其它二价阳离子 星星活性的抑制措施：①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；③提高离子强度到100 ～ 150mM（在不抑制酶活性的前提下）；④降低反应pH至；⑤使用Mg2+作为二价阳离子。 2. 试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的因素？（影响酶活性的因素？） 答：外因：反应条件、底物纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当，反应体系的选择、反应时间的长短 内因：星星活性、底物甲基化、底物的构象 3、 DNA末端长度对酶切割的影响 答：限制酶切割 DNA 时，对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的 核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切 割扩增的 PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。一般需加 3 ～4 个碱基对。 4、何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？ 答：将外源 DNA 或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备：①在宿主细胞内必须能够自主复制（具 备复制原点）；②必须具备合适的酶切位点，供外源DNA 片段插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于 筛选；④其它：有一定的拷贝数，便于制备。 5 抗性基因（ Resistant gene）是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？ 答：氨苄青霉素抗性基因（ ampr）、四环素抗性基因（tetr ）、氯霉素抗性基因（ Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（ kanr , neor ）以及琥珀突变抑制基因supF 。 ⑴青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。氨苄青霉素抗性Ampr 编码一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化β - 内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。 ⑵四环素与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。 Tetr 编码一个由 399 个氨基酸组成的膜 结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 6. 何为α - 互补？如何利用α - 互补来筛选插入了外源DNA 的重组质粒？ 答：α - 互补指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β - 半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。α - 互补是基于在两个不同的缺陷β－半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。实现α- 互补主要有两部分组成：LacZ △ M15 ，放在 F 质粒或染色体上，随宿主传代；LacZ' ，放在载体上，作为筛选标记，当在 LacZ' 中插入一个片断后，将不可避免地导致产生无α- 互补能力的β－半乳糖苷酶片断。在诱导物IPTG 和底物 X-gal （同时可作为生色剂）的作用下，含重组质粒的菌落不能产生有活性的β－半乳糖苷酶，不能分解 X-gal ，呈现白色，而含非重组质粒的菌落则呈现兰色。以此达到筛选的目的。 7、试简述λ噬菌体的裂解生长状态Lytic growth 和溶原状态 Lysogenic state 两种循环的分化及其调节过程？ 答：裂解生长状态是λ噬菌体在宿主中大量复制并组装成子代λ噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂 解。溶原状态为λ噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主染色体DNA 中随宿主的繁殖传到子代细胞。调节过程：由感染复数
基因工程实验技术介绍
一、大肠杆菌质粒DNA的提取 质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法。此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下： 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养 基。 2、37℃振荡培养过夜。 3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3 min，弃上清液。 4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-H Cl pH8.0)充分混合。 5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，p H4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另 一新Ep管 8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置1 0min。 9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。 10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有 液体。 11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中 二、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。 (1)琼脂糖凝胶电泳装置
由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去15年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。使用最普遍的装置是Walt er Schaffner发明的水平板凝胶。 水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。在有些装置中，则可将凝胶直接铺在平台上。凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。 （2）琼脂糖凝胶的制备 琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液倒入胶模中，令其固化。凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。通贯凝胶的电场接通后，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。 （3）琼脂糖凝胶的染色 电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含EB的染液中，染色10分钟，取出紫外灯下观察。 三、质粒DNA热激法转化大肠杆菌 感受态的细胞可以摄入外部溶液中的DNA，而常态的细胞却不能，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。 1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培 养基的试管中，37℃振荡培养过夜 2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培 养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至OD600=0. 3 3、然后把培养物倒入1.5ml离心管中，冰浴1 0min。 4、在4℃下以4000rpm离心5min，去上清液 5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液 中，置冰上30min 6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min，去 上清液
最新基因工程笔记总结
第二章Enzymes 第四节DNA连接酶Ligase 一、DNA连接酶的发现 二. 连接条件 必须是两条双链DNA。 DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）。需要能量。 三、连接反应的机理 1、A TP（NAD+)提供激活的AMP。 2、A TP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。 3、AMP 与连接酶的赖氨酸-氨基相连。 4、AMP 随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA 一条链的5’端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。 5、3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。 Ligase：只连“Nick切口”，不连“Gap缺口” 四. 两种DNA连接酶 1. E. Coli DNA ligase 来源：E.coli 适用：粘性末端（PEG与高浓度一价阳离子存在可连平末端） 2. T4 ligase 来源：T4 phage 适用：粘性末端及平末端 T4 vs. E.coli T4 DNA ligase制备容易，价格便宜，能进行各种类型连接反应，应用更广泛！ 五.Ligase的反应温度 最佳温度： 界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是4-15℃比较合适。 六. DNA分子连接的四种形式 1. 粘性末端； 2. 平末端； 3. 平末端加尾； 4. 平末端加衔接物(linker)或接头(adaptor) (1)Digestion and Ligation 1．粘性末端连接 Problem: (自我环化作用) 解决方法：a、双酶切（两种内切酶）b、去磷酸 2.平末端连接 粘性末端连接效率高于平末端约100倍！ 解决方法：化平末端为粘性末端 3. 平末端连接---同聚物加尾法（1）末端脱氧核苷酸转移酶 功能：5’至3’单链聚合 作用特点：单链；无模版 作用机理： a: 用5’-特异的核酸外切酶处理DNA分子，以便移去少数几个末端核苷酸, 获得3’-OH的单链延伸末端。 b: 加入dA TP/dTTP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3-OH末端将会出现单纯由poly(dA)和poly(dT)组成的DNA单链延伸。 c: 获得poly(dA)和poly(dT)尾巴，就会彼此连接起来。缺点： 当poly(dA)，Poly(dT)不严格等长时,重组DNA分子会有缺口。 需要用DNA聚合酶I填补，然后用DNA连接酶连接最后的缺口。 4. 平末端连接 ---衔接物连接法与接头连接法 (1) 平末端的衔接物连接法 衔接物的5’末端和待克隆的DNA片段的5’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化。通过T4 DNA连接酶的作用使两者连接起来。用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子。 (2) 平末端的接头连接法 将具有某种限制性酶(BamHI)粘性末端的典型DNA 接头分子与平末端的DNA片段连接后，后者变成具有粘性末端的DNA分子。 七.热稳定的DNA连接酶——来自嗜热高温放线菌 热稳定的DNA连接酶的应用： 寡核苷酸连接测定法（oligonucleotide ligation assay, OLA） 连接酶链式反应（ligation chain reaction, LCR） 寡核苷酸连接测定法的作用 检测突变 寡核苷酸连接测定法的作用：检测突变。 1. 寡核苷酸连接测定法 （1）原理: 两条寡聚核苷酸探针分子，同一种与之互补变性的靶DNA之间的杂交作用,这两条寡聚核苷酸探针分子在靶DNA分子上的位置是彼此相邻的。 当他们同靶DNA链是完全碱基配对时，便可以被连接酶连接起来。 结合点或靠近结合点处存在和靶DNA错配的碱基两个探针之间不能形成磷酸二脂键。 精品文档
《基因工程》课程综合实验---转基因斑马鱼的构建
《基因工程》课程综合实验---转基因斑马鱼的构建 实施方案 《基因工程》课程综合实验教学在专业培养目标中的定位与目标 《基因工程》是生命科学学院等各专业的专业主干课，在这些专业的本科生教学计划中占有极为重要的地位。《基因工程》也是我们学校基地班和生技专业的专业必修课，已经有10余年的开课历史。全国其他高等综合院校都十分重视《基因工程》课程建设，绝大多数院校都将《基因工程》作为学校精品课程进行建设。湖南师范大学大学在《基因工程》教学和研究方面具有坚实的基础， 2008年《基因工程》建设成为了湖南省精品课程，从而为我校《基因工程》的教学改革提供了契机。 基因工程是以遗传学为理论基础的一门实践性很强的学科，是生物学科中一门体系还欠完整却发展十分迅速的学科，对探索生命的本质、推动整个生物学科的发展起着巨大的作用；同时又是一门紧密联系生产实际的实验科学，对新品种选育和良种繁育、遗传疾病防治等都具有重要的应用价值。通过《基因工程》的学习，使学生掌握基因工程的基本原理、基本方法和最新发展动态；通过《基因工程》课程综合实验教学，使学生熟悉基因工程的基本操作方法，注重对学生的实验操作技能的培养。 基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建教学大纲 课程名称：基因工程（实践课程部分） 课程编号： 面向专业：生物技术、生物科学、基地班 课程总学时：理论51学时，实验34学时_ 实验学时：34_ 课程学分：理论3学分，实践2学分 一、实验目的 本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理 和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生基因工程基本实验操作、实验设计、
实验结果分析和创新实验能力，通过基因工程综合实验的开设，注重学生综合素质和实践能力的培养。 二、实验内容、学时分配与组织 三、教学管理模式与注意事项 1．学生在实验前必须认真复习课程有关内容，预习实验指导书。 2．指导教师适当讲解相关理论及注意事项，提示具体的实验方法和操作，演示重要仪器的使用。 3．实验小组人数为4人，由学生独立操作。每个实验的时间根据实验流程本身决定，长短不一，但需要集中的时间。 4．要求学生掌握基本的操作方法，如实逐项记录数据，独立完成实验报告，并当天上交。
2015-2017基因工程高考题附答案
选修3——基因工程高考题 1．（2017?新课标Ⅰ卷.38）（15分） 真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A（有内含子）可以表达出某种特定蛋白（简称蛋白A）。回答下列问题： （1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_____________________________________________。 （2）若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用______________作为载体，其原因是_______________________________________________________________。（3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有_____________________________________________________（答出两点即可）等优点。 （4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是___________________（填“蛋白A 的基因”或“蛋白A的抗体”）。 （5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是_______________________________________________________________________________。2．（2017?新课标Ⅱ卷.38）（15分） 几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题： （1）在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是________________________________。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是______________________________________。 （2）以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是________________________________。 （3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是________________________________________________________（答出两点即可）。（4）当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是__________________________。 （5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是____________________________________________。 3.（2017?新课标Ⅲ卷.38）（15分）编码蛋白甲的DNA序列（序列甲）由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。 回答下列问题： （1）现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列（TTCGCTTCT……CAGGAAGGA），则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是_____________________________________________________________。（2）某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为________________，加入了________________作为合成DNA的原料。 （3）现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。 ①由图2 可知，当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是________________________。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是________________________。 ②仅根据图、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少______________（填“A”“B”“C”“D”或“E”）片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。 4．（2017·天津理综卷9）（20分）玉米自交系（遗传稳定的育种材料）B具有高产、抗病等优良性质，但难以直接培育成转基因植株，为使其获得抗除草剂性状，需依次进行步骤I、II试验。 Ⅰ．获得抗除草剂转基因玉米自交系A，技术路线如下图。 （1）为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用2种限制酶，选择的原则是______（单选）。 ①Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点 ②G基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点
基因工程实验报告
基因工程实验报告 、
小麦GAPDH截短体的重组与表达 摘要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。 关键字：小麦基因；载体；感受态 前言 基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 （一）实验过程
1.实验部分流程：
2．小麦总RNA提取（Trizol法） 2.1 材料 小麦幼苗 2.2 试剂配制及器具处理 ① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯） ②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在 0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。 ③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 ④Trizol ⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 ⑥氯仿(最好用新的)。 ⑦异丙醇(最好用新的)。 2.3 操作步骤： ①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。 ②室温放置5min，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 ③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm 离心10min。 ④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。 ⑤重复步骤④。 ⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 3. RT-PCR扩增目的基因cDNA 3.1 试剂 ① RNA模板 ②Olig（dT）18 ③反转录缓冲液 ④dNTP ⑤ M-MULV反转录酶 ⑥ RNA抑制剂（RNasin） ⑦Premix EX Taq DNA聚合酶 ⑧ PCR特异引物 3.2操作步骤： 3.2.1 RNA的反转录 采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6μL（需加入RNA约1μg） OligodT primer 1μL H2O（nuclease-free）5μL 12μL 65℃ 5min，补加下列试剂： 5× Reaction buffer 4μL RibolockRNase Inhibitor 1μL 10mM dNTP Mix 2μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL 20μL 42℃ 60min 70℃，5min，﹣20℃保存
生物选修3专题1 基因工程知识点复习学案
专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过________________________，赋予生物以 _____________________，创造出______________________________________。基因工程是在____________上进行设计和施工的，又叫做__________________。 1. （1 （2 （3 2. (1)两种DNA ②区别：E· (2)与DNA 酸二酯键。 3. （1 （2 _____________________的双链___________DNA （3）其它载体： _________________________________ (二)基因工程的基本操作程序 第一步：__________________________ 1.目的基因是指： ______________________________________________________ 。 2.目的基因可采取_______________-获得，也可以用_____________________。人工合成目的基因的常用方 法有________________和_________________。 3.PCR技术扩增目的基因 （1）原理：_____________________ 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是________________，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 _______________。此方法的受体细胞多是 ____________。将目的基因导入微生物细胞：★原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少， 最常用的原核细胞是 ____________，其转化方法是：先用 ________处理细
基因工程实验(答案)
——凯1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？（实验题目的总结） 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？（自己写的） 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？ 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。（题目有歧义） 答：①取0.5g琼脂粉置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂溶解； ②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线；④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？ 答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？ 答：冷的无水乙醇，冷的异丙醇，终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq
基因工程测试题
基因工程测试题 一、选择题： 1.人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体进一步加工合成。通过转基因技术可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是( ) A.大肠杆菌 B.酵母菌 C.肺炎双球菌 D.乳酸菌 2.下列有关基因工程的叙述，正确的是( ) A．DNA连接酶将碱基对之间的氢键连接起来B．目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因突变C．限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA 中出现的几率就越大 D．常用的载体有大肠杆菌、噬菌体和动植物病毒等 3.我国科学家运用基因工程技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞并成功表达，培育出了抗虫棉。下列叙述不正确的是( ) A.抗虫基因的提取和运输需要专用的工具酶和载体 B.重组DNA 分子中替换一个碱基对，不一定导致毒蛋白的毒性丧失 C.抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递到近缘作物，从而造成基因污染 D.转基因抗虫棉是否具有抗虫特性是通过检测棉花对抗生素抗性来确定的
4.如图是获得抗虫棉的技术流程示意图。卡那霉素抗性基因(kan r)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基 生长。下列叙述正确的是( ) A.构建重组质粒过程中需要限制性核酸内切酶和DNA 连接酶 B.愈伤组织的分化产生了不同基因型的植株 C.卡那霉素抗性基因(kan r)中有该过程所利用的限制性核酸内切酶的识别位点 D.抗虫棉有性生殖后代能保持抗虫性状的稳定遗传 5.上海医学研究所成功培育出第一头携带人白蛋白基因的转基因牛。他们还研究出一种可大大提高基因表达水平的新方法，使转基因动物乳汁中的药物蛋白含量提高30 多倍，以下与此有关的叙述中正确的是( ) A.“转基因动物”是指体细胞中出现了新基因的动物 B.“提高基因表达水平”是指设法使牛的乳腺细胞中含有更多的人白蛋白基因 C.只有从转基因牛乳汁中才能获取人白蛋白，是因为人白蛋白基因只在牛乳腺细胞中含有
基因工程实验报告
基因工程实验报告
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基因工程实验报告 、
小麦GAPDH截短体的重组与表达 摘要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。 关键字：小麦基因；载体；感受态 前言 基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 （一）实验过程
1.实验部分流程： 片段胶 小麦幼苗小麦总RNA RT-PCR扩增小麦pGEX-4T-1 表达载体 表达菌株 目的蛋白 目的蛋白 Western
2．小麦总RNA提取（Trizol法） 2.1 材料 小麦幼苗 2.2 试剂配制及器具处理 ① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯） ②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在 0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。 ③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 ④Trizol ⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 ⑥氯仿(最好用新的)。 ⑦异丙醇(最好用新的)。 2.3 操作步骤： ①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。 ②室温放置5min，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 ③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm 离心10min。 ④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。 ⑤重复步骤④。 ⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 3. RT-PCR扩增目的基因cDNA 3.1 试剂 ① RNA模板 ②Olig（dT）18 ③反转录缓冲液 ④dNTP ⑤ M-MULV反转录酶 ⑥ RNA抑制剂（RNasin） ⑦Premix EX Taq DNA聚合酶 ⑧ PCR特异引物 3.2操作步骤： 3.2.1 RNA的反转录 采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6μL（需加入RNA约1μg） OligodT primer 1μL H2O（nuclease-free）5μL 12μL 65℃ 5min，补加下列试剂： 5× Reaction buffer4μL RibolockRNase Inhibitor 1μL 10mM dNTP Mix 2μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL 20μL 42℃ 60min 70℃，5min，﹣20℃保存
基因工程技术 笔记整理
基因工程技术：按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创造出新的生物类型。 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、共价闭合环状DNA分子cccDNA，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中，它具有自主的复制和转录系统。质粒在细胞内的复制一般有二种：紧密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子；后者在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝。 质粒的不相容性：利用共同复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共存。 从细胞中分离质粒DNA 的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。 溶菌酶：破坏菌体细胞壁；SDS和Triton X-100：使细胞膜裂解。 染色体DNA通常用于构建基因组文库和Southern杂交等。 基因组DNA的提取 植物基因组DNA提取：提取缓冲液（Tris.Cl—保持pH,EDTA,NaCl,SDS），氯仿/戊醇/乙醇溶液—沉淀和抽提DNA，异丙醇—沉淀DNA（提染色体），TE（Tris.Cl,EDTA）--溶解DNA，RNase—保存液，降解RNA，NaAC—加盐，70%乙醇—漂洗。 细菌基因组DNA提取：SDS，蛋白酶K，氯仿：异戊醇（24：1）-- 沉淀DNA，苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）-- 抽提，70%乙醇—漂洗，TE,NaCl—调节离子强度，RNase A，CTAB/NaCl 溶液—CTAB--一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，异丙醇/无水乙醇—沉淀上清液。 总RNA制备 mRNA的分子结构容易受到RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA 酶极为稳定而且广泛存在，因此，在提取过程中应严格防止RNA 酶的污染并设法抑制其活性，这是实验成败的关键。仪器—玻璃器皿：200℃烘2h，塑料器皿：DEPC水液处理—所有器皿最后硅烷化处理。 RNA酶抑制剂：DEPC--强烈但不彻底，与氨水溶液混合会产生致癌物；异硫氰酸胍--最有效，使RNA酶失活；其他--RNA酶蛋白抑制剂（RNasin）SDS, 尿素等。 细胞内总RNA制备方法：异硫氰酸胍热苯酚法、酚/SDS法、Trizol法。（均先将组织在液氮中研磨成粉末） 异硫氰酸胍热苯酚法：异硫氰酸胍(GIT)与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性，GIT与十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)作用使蛋白质变性。 酚/SDS法：用酚和SDS破碎细胞和去除蛋白质，用LiCl选择沉淀RNA以去除DNA 和其它不纯物。 Trizol法：Trizol试剂（含酚、异硫氰酸胍和溶解剂等）。 mRNA提取 制备mRNA原理：分离的总RNA 可利用mRNA3’端含有poly(A)的特点，用oligo(dT)纤维素柱分离，当RNA流经oligo(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。然后经过两次oligo（dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。（上样buffer和洗脱buffer）。溶液中无盐时要沉淀RNA，必须加盐NaAC。 琼脂糖凝胶电泳 DNA凝胶电泳：琼脂糖-- 分离DNA片段大小范围广；聚丙烯酰胺-- 小片段，分辨力高。
高中生物基因工程试题
阶段质量检测（一）基因工程 （时间：45分钟，满分：100分） 一、选择题（每小题3分，共45分） 1 ?下列有关基因工程技术的叙述，正确的是（） A. 重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体 B. 所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列 C. 只要是细菌中的质粒都可以直接作为基因工程中的载体 D. 载体必须具备的条件之一是有多个限制酶切割位点，以便与外源基因进行连接 2. （浙江高考）天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B,而 开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确 的是（） A. 提取矮牵牛蓝色花的mRNA经逆转录获得互补的DNA再扩增基因B B. 利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因B C. 利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞 D. 将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞 3. 日本下村修、美国沙尔菲和钱永健因在发现绿色荧光蛋白（GFP）等研究方面做出突出贡献，获得2008年度诺贝尔化学奖。GFP在紫外光的照射下会发出绿色荧光。依据GFP的特性，你认为该蛋白在生物工程中的应用价值是（） A. 作为标记基因，研究基因的表达 B. 作为标记蛋白，研究细胞的转移 C. 注入肌肉细胞，繁殖发光小白鼠 D. 标记噬菌体外壳，示踪DNA路径 4. 下列有关质粒的叙述，正确的是（） A. 质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器 B. 质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状 DNA C. 质粒只有在侵入宿主细胞后，才能在宿主细胞内复制 D. 基因工程中常用的载体除了质粒外，还有核 DNA动植物病毒以及入噬菌体的衍生物
基因工程实验考试试题(答案)
1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？ 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？ 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？ 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。 答：①取0.5g琼脂糖置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂糖溶解；②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线； ④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？ 答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？ 答：冷的无水乙醇、冷的异丙醇、终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq DNA聚合酶）。 答:(1)利用半保留复制的原理，以待扩增的DNA为模板，通过一系列酶在体外引物介导下，
基因工程大实验报告
基因工程综合实验报告 A型产气荚膜梭菌α毒素基因克隆及表达 班级生物工程081班 姓名盖雪 学号08771029 指导教师高凤山 实验时间2011.10.10-10.14 成绩
一、实验原理 二、主要试剂 DNA Ligation Kit Ver.2.0; Eco RI、Bam HI限制性内切酶；含15%甘油的 0.1mol/L CaCl2，20-30mL。无菌;0.1mol/L CaCl2 , 20-30mL ；50%甘油（无菌，保存菌种用，50mL）4×25mL LB液体培养基(现配现用)，卡那霉素（Kan）100mg/mL配2mL（过滤），X-gal 二甲基甲酰胺配成20mg/mL 配2mL; IPTG 24mg/mL, 配2mL（需过滤）;蛋白Marker; 0.5M EDTA,pH8.0; 溴化乙锭溶液(EB) （贮存浓度：10mg/mL，使用浓度0.5μg／mL）
三、仪器设备 紫外成像系统，高速冷冻离心机，恒温震荡培养箱，高压灭菌锅，冰箱，水浴锅，微波炉，电炉子，试管架，tube 架，试管，瓶塞，锥形瓶，胶板，电泳槽（包括琼脂糖凝胶和SDS-PAGE），电泳仪，培养皿，移液枪，枪头（各种规格），玻璃涂棒，记号笔，标签纸，卫生纸，水漂（水浴用），试纸，称量纸，一次性手套，酒精灯，火柴，药勺，搅拌子，量筒，烧杯，镊子，tip, tube(1.5mL, 2mL) 五、实验步骤 (一)准备工作 LB培养基配制；LB固体培养基配置；接菌（制备感受态用） 1）LB固体配制 配制固体培养基100mL 加入蒸馏水100mL溶解，用2mol/L NaOH调pH值至7.4，121℃灭菌20min。 灭菌结束后，待温度降至80℃以下时，方能取出，在超净台上，当培养基凉至50-60℃时，迅速加入Kan 30μL（若氨苄，加100ul），摇匀，倒板(4个)。凝固后放入4℃冰箱。 2）LB液体配制 配制100mL液体LB培养基 加入蒸馏水100mL溶解，用2mol/L NaOH调pH值至7.4。 然后分装，每管5mL，每人分装2管，一共12管；另外分装30mL LB与三角瓶中，余下的LB在原三角瓶中与试管等一起高压，121℃，20min。高压后，将剩余三角瓶中的LB分装至1.5mL tube中，每管800μL LB (共10个)。在时间允许的情况下，将高压后的LB试管加入卡那，每管1.5μL。 总结：需要灭菌的东西-液体培养基（试管、30mL三角瓶及剩余液体LB的三角瓶）-固体培养基、离心管（至少30个）、各种规格的枪头。 3）接菌 下午，接种BL21感受态于1管5mL培养基中，37℃震荡培养。 （二）感受态细胞制备、转化、重组菌接种 1）感受态细胞的制备 1.从大肠杆菌DE3平板上挑取一个单菌落接种于5mL LB液体培养基的试管