层析分离法分析

第三章层析分离法

1. 主要教学目标：学习和掌握柱色谱、纸色谱和薄层色谱法的原理、技术和应用。

2. 教学方法和手段：采用板书及与多媒体课件相结合，课堂上师生互动，采用启发式和提问式的教学方式，并且课堂上学习的表现记入学生的平时成绩。

3. .教学重点及难点：柱层析及基本理论；纸色谱

色谱法又称层析法，是一种广泛应用的分离方法。

色谱分析法是在1906年由俄国植物学家Tsweet首先系统地提出，他将叶绿素的石油醚液流经装有CaCO3的管柱，并继续以石油醚淋洗时，发现由于CaCO3对于叶绿素中各种色素吸咐能力的不同而使它们彼此分离，于是管中出现不同颜色的谱带，如图3─1所示。

图3-1 Tsweet的色谱工作图

尤如光谱一样，这样就有可能对它们进行定性分析和定量测定，于是他将这种彩色分层物定义为层析谱，而将这种分析方法称为色谱分析法。色谱法(Chromatograph)这—名词是由希腊字“Chroniatus”(颜色)和“graphein”(记录)二字合并而成。并发表了“植物界的色素”专论。到1931年，Kuhn和Leaerer又成功地适用Tsweet的方法分离了植物的色素，才使这一方法得到公认和广泛应用。

1935年人工合成离子交换树脂后，为离子交换色谱的广泛应用提供了物质基础。

1938年苏联的Izmailo等创立了薄层色谱法，主要是用于药物分析，应用于无机物分析则是50年代末才开始的。应用于稀土元素的分离是1964年由Pterce开始的。

1941年Martin和Synge首先介绍了分配色谱法，并将蒸馏塔板理论应用于色谱分离中，使色谱方法在理论上向前推进了一步。

1944年Consden，Cordon和Martin首先开始了纸色谱法，Martin和Synge并用此法成功地分离了氨基酸的各种成份，获得1952年的诺贝尔奖。

1947年美国的Boyd和Spedng等人发表一系列论文，报告他们应用离子交换色谱法分离裂变产物和稀土元素混合物的情况。

1952年Martin和Games开创了气一液色谱的新领域。20世纪60年代末，法国的G.Aubouin和美国的Scott等人同时各自创立了高压液相色谱法，它与分光光度、库仑、电导、荧光等方法联用，可使分离和检测实现自动化。

到目前为止，各种色谱还在不断发展，色谱设备日益完善，操作技术不断突破，色谱分析法已成为近代化学中最重要的分离分析手段之一。

色谱法有许多分支，但在色谱分析过程中总是由一种流动相(例如Tsweet工作的石油醚)，带着被分离物质(如叶绿素)流经固定相(如CaCO3)，从而使分离物中各组分分离。它有许多分类方法。

按流动相和固定相性质不同分类

流动相固定相色谱分析法种类

固体气固色谱法

气体气相色谱(气相层析)

液体气液色谱法

固体液固色谱法

液体液相色谱(液相层析)

液体液液色谱法

按操作形式分类

①柱色谱：柱色谱顾名思义就是将固定相(如硅胶、氧化铝、氧化铝、碳酸钙、淀粉、纤维素)，离子交换(树脂等)装人一根被称为色谱柱的玻璃瓶中，这种色谱柱通常又称为“层析柱”或“分离柱”。

②纸色谱：利用滤纸作为固定相，让样品溶液在其上展开，达到分离鉴定的目的。

③薄层色谱：将吸附剂研成粉末，再压成或涂成薄膜，然后用与纸色谱相类似的方法操作。

按分离过程的原理不同分类

①吸附色谱：固定相为吸附剂，利用吸附剂表面对被分离组分吸附能为强弱的差异性进行分离。气固色谱和液固色谱属这一类。

②分配色谱；是利用各个被分离组分在固定相和流动相两相间分配系数的不同来进行分离的。气液色谱和液液色谱属于这一类。

③离子交换色谱：以离子交换剂作固定相，利用各种组分的离子交换亲和力的差异来进行分离。

④凝胶色谱：又称排阻色谱。用凝胶作固定相，利用凝胶对分子大小不同的组分所产生阻滞作用的差异来进行分离。

气相色谱和高效液相色谱属于仪器分析，这里不作表述。本章重点介绍柱色谱、纸色谱和薄层色谱。

色谱分离法的特点

（1）高选择性：色谱分析的高选择性主要表现在它能对性质极为相似的物质，例如有机化合物中的各种类型的异构体(顺反异构体、旋光异构体、芳香烃中邻位、间位、对位异构体等)，又如氢同位素氢(H)、氘(D)、及氘(T)可以形成的六种氢分子，这些异构体和同位数，原则上都可以用色谱方法进行分离测定。

（2）高效能：是指色谱可以分离分配系数接近的组分，从而可以分析极为复杂的化合物。这是因为在分离的全过程中，可以认为是无限个流动相在无限个固定相中移动，物质即在两相中作无限次抽提、溶解，再抽提、再溶解的过程，尽管它们之间分配系数差异不大，但经反复抽提，溶解的结果，使微小的差异积累成明显的差异，因而提高了分离效率。

（3）高灵敏度：总的来说，各种色谱分析的灵敏度都比较高，样品的分析量可

以达到10-12～10-14克，因此在痕量分析上广泛应用，而且成为最重要的手段，可以鉴定出环境分析中的杂质，高分子单体、原子能裂变物等，鉴定量1ppm－0.lppb以下。

（4）高速度：色谱分析一般来说还是比较快的，如纸色谱、柱色谱可以同时分离几种或十几种物质，而且既能定性又能定量。特别是气相色谱及高效液相色谱，大部分样品只要几分钟即可完成一个分析周期。

§3-1 柱色谱

柱色谱，按其作用原理又可分为吸附柱色谱和分配柱色谱。

一、吸附柱色谱

吸附柱色谱是各种色谱法中最早建立的。所谓吸附是指物质在吸附剂表面上集中浓缩的现象，吸附剂一般是多孔性的微粒状物质，在其表面具有许多吸附中心(或吸附位置)，这些吸附中心数量的多少及其吸附能力的强弱直接影响吸附剂的吸附性能，吸附能力减弱，加热驱除水分，可使吸附能力增强，即所谓“活化”；反之，加入一定量的水分，可使活性降低，称之为“脱活性”。

1. 吸附等温线

在一定温度下，某种组分在吸附剂表面的吸附规律可用平衡状态时此组分在两相中浓度的相对关系曲线表示。这种关系曲线称吸附等温线。吸附等温线有线性和非线性两种。如图3-2(a)所示。

图3--2 吸附等温线(a)和对应的洗脱曲线(b)

线性吸附等温线如图3-2(a)，当溶质A随着流动相缓缓流过层析柱中的吸附剂(即固定相)时，溶质A在两相同不断地发生吸附、脱附，再吸附、再脱附过程。以Cm 表示溶质A在流动相中的浓度，Cs表示溶质A在固定相中的浓度，吸附平衡可用下式表示：

?

Cm Cs

则吸附平衡的平衡常数

D Cs

K

Cm

( 3 – 1 ) 即溶质在固定相和流动相中浓度的比值，又称分配系数。对于这类吸附过程K D 为一定值。当流动相的流速保持恒定时，溶质A的区带在层析柱中将以恒速前进，随后流出柱外。若测定流出液中A的浓度，绘制出流出液浓度(C)和体积(V)的关系曲线，则得如图3-2(b1)所示曲线；为一对称形的层析图谱，或称为洗脱曲线。

非线性等温线主要可分为两种：一种是呈凸形吸附等温线，如图3-2(a2)所示；一种呈凹形等温线，如图3-2(a3)所示。由于吸附剂表面上具有吸附能力强弱不同的吸附中心，溶质在其上的分配系数不同，吸附力强的吸附中心，分配系数(K D)较大，溶质分子首先占据它们，其次再占据较弱的，弱的和最弱的，于是K D值随着溶质在吸附中心上的浓度增加，强吸附中心的被饱和而逐渐变小，因而吸附的等温线逐渐向下弯曲而呈凸状。对于这种层析过程进行洗脱时，由于数量较多的弱的和较弱的吸附中心上的溶质先被洗下，接着较少的强吸附中心上的溶质也被洗下，于是获得的洗脱曲线呈拖尾形，如图3-2(b2)所示，吸附层析等温线以这种形式为主。但若减少溶质量，只利用凸形等温线开始的一部分，接近于线性关系，此时洗脱曲线也就变得对称了。

在试样中各组分的K D值多有差异，K D值较大的组分在柱上吸附较牢，在固定相中保留时间较长，要将它洗脱下来，所需溶剂(流动相)也较多。反之，K D值较小的组分，较易被洗脱下来。于是可利用各组分吸附能力的差异，即保留特性的差异将它们分开。

组分在柱上的保留特性可用保留时间和保留体积表示。所谓保留时间是从进样开始到流出液中出现浓度最高点的时间；所谓保留体积是从进样开始到流出液中出现浓度最高点时流过层析柱的流动相的体积。

2. 吸附剂及其选择

为了使试样中各组分分开，必须选择适宜的固定相和流动相。

吸附剂一般应为粗度均匀的细小颗粒，具有较大的表面积和一定的吸附能力，吸附剂与欲分离的试样和所用的洗脱剂不起化学反应，也不溶于洗脱剂中，常用的吸附剂有氧化铝，硅胶和聚酰胺等。

(1) 氧化铝

是由Al(OH)3在300～400℃时脱水制得。对氧化铝表面的吸附机理，人们的认识还不一致，有人认为氧化铝表面存在铝羟基A1-OH，由于羟基的氢键作用而吸附物质。氧化铝因生产条件的不同可分为中性、酸性和碱性三种，吸附性能也有差异。中性氧化铝应用广泛，适用于醛、酮、醌、酯、内酯化合物及某些苷的分离；酸性氧化铝适用于酸性化合物，如酸性色素，某些氨基酸等；碱性氧化铝适用于分离碱性化合物，如生物碱、醇等。一般讲，能用酸性或碱性氧化铝分离的物质也可用中性氧化铝分离。

氧化铝的活性与含水量密切相关，活性强弱用活度级I—V级表示，活度I级含水量极少，吸附力最强，V级最弱。把氧化铝加热至100～150℃，除去与羟基结合的部分水分，使氧化铝具有一定活性，加热150℃以上，氧化铝活性增至II─III级，加热至300—400℃，活性增至I-II级，再升温至600℃以上，进一步脱水，并开始烧结。由于脱水过程受许多因素影响，因此每批生产的氧化铝活性也不一致。

一般讲，分离弱极性的组分选用吸附活性强一些的吸附剂，分离强极性的组分，选用活性弱的吸附剂。

(2) 硅胶

层析用硅胶是由弹性多聚硅酸脱水制得，性能稳定。硅胶表面化学组成有下面几种：

硅氧游离型束缚型活泼型

烷硅醇基硅醇基硅醇基

硅氧烷不具吸附性，硅醇基能与极性化合物或不饱和化合物形成氢键，因而具有吸附性，其中活泼型硅醇基构成最强烈的吸附中心，游离型次之，束缚型又次之。由于活性羟基在硅胶表面较小的孔穴中较多，因而表面孔穴较小的硅胶吸附性能较强，

水与硅胶表面的羟基结合成水合硅醇：、OH、OH2，使其失去吸附性，加热至100℃左右能可逆地除去这些水分，使硅胶活化，最佳的活化条件是105～110℃，加热30分钟，若加热至200℃以上，则硅胶逐渐失去结构水，形成硅氧烷，吸附力下降。

束缚型活泼型硅醇基

硅醇基

加热至400℃以上，上述反应发生在两相邻表面间，胶的表面积逐渐变小，以至于烧结。

硅胶具有微酸性，吸附能力较氧化铝稍弱，可用于分离酸性和中性物质。如有机酸、氨基酸、萜类、甾体等。

(3) 聚酰胺

它是由己内酰胺聚合而成，因而又称聚己内酰胺，或称锦纶，层析用聚酰胺是白色多孔性的非晶形粉末，易溶于浓盐酸、热甲酸、乙酸、苯酚等溶剂，不溶于水及甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、苯等有机溶剂。对碱比较稳定，对酸的稳定性较差，热时更敏感。

聚酰胺分子内存在很多酰胺键，可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键，因面对这些物质有吸附作用，酚类和酸类是以其羟基或羧基与聚酰胺中酰胺键的羧基形成氢键；另外硝基化合物和醌类化合物是以其硝基或醌基与聚酰胺分子中酰胺键，游离胺基形成氢键，如图3-3所示。各种化合物因其与聚酰胺形成氢键能力的不同，吸附能力也不同，因此可以得到分离。一般讲，只有以下规律，能形成氢键基团较多的溶质，吸附能力较大，对位、间位取代基团都能形成氢键时，吸附力增大，邻位的使吸附力减小，芳香核具有较多共轭双键时，吸附力增大，能形成分子内氢键者，吸附力减小。

3. 流动相及其选择

流动相的洗脱作用实质上是流动相分子与被分离的溶质分子竞争占据吸附剂表面活性中心的过程。强极性的流动分子占据活性中心的能力强，因而具有强的洗脱作用，非极性流动相占据活性中心的能力弱，洗脱作用也要弱得多。因而为了要使试样中吸附力稍有差异的各组分分离，就必须根据试样的性质、吸附剂的活性，选择适当极性的流动相。