芋头多糖的分离纯化及对细胞免疫的调节作用

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芋头多糖的分离纯化及对细胞免疫的调节作用

作者：姜绍通， 汪洪普， 潘丽军， JIANG Shao-tong， WANG Hong-pu， PAN Li-jun

作者单位：合肥工业大学农产品加工研究院,生物与食品工程学院,安徽省农产品精深加工重点实验室,安徽合肥230009

刊名：

食品科学

英文刊名：Food Science

年，卷(期)：2013,34(19)

本文链接：https://www.wendangku.net/doc/683720911.html,/Periodical_spkx201319059.aspx

细胞和细胞器及间质的分离

第一篇组成人体的细胞 第三章亚细胞结构的分离与鉴定 细胞山各种亚细胞结构组成。其重要的研究手段之一是分离纯化亚细胞组分，观察它们的结构或进行生化分析。离心技术是实现这一日标的基本手段。一般认为，转速为10?25Kr/mm的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min,离心力大于89Kg者称为超速离心机。U前超速离心机的最高转速可达lOOKr/min, 离心力超过500Kg。 第一节亚细胞结构分离的技术 分离亚细胞组分的第一步是制备组织匀浆或细胞匀浆。匀浆 (Homogenization)是在低温条件下，将组织或细胞放在匀浆器中加入等渗匀浆 介质(即0?25moLZL蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液)研磨，使细胞被机械地研碎成为各种 亚细胞组分和包含物的混合物。 分离亚细胞组分的第一步是分级分离。它通过山低速到高速离心技术，使非均一混合体中的颗粒按其大小轻《分批沉降到离心管的不同部位，再分部收集, 即可得到各种亚细胞组分。山于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时是均匀分布于整个离心管中，故每级分离得到的第一次沉淀必然不是纯的最巫的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。分离亚细胞组分主要离心技术是差速离心和密度梯度离心。 差速离心(differential centrifugation)是在密度均一的介质中山低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体、最后为核糖体。山于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，一般重复2?3次效果会好一些。通过差速离心可将细胞器初步分离，但常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 密度梯度离心(density gradient centrifugation)是用一定的介质在离心管内 形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过? 力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离乂可分为速度沉降和等密度沉降两种。密度梯度离心常用的介质为氯化锂，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：能产生密度梯度，且密度高时，粘度不商；pH中性或易调为中性；浓度大时渗透圧不大；对细胞无毒。①速度沉降(velocity sedimentation)主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于彼分离生物颗粒的最小密度。生物颗粒(细胞或细器)在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离：②等密度沉降(isopycnic sedimentation)适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。 等密度沉降通常在较高密度的介质中进行。介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度。再者，这种方法所需要的力场通常比速度沉降法大10、100倍，故往往需要高速或超速离心，离心时间也较长。大的离心力、长的离心时间都对细胞不利。因此，这种方法适于分

免疫细胞的分离及表面标志检测技术免疫细胞功能

第十四章免疫细胞的分离及表面标志检测技术 第十五章免疫细胞功能检测技术 Separation and Assays for Immunocyte 第一部分目的要求和教学内容 一、目的要求 掌握：Ficoll—hypaque分层液分离PBMC的原理、方法，淋巴细胞亚群分离的原理、 方法及应用，T细胞增殖试验的方法，B细胞的数量及功能的检测，NK细胞的活性、中性粒细胞、巨噬细胞功能的检测方法；熟悉：T细胞功能的体内试验、T细胞介导的细胞毒检测的方法；了解：淋巴细胞的纯化与亚群分离的方法、吞噬细胞的分离方法、溶血空斑试验。 二、教学内容 1．免疫细胞的分离与纯化：细胞的分离，外周血单个核细胞的分离，淋巴细胞的纯化与亚群分离，吞噬细胞的分离。 2．淋巴细胞的数量检测：T细胞数量检测，B细胞数量检测。 3．淋巴细胞的功能检测：T细胞功能检测，B细胞功能检测，NK细胞活性测定。 4．吞噬细胞功能检测：中性粒细胞功能检测，巨噬细胞功能检测。 第二部分测试题 一、选择题 (一)单项选择题(A型题) 1．外周血中的单个核细胞主要是指 A．淋巴细胞 B．嗜酸粒细胞 C．单核细胞一淋巴细胞 D．单核细胞 E．中性粒细胞 2．分离人外周血淋巴细胞分层液的最佳密度为 A． 1.030 B． 1.035 C． 1.092 D． 1.020 E． 1.077 3．用FicolI—hypaque分层液分离PBMC,分离的PBMC层位于试管的 A．血浆层之上 B．血浆层之中 C．血浆层与分层液之间 D．分层液之中 E．试管底部 4．用玻璃纤维或葡聚糖凝胶Sephadex-G10柱分离细胞时，从柱上洗脱下的细胞主 要是 A．粒细胞

多糖的分离纯化及生理作用

多糖的分离纯化及生理作用 多糖包括植物多糖、动物多糖和微生物多糖。人们已发现多糖不仅是机体的能量来源和骨架成分，而月还具有多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成作用等多种生物活性。 多糖的提取和纯化 1. 多糖的提取 1.1 热水浸提法：其步骤为：原料→粉碎→脱脂→粗提（2－3次）→吸滤或离心→沉淀→洗涤→干燥 首先除去表面脂肪。原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加热搅拌或回流1－3小时，脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂（也有用氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1％醋酸和1％苯酚或0.1－1M氢氧化钠作为提取溶剂）提取多糖。温度控制在90－100℃，搅拌4－6小时，反复提取2－3次。得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤。也可用离心法将不溶性杂质除去，将滤液或上清液混合（得到的多糖若为碱性则需要中和）。然后浓缩，再加入2－5倍低级醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入费林氏溶液或硫酸铵或溴化十六烷基三甲基铵等，与多糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀。然后依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤。将洗干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷和氢氧化钠的真空干燥器中减压干燥（若沉淀的多糖为胶状或具粘着性时，可直接冷冻干燥）,干燥后可得粉末状的粗多糖。 1.2 微波辅助提取法： 其原理为利用不同极性的介质对微波能的不同吸收程度，使基体物质中的某些区域和萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使萃取物质从基体或体系中分离出来，进入到介电常数小，微波吸收能力较差的萃取剂中。由于微波能极大加速细胞壁的破裂，因而应用于中草药中有效成分的提取能极大加快提取速度，增加提取产率。而且由于其选择性好，提取后基体能保持良好的性状，提取液也较一般的提取方法澄清。聂金源等在柴胡多糖和黄酮化合物的提取[18]中对微波辅助提取法、超声辅助法和索氏提取法进行比较，发现微波辅助提取法所需时间最短（10min），多糖的提取率最高（28.46％）。 1.3 超声辅助法： 其原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取[16]。超声波辅助法与常规提取法相比，具有提取时间短、产率高、无需加热等优点[17]。 1.4 索氏提取法： 将植物粉末置于索氏提取器中，加入石油醚，60℃-90℃条件下提取至无色（一般为6小时）。过滤，滤渣挥发干燥完溶媒后加入80%乙醇，再提取6小时，过滤，滤渣乙醇挥发干燥后加蒸馏水。回流提取2次，趁热过滤，滤液减压浓缩，再除蛋白，醇沉，除色素。60℃干燥，称重。 1.5 醇提法： 先后将90%和50%乙醇加入植物粉末中，振荡充分再抽滤。滤液中加入足量无水乙醇，至于4℃冰箱中过夜。减压抽滤，再除去色素，得多糖粗品，在60℃通风干燥箱中干燥，再置干燥皿中恒重保存。 醇提法方法简单，易于操作，但提取率较低，乙醇使用量大，不宜大规模提取使用。 2.多糖的纯化方法纯化是将多糖混合物分离为单一多糖的过程，纯化的方法主要有以下几种： 2.1 分部沉淀法根据各种多糖在不同浓度的低级醇或丙酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同浓度下析出的沉淀，经反复溶解与沉淀后，直到测得的物理常数恒定（最常用的是比旋光度测定或电泳检查）。这种方法适合于分离各种溶解度相差较大的多糖。为

多糖分离纯化的基本原则和方法

多糖分离纯化的基本原则和方法 多聚糖(polysaccharide)，简称多糖，常由一百个以上甚至几千个单糖基通过糖苷键连接而成的，其性质已大不同于单糖，如甜味和强的还原性已经消失，广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中，是构成生命的四大基本物质之一，与生命功能的维持密切相关。近年来，大量研究表明多糖除了有增强免疫功能、抗肿瘤作用、抗氧化、抗衰老、消化系统保护作用的生物学效应外，还有抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗辐射、抗凝血等作用。 1、基本原则 在不破坏多糖活性的前提下进行多糖的分离纯化。尽量不引入新的杂质，或引入的新杂志易于除去，如小分子盐类可经过透析作用除去，铵根离子可通过加热挥发除去等[1]。 2、分离纯化方法 多糖的生物活性倍受关注，但不少多糖的提取方法和工艺尚未成熟，基于效率、成本多方面的考虑，各种方法的开发、比较、分析是研究工作的焦点之一。目前多糖提取方法主要有溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶解法、超滤法、超声法、微波法、超临界流体萃取法。首先要根据多糖的存在形式及提取部位不同，决定在提取之前是否做预处理：提取时需注意对一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在用水提取前，应先加入甲醇或l：l的乙醇乙醚混合溶液或石油醚进行脱脂，而对含色素较高的根、茎、叶、果实类，需进行脱色处理。 2.1多糖的提取与分离方法 由于各类多糖的性质及来源不同，所以提取方法也各有所异，主要归纳为以下几类： 第一类难溶于水，可溶于稀碱液的主要是胶类，如木聚糖及半乳糖等。原料粉碎后用0.5mol/L NaOH水溶液提取，提取液经中和及浓缩等步骤，最后加入乙醇，即得粗糖沉淀物。 第二类易溶于温水，难溶于冷水的多糖，可用70~80℃热水提取，提取液用氯仿：正丁醇（4:1）混合除去蛋白质，经透析、浓缩后再加入乙醇即得粗多糖产物[2]。 第三类粘多糖的提取。在组织中，粘多糖与蛋白质以共价键结合，故提取

枸杞多糖分离纯化及性质研究

第25卷　第3期 2008年6月 黑龙江大学自然科学学报JOURNAL OF NAT URAL SC I E NCE OF HE I L ONGJ I A NG UN I V ERSI TY Vol 125No 13 June,2008 枸杞多糖分离纯化及性质研究 张　晶1,2,　韩喜江1,　李艳波2 (1.哈尔滨工业大学化学系,哈尔滨150001;2.哈尔滨学院生化学院,哈尔滨150080) 摘　要:对东北枸杞中提取的多糖,通过DEAE -cellul ose (OH -)色谱柱和Sephadex G -100 凝胶色谱柱进行了分离纯化,通过凝胶色谱和液相色谱对其纯度进行了鉴定,并通过红外光谱初步分析了其基团构成。 关键词:枸杞多糖;分离纯化;纯度鉴定 中图分类号:R28412,TS244文献标志码:A 文章编号:1001-7011(2008)03-0377-04 收稿日期:2008-01-16 作者简介:张　晶(1973-),女,实验师,硕士,主要研究方向:应用化学、食品化学 0　引　言 枸杞是一种食药两用植物,具有多种药理作用和生理功能。枸杞多糖是枸杞中的主要活性成分之一,其中有关枸杞多糖的化学、药理与临床研究十分瞩目,已有不少研究报道枸杞多糖具有增强免疫力、抗癌、防衰 老、抗疲劳、降血压、降血糖、抑制肿瘤生长和细胞突变等作用[1-2]。鉴于枸杞多糖具有多种药理作用和生理 功能,因此,对其提取分离方法及纯化的研究显得尤为重要[3]。本文重点对牡丹江地区枸杞多糖的分离纯 化及组成结构作了初步探讨。 1　实验材料和方法 111　材料与仪器 牡丹江地区枸杞子;其它试剂均为分析纯。自动部分收集器,台式干燥箱,紫外分光光度计,Perkin -El 2mer 红外光谱仪,Aglilent 1100液相色谱仪等。 112　枸杞多糖提取 称取100g 枸杞子60℃烘干,放置干燥器18h 后粉碎,称取10g 干燥的枸杞粉,用氯仿-甲醇(2∶1)300mL,用索氏回流装置于60℃回流脱脂。残渣风干后,加入适量水,在100℃,料水比1∶15条件下水浴提取4h,抽滤,将滤液蒸发浓缩为原体积的1/4后,将浓缩液滴入3倍体积的95%乙醇中,静置,抽滤,固形物 分别用95%乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤,水浴加热干燥得枸杞粗多糖[4]。 113　枸杞多糖分离纯化 11311　DEAE -cellul ose (OH -)色谱柱层析 将分离提取的枸杞粗多糖110g 溶于水,上DEAE -cellul ose (OH -)色谱柱,梯度洗脱法洗脱各级分,洗 脱液分别为蒸馏水、011mo1?L -1,0125mol ?L -1和015mol ?L -1NaCl,011mol ?L -1Na OH 各100mL,流 速为30滴每分钟,自动部分收集器收集洗脱液,将收集到的样品溶液分别在280nm 波长下比色,然后用硫 酸一蒽酮法测定总糖含量。以试管数目为横坐标,以吸光度为纵坐标作DE AE -cellul ose (OH -)色谱柱洗脱 曲线图。分别合并各主峰溶液,浓缩,流水透析,冷冻干燥,得LBP -1,LBP -2,LBP -3和LBP -4.11312　Sephadex G -100凝胶色谱柱。 收集多糖含量最多的组分,进行凝胶色谱分离。流速为013mL ?m in -1,每支试管接收3mL 洗脱液,硫 酸一蒽酮法检测多糖洗脱状况。以洗脱管数为横坐标,吸光值为纵坐标作流出曲线,合并主峰溶液,浓缩,流水透析,冷冻干燥。

实验二 细胞器的分离与提纯

实验二细胞器的分离与观察 一、教学目的与要求 1. 学习利用差速离心法分离动物细胞的细胞器。 2. 掌握细胞核与线粒体的染色方法和现象。 二、实验原理 线粒体（Mitochondria，MT）是真核细胞特有的，进行能量转换的重要细胞器，有“细胞动力工厂”之称。细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在线粒体中进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成A TP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。 制备线粒体采用组织匀浆悬液介质中进行差速离心的方法。在给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次分离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而细胞质中的染料被还原成无色。 三、实验用品 器材：冰箱、纱布、瓷研钵、高速冷冻离心机。 材料：新鲜的猪肝脏。 试剂：见PAGE 64 四、实验步骤 1. 制备猪肝细胞匀浆。实验前购买新鲜猪肝脏备用。 割取一小块肝组织，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织1g，剪碎，用预冷到0-4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0-4℃条件下，按每克肝加4ml 冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加，匀浆用双层纱布过滤备用。注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。 2. 差速离心。先将5ml 0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心地加入5ml 肝匀浆使其覆盖于上层，用高速冷冻离心机进行差速离心。 3. 滤液经700×g离心10min，分离核和杂质沉淀。 4. 取上清液10 000×g离心10min，沉淀为线粒体。 5. 沉淀经再次洗涤、离心后，即可得到纯度较高的线粒体。 5. 分离物鉴定。

免疫细胞的分离和保存技术

免疫细胞的分离和保存技术 用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。 一、白细胞的分离 （一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。 本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min 后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。 （二）聚合物加速沉淀法 本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。本法的细胞获得率比自然沉降法高。 二、外周血单个核细胞的分离 外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为 1.075～1.090，血小板为 1.030～1.035。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的

植物细胞器的分离

植物细胞器的分离 一、叶绿体的分离： 1.实验原理： 采用差速离心法，利用不同颗粒的大小形状不同导致沉降速率不同，把叶绿体的颗粒沉降出来。 2.实验材料及试剂： 成熟的猪笼草、山梨醇、Tris、EDTA与β-巯基乙醇均为Amresco产品、细胞器分离缓冲液:300 mmol/L山梨醇, 50mmol/L Tris-HCl(pH为8.0), 5 mmol/L EDTA(pH 8.0), 0.1%β-巯基乙醇(临用前加入)。 3.实验器材： SG350C多功能食品料理机(上海天航电器有限公司) , GL21M高速冷冻离心机及配套的2号角转头(湘仪集团) 山梨醇：配制体积：100 mL，浓度：3 mol/L；分子量：182.17g/mol 需要称取质量g:=100 mL*3 mol/L*182.17g/mol=0.1L*3 mol/L*182.17g/mol=54.651g EDTA: 配置体积：100ml , 浓度：0.5mol/lL ,分子量：292.248g/mol m= 0.5mol/L *100mL *292.248g/mol =14.6124 g LEDTA : 配置体积:100ml 浓度：25mol/L ,分子量：292.248g/mol m=2.5mol/L*100mL * 292.248g/mol=73.062g 4.制备方法 4.1 叶绿体粗提物的制备 （1）. 取25 g叶片置于100 mL充分预冷的细胞器分离缓冲液中,用食品料理机匀浆2 min(5000r/min), （2）. 然后将匀浆液用4层纱布过滤于500ml烧杯, （3）. 滤液于4℃、700g在1000r/min离心10 min,

多糖的提取和纯化

多糖的提取和纯化目前，真菌多糖的提取可从子实体和采用深层培养发酵液的菌丝中分离获得，但以从子实体中提取多糖为主。首先是将子实体粉碎，加入甲醇或乙醇乙醚1:1混合液，水浴加热搅拌1一3小时除去表面脂肪。其次是用残渣提取多糖，常用的方法有不同温度下的水提法、稀酸提法、冷热稀碱提法。水提法采用的较多，适合于提取水溶性多糖。稀酸提取法适用于提取酸溶性多糖、时间宜短，温度不超过50℃，以防止糖昔键断裂。稀碱法适合于提取碱溶性糖。然后除去小分子杂质，常采用透析法，将多糖提取液置于半透膜透析袋中，逆向流水透析1一3天。第四步是沉淀多糖。大部分多糖在有机溶剂中的溶解度极小，所以可用有机溶剂来沉淀。常用4一5倍低级醇、丙酮，一般在pH=7.0左右沉淀多糖，制得粗多糖。最后是除去蛋白质。除去多糖中的蛋白质常用的方法是三氯醋酸法。得到的溶液基本上是没有蛋白质与小分子杂质的多糖混合物或单一多糖。 多糖的纯化是将多糖混合物分离为单一的多糖。纯化方法很多，主要纯化方法有:(l)分步沉淀法根据不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小而大加入这些醇或酮分步沉淀。此法适用于分离各种溶解度相差较大的多糖。(2)盐析法根据不同多糖在不同浓度盐中具有不同溶解度而分离。 纯度鉴定和分子量测定多糖纯度标准不能用通常化合物纯度标准来衡量，因为我们所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围内的均一组成。因此，测得的分子量一般为平均分子量。过去常用粘度法、蒸气压渗透计法、沉降法、超速离心法、光散射法等测定高分子化合物分子量的方法测定真菌多糖的分子量，但由于这些方法测定起来比较麻烦，且误差较大，现多数已不采用。目前实验室常用的方法为凝胶过滤法和高压液相色谱法，对于分子量小于1百万的多糖用高压液相法为最好。 1.2.1发酵、提取 取香菇465菌株斜面菌种接人摇瓶培养基中振荡培养，逐级扩大培养至10O0L，25℃下通 气培养72h，压滤，得香菇深层培养菌丝体。 上述菌丝体经水洗涤后，用3倍量热水(90一100℃)浸取3h，浸取液经浓缩加3倍量95肠乙 醇，离心得乙醇沉淀物一Le[‘’。 1.2。2分离、纯化 取Le上样于DEAE一纤维素柱上，用O。Olmol/L pH 6.95 Tris-HCI缓冲液洗脱，洗脱液分 部收集，分别用UV(280nm)和酚硫酸法测定其吸收值(A值)，合并吸收峰重叠的洗脱液，经浓 缩、透析、冻干得淡黄色絮状物Le一2· Le一2进一步用DEAE一纤维素(DE52型)分离，先用pH7.8的0.oosmol/L硼酸缓冲液洗脱， 后用含lmol/L NaCI的o.Zmol/L硼酸缓冲液洗脱.各洗脱液按上法用UV230nm和酚硫酸法 检测，分别收集既含肤又含糖的洗脱液.用o.005mol/L硼酸缓冲液洗脱的组分为Le一2一1，用含 lmol/L NaCI的硼酸缓冲液洗脱的组分称Le一2一2o 1.2.3鉴定 1.2.3.1纯度 (l)HPLC法将样品配成1%浓度后进样.进样量20召L。流动相:0.002mol/L NaAc;

多糖的分离纯化

多糖的提取和纯化 多糖的提取和纯化 摘要本文较详细地介绍了多糖的提取和纯化方法，为多糖的研究和生产提供参考依据。 关键词多糖；提取；纯化；活性炭 多糖（polysacharides，PS），又称多聚糖，是由10个以上的单糖通过苷键连接而成的，具有广泛生物活性的天然大分子化合物。它广泛分布于自然界高等植物、藻类、微生物（细菌和真菌）与动物体内。20世纪60年代以来，人们逐渐发现多糖具有复杂的、多方面的生物活性和功能[1]：(1)多糖可作为广谱免疫促进剂，具有免疫调节功能，能治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系统疾病，甚至能抗AIDS病毒[2]。如甘草多糖具有明显的抗病毒和抗肿瘤作用[10]，黑木耳多糖、银杏外种皮多糖和芦荟多糖可抗肿瘤和增强人体免疫功能[3-5]。 (2)多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成作用。如柴胡多糖具有抗辐射，增强免疫功能等生物学作用[6]，麦冬多糖具有降血糖及免疫增强作用[7-8]，动物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能[9]。(3)多糖能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用[10]，银杏外种皮粗多糖具有抗衰老、抗过敏、降血脂、止咳祛痰、减肥等功能[11]。 另外，多糖作为药物，其毒性极小，因而多糖的研究已引起人们极大的兴趣。由于多糖具有的生物活性与其结构紧密相关，而多糖的结构又是相当复杂的，所以在这一领域的研究相对缓慢。但人们在多糖的分离提取与纯化方面已做出了不少工作。 1. 多糖的提取[12] 1.1 热水浸提法： 1.1.1多糖提取条件的优选 根据文献报道[13]：影响热水浸提多糖的因素主要有提取时间、提取次数、溶剂体积、浸提温度、pH值、醇析浓度和植物颗粒大小等。在试验前对上述多种因素利用正交实验法做出优选，才能选出最佳提取方案。 1.1.2其步骤为：原料→粉碎→脱脂→粗提（2－3次）→吸滤或离心→沉淀→洗涤→干燥 首先除去表面脂肪。原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加热搅拌或回流1－3小时，脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂（也有用氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1％醋酸和1％苯酚或0.1－1M 氢氧化钠作为提取溶剂）提取多糖。温度控制在90－100℃，搅拌4－6小时，反复提取2－3次。得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤。也可用离心法

多糖的提取分离方法

生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖大类. 多糖地提取首先要根据多糖地存在形式及提取部位，决定在提取之前是否做预处理. 动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚地混合液进行回流脱脂，释放多糖. 植物多糖提取时需注意一些含脂较高地根、茎、叶、花、果及种子类，在提取前，应先用低极性地有机溶剂对原料进行脱脂预处理，目前多糖地提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等. ．溶剂法 ．．水提醇沉法 水提醇沉法是提取多糖最常用地一种方法. 多糖是极性大分子化合物，提取时应选择 水、醇等极性强地溶剂. 用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到左右，利用多糖不溶于乙醇地性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置，多糖地质量分数和得率均较高. 影响多糖提取率地因素有：水地用量、提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等. 文档收集自网络，仅用于个人学习 水提醇沉法提取多糖不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产，是一种可取地提取方法.但由于水地极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性地成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后续地分离带来困难，且该法提取比较耗时，提取率也不高.文档收集自网络，仅用于个人学习 ．．酸提法 为了提高多糖地提取率，在水提醇沉法地基础上发展了酸提取法. 如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团地多糖在较低值下难以溶解，可用乙酸或盐酸使提取液成酸性，再加乙醇使多糖沉淀析出，也可加入铜盐等生成不溶性络合物或盐类沉淀而析出.文档收集自网络，仅用于个人学习 由于＋地存在抑制了酸性杂质地溶出，稀酸提取法提取得到地多糖产品纯度相对较高，但在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键地断裂，且酸会对容器造成腐蚀，除弱酸外，一般不宜采用. 因此酸提法也存在一定地不足之处.文档收集自网络，仅用于个人学习 ．．碱提法 多糖在碱性溶液中稳定，碱有利于酸性多糖地浸出，可提高多糖地收率，缩短提取时间，但提取液中含有其它杂质，使粘度过大，过滤困难，且浸提液有较浓地碱味，溶液颜色呈黄色，这样会影响成品地风味和色泽.文档收集自网络，仅用于个人学习 ．．超临界流体萃取法 超临界流体萃取技术是近年来发展起来地一种新地提取分离技术. 超临界流 体是指物质处于临界温度和临界压力以上时地状态，这种流体兼有液体和气体地特点，密度大，粘稠度小，有极高地溶解，渗透到提取材料地基质中，发挥非常有效地萃取功能. 而且这种溶解能力随着压力地升高而增大，提取结束后，再通过减压将其释放出来，具有保持有效成分地活性和无溶剂残留等优点. 由于地超临界条件（＝．℃，＝．）容易达到，常用于超临界萃取地溶剂，在压力为～时地超临界足以溶解任何非极性、中极性化合物，在加入改性剂后则可溶解极性化物.文档收集自网络，仅用于个人学习 该法地缺点是设备复杂，运行成本高，提取范围有限. ．酶解法 ．．单一酶解法 单一酶解法指地是使用一种酶来提取多糖，从而提高提取率地生物技术. 其中经常使 用地酶有蛋白酶、纤维素酶等. 蛋白酶对植物细胞中游离地蛋白质具有分解作用，使其结构变得松散；蛋白酶还会使糖蛋白和蛋白聚糖中游离地蛋白质水解，降低它们对原料地结合力，

多糖的分离纯化

1.2.2 离子交换层析鹿茸多糖初级分离纯化采用DEAE－52 离子交换柱。称取鹿茸多糖80mg，溶于10mL 蒸馏水中，4000r /min 离心10min，取上清液样，依次用蒸馏水，0.3、0.5、0.7、1mol /L NaCl 溶液梯度洗脱，流速控制为0.5mL /min，分管收集，每管5mL，苯酚硫酸法跟踪检测多糖含量，绘制洗脱曲线，合并同一吸收峰的洗脱液，蒸馏水透析24h，减压浓缩，冷冻干燥，即得DEAE－52 纯化多糖。 1.2.3 凝胶排阻层析鹿茸多糖进一步分离纯化采用Sepharose CL－6B 凝胶排阻层析柱。将经DEAE－52 分离后的多糖溶于蒸馏水，浓度为10mg /mL，以2mL /次上样，蒸馏水洗脱，流速控制为30mL /h，每管5mL，苯酚硫酸法跟踪检测，绘制洗脱曲线，收集、合并相同洗脱组分，透析，冷冻干燥即得SepharoseCL－6B纯化多糖。 1.2.4 鹿茸多糖紫外扫描将Sepharose CL－6B 纯化后精制多糖配 成一定浓度溶液，190～400nm 下进行紫外光谱扫描，以蒸馏水作空白。 2.2.4粗多糖的分离纯化 2.2.4.1粗多糖的离子柱层析 取水提粗多糖样品和碱提水溶性多糖样品溶于蒸馏水中,配制成20mg/mL的溶液,4000印m离心10min,取上清液用DEAE一SepharoseFastFlow离子柱层析(2.6-40cm)进行初步分离,上样量为25mL"首先以蒸馏水洗脱,再用0.1,0.2,0.4,0.6,2mol几的NaCI进行梯度洗脱,自动部分收集仪分步收集流分,洗脱液每10mL收集一管,苯酚硫酸法检测,根据糖显色反应结果合并相同流分"

多糖的分离纯化及分析

多糖的分离纯化及分析 一、多糖的提取方法 （一）溶剂提取法 1、水提法 水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法.多糖是极性大分子化合物，提取时应选择水、醇等极性强的溶剂.用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到70%左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置5h，多糖的质量分数和得率均较高. 2、酸碱提法 有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。与酸提类似，碱提中碱的浓度也应得到有效控制，因为有些多糖在碱性较强时会水解。 3、超临界流体萃取法 超临界流体萃取技术是近年来发展起来的一种新的提取分离技术. （二）生物酶提取法 酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，在多糖的提取过程中，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件中分解植物组织，加速多糖的释放或提取。此外，使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等的产物，常用的酶有蛋白酶，纤维素酶，果胶酶等。 （三）超声提取法 超声波是一种高频率的机械波，其主要原理是利用超声波产生的“空化作用”对细胞膜的破坏，有利用植物有效成分的释放，而且超声波能形成强大的冲击波或高速射流，有效地减小、消除与水相之间的阻滞层，加大了传质效率，有助于溶质的扩散。超声波提取与传统的提取方法相比，有提取效率高、时间短、耗能低等优点。 （四）微波提取 微波是频率介于300MHz和300GHz之间的非电离电磁波，微波提取的原理是微射线辐射于溶剂并透过细胞壁到达细胞内部，由于溶剂及细胞液吸收微波能细胞内部温度升高，压力增大，当压力超过细胞壁的承受能力时，细胞壁破裂，位于细胞内部的有效成份从细胞中释放出来，传递转移到溶剂周围被溶剂溶解。 二、多糖的分离纯化 （一）多糖的分离 采用一般方法提取的多糖通常是多糖的混合物，分级的方法可达到纯化的目的．可按溶解性不同进行分级、按分子大小和形状分级(如分级沉淀、超滤、分子筛、层析等)，也可按分子所带基团的性质分级． 1、按溶解性不同分离 （1）分步沉淀法 分步沉淀法是根据不同多糖在不同浓度低级醇、酮中具有不同溶解度的性质，从小到大按比例加入甲醇或乙醇或丙酮进行分步沉淀． （2）盐析法 盐析法是根据不同多糖在不同盐浓度中溶解度不同而将其分离的一种方法。常用的盐析剂有氯化钠、氯化钾、硫酸铵等，其中以硫酸铵最佳。

多糖的提取和纯化

多糖的提取和纯化 多糖的提取和纯化多糖的提取和纯化摘要本文较 详细地介绍了多糖的提取和纯化方法，为多糖的研究和生产提供参考依据。关键词多糖；提取；纯化；活性炭多糖（polysacharides，PS），又称多聚糖，是由10个以上的单糖通过苷键连接而成的，具有广泛生物活性的天然大分子化合物。它广泛分布于自然界高等植物、藻类、微生物（细菌和真菌）与动物体内。20世纪60年代以来，人们逐渐发现多糖具有复杂的、多方面的生物活性和功能[1]：(1)多糖可作为广谱免疫促进剂，具有免疫调节功能，能治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系统疾病，甚至能抗AIDS病毒[2]。如甘草多糖具有明显的抗病毒和抗肿瘤作用[10]，黑木耳多糖、银杏外种皮多糖和芦荟多糖可抗肿瘤和增强人体免疫功能[3-5]。(2)多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成作用。如柴胡多糖具有抗辐射，增强免疫功能等生物学作用[6]，麦冬多糖具有降血糖及免疫增强作用[7-8]，动物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能[9]。(3)多糖能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用[10]，银杏外种皮粗多糖具有抗衰老、抗过敏、降血脂、止咳祛痰、减肥等功能[11]。另外，多糖作为药物，其毒性极小，因而多糖

的研究已引起人们极大的兴趣。由于多糖具有的生物活性与其结构紧密相关，而多糖的结构又是相当复杂的，所以在这一领域的研究相对缓慢。但人们在多糖的分离提取与纯化方面已做出了不少工作。1. 多糖的提取[12]1.1 热水浸提法：1.1.1多糖提取条件的优选根据文献报道[13]：影响热水浸提多糖的因素主要有提取时间、提取次数、溶剂体积、浸提温度、pH值、醇析浓度和植物颗粒大小等。在试验前对上述多种因素利用正交实验法做出优选，才能选出最佳提取方案。1.1.2其步骤为：原料→粉碎→脱脂→粗提（2－3次）→吸滤或离心→沉淀→洗涤→干燥首先除去表面脂肪。原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加热搅拌或回流1－3小时，脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂（也有用氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1％醋酸和1％苯酚或0.1－1M氢氧化钠作为提取溶剂）提取多糖。温度控制在90－100℃，搅拌4－6小时，反复提取2－3次。得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤。也可用离心法将不溶性杂质除去，将滤液或上清液混合（得到的多糖若为碱性则需要中和）。然后浓缩，再加入2 －5倍低级醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入费林氏溶液或硫酸铵或溴化十六烷基三甲基铵等，与多糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀。然后依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤。将洗干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷和氢氧

多糖的分离和纯化

一、多糖的分离和纯化 多糖是极性极大的大分子化合物，提取时一般先将原料脱脂、脱色，然后用水、盐或稀碱水在不同温度下提取。提取物浓缩后加沉淀剂(乙醇、丙酮等)离心沉淀，沉淀部分可反复多次离心沉淀，以除去部分水溶性色素等杂质。 1．除蛋白 用水或稀碱提取的多糖常含有蛋白质，常用的除蛋白质的方法有Sevag 法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法等。前两种多用于微生物多糖，后者多用于植物多糖。 Sevag 法是经典的除蛋白质方法，复杂、费时，且样品损失较大。冯建林等比较了Sevag 法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、硫酸铵法及木瓜蛋白酶复合酶法除蛋白的效果，从蛋白残留量和多糖的得率两方面评价．认为三氯乙酸法最好，但三氯乙酸仍不能完全除去蛋白，建议三氯乙酸法和Sevag 法结合使用。 2．脱色 多糖中常含有一些色素(游离色素或结合色素)，根据其不同性质采取不同的去除方 法。常用的脱色方法有离子交换法、氧化法、金属络合物法、吸附法(纤维素、硅藻土、高岭土、活性炭等)。 D EA E一纤维素是目前最常用的脱色方法，通过离子交换柱不仅达到脱色目的，而且可以进行多糖的分离。 H2 O2：是一种氧化脱色剂，浓度不宜过高，宜在低温下进行，否则引起多糖的降解。 对于同时含有游离蛋白质和色素的多糖，可通过生成金属络合物的方法同时除去蛋白和色素，即加入费林试剂生成不溶性络合物，经分离后用阴离子交换树脂分解络合物。 吸附脱色法也常用，如通过活性炭、高岭土、硅藻土柱达到脱色的目的。 3．多糖的分级 采用一般方法提取的多糖，通常是多糖的混合物，即是多分散性的，其不均一性表现在化学组成、聚合度、分子形状等的不同。 分级可以达到纯化的目的，可按分子大小和形状分级(如分级沉淀、超滤、分子筛、层析等)，也可按分子所带基团的性质分级(如按电荷性质分级的电泳、离子交换层析等)。(1)分级沉淀 利用分子大小和溶解度不同进行分离，常用的有两种方法，即有机溶剂沉淀法和季 铵盐或硫酸铵法。Ba(O H )2、Ca(O H )2等也常用于酸性多糖的分级。 (2)柱层析法 柱层析法较常用，也可分为两类。 一类是只有分子筛作用的一般凝胶柱层析，如Sephadex、Saphrose、Bio gel等； 一类是离子交换层析，这种分级不仅按电荷性质不同，同时也有分子筛作用，如带负电荷的多糖可在阴离子型的D EA E一纤维素柱或D EA E—Sephadex 柱上达到分级；酸性多糖可在阳离子型的羧甲基(CM —Sephades)或黄乙基(SE—Sephadex)等凝胶柱上分离。这种离子交换树脂常用水、不同浓度和种类的缓冲溶液或酸碱液洗脱得以分级。检测手段国内仍沿用经典的酚一硫酸法，国外用LKB 柱层析系统，用比旋度、视差折光及紫外检测器，各组分的峰位自动记录，分离效果好且方便。 (3)透析、超滤及超速离心 选用不同规格的超滤膜和透析袋进行超滤和透析以及一定条件下的超速离心操作，可按分子大小将多糖样品分级，超滤和透析更常用于除去小分子物质。 (4) 区带电泳 区带电泳主要按多糖的电荷性质不同分级，常用的有聚丙烯酰胺凝胶电泳、乙酸纤维素薄膜电泳。

亚细胞器的分离方法

产品说明书 https://www.wendangku.net/doc/683720911.html, https://www.wendangku.net/doc/683720911.html, 亚细胞器的分离方法 亚细胞器的分离方法是细胞生物学研究中重要方法。它一般是研究某一特定的细胞器的 超微结构，生化组成及特定功能的前提和基础。 在体外功能研究中，分离纯化得到的亚细胞器是否具有生物学的活性是实验设计的关 键。 贝博生物基于生物学活性的需求，开了了一系列的亚细胞器分离的产品： 亚细胞结构提取试剂盒 BB-3601 BestBio 贝博生物 线粒体提取试剂盒 BB-36011 BestBio 贝博生物 细胞线粒体提取试剂盒 BB-36012 BestBio 贝博生物 组织线粒体提取试剂盒 BB-3602 BestBio 贝博生物 细胞核提取试剂盒 BB-36021 BestBio 贝博生物 胞浆/胞核分离试剂盒 BB-36022 BestBio 贝博生物 组织胞浆/胞核分离试剂盒 BB-3603 BestBio 贝博生物 溶酶体提取试剂盒 BB-3604 BestBio 贝博生物 高尔基体提取试剂盒 BB-3605 BestBio 贝博生物 内质网提取试剂盒 BB-3606 BestBio 贝博生物 核糖体提取试剂盒 BB-36052 BestBio 贝博生物 植物内质网提取试剂盒 BB-3611 BestBio 贝博生物 植物线粒体提取试剂盒 BB-3612 BestBio 贝博生物 血小板线粒体提取试剂盒 BB-3622 BestBio 贝博生物 叶绿体提取试剂盒 BB-3631 BestBio 贝博生物 酵母线粒体提取试剂盒 BB-36112 BestBio 贝博生物 植物细胞核提取试剂盒 BB-36113 BestBio 贝博生物 微藻细胞核提取试剂盒 BB-3621 BestBio 贝博生物 植物原生质体制备试剂盒 BB-3630 BestBio 贝博生物 酵母原生质体制备试剂盒

多糖的提取分离及纯化研究

多糖的提取分离及纯化研究 李云梅 (黑龙江大庆市第四医院,黑龙江,大庆,163000) 摘要 对多糖的认识备受关注,常用的提取方法有:溶剂提取法、酸提取法、碱提取法、酶解法、超滤、超声波、微波、超临界流体萃取;分离纯化技术有:沉淀法、柱层析。本文对以上种实验方法做一简单介绍。 关键词 多糖;提取;分离;纯化 中图分类号 R282.6 文献标识码 B 文章编号 1007-8517(2009)14-0135-01 1多糖的提取 1.1溶剂提取法溶剂提取法[1]是从植物中提取多糖的常用方法。它利用多糖不溶于乙醇的性质在提取液中加乙醇、甲醇或丙酮使多糖从提取液中沉淀出来,达到初步纯化的目的。溶剂提取法一般遵循相似相溶原则。 1.2酸提法酸提法操作上应严格控制酸度,因为酸性较强条件下可能引起多糖中糖苷键断裂,,而且易对容器造成腐蚀,故除弱酸外,一般不宜采用,所以有关这方面的报道比较少,但有研究证明羊栖菜多糖[3],大豆多糖[4],香菇多糖[5]采用稀酸提取效果较佳.。用稀酸提取时时间宜短,温度最好不高于50 。 1.3碱提法有些多糖在碱液中有更高的提取率,尤其是提取含有糖醛酸的多糖,但不适合提取含硫酸基的酸性多糖。碱提过程中防止多糖降解,常通以氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾。同时,还应控制碱的浓度,因为有些多糖在碱性较强时会水解。 1.4酶解法酶是生物催化剂,能降低化学反应的活化能,加速反应,在多糖的提取过程中,利用酶促反应,降低体系中的活化能,使反应在较低能量水平上进行,在比较温和的条件中分解植物组织,加速多糖的释放或提取.常用的生物催化剂有蛋白酶、纤维素酶、果胶酶等. 1.5超滤法超滤是一种加压膜分离技术,即在一定的压力下,使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜,而使大分子溶质不能透过,留在膜的一边,从而使大分子物质得到了部分的纯化。 1.6超声法超声提取又称超声波萃取、超声波辅助萃取,是一种物理破碎过程,其基本原理是利用超声波辐射产生的空化作用、机械作用及热学作用,其中最重要的是超声波空化作用,形成高温和高压的环境,增加物质分子运动的频率和速度、溶剂的穿透力,从而加速目标成分进入溶剂,提高提取率[2]。 1.7微波法微波提取法作为一种新型的萃取技术,是根据不同物质吸收微波能力的差异使得基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热,从而使得被萃取物质从基体或体系中分离,进入到介电常数较小、微波吸收能力相对差的萃取剂中,达到提取的目的。 1.8超临界流体萃取法超临界流体萃取法的技术就是利用超临界流体为溶剂,从固体或液体中萃取出某些有效组分,并进行分离的一种技术。 2多糖的分离纯化2.1除蛋白通过上述方法制得的多糖一般为粗多糖,含有较多的蛋白质,。需要除蛋白,除蛋白的方法通常有Sevage 法、三氯乙酸法、酶解法、三氟三氯乙烷法等。 2.1.1Sev age法Sevag e法是除蛋白的经典方法,主要是利用蛋白质在氯仿中变性的特点,用氯仿:正丁醇=5:1或4:1的二元溶剂体系按1:5加入到多糖提取液中,混合物经剧烈振摇后离心,蛋白质与氯仿-正丁醇生成凝胶物而分离,分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。 2.1.2三氯乙酸法三氯乙酸法利用三氯乙酸,在低温下搅拌加入到多糖提取液中,直到溶液不再继续混浊为止离心弃沉淀,即可达到脱蛋白的目的。存在于溶液中的三氯乙酸经中和后,通过透析或超滤等方法除去。 2.1.3酶解法酶法提取是根据植物细胞壁的构成,利用酶反应所具有高度专一性的特点,选择相应的酶,将细胞壁的组成成分(纤维素、半纤维素和果胶质)水解或降解,破坏细胞壁结构,使细胞内的成分溶解、混悬或胶溶于溶剂中,从而达到提取目的,且有利于提高成分的提取率。 2.1.4三氟三氯乙烷法三氟三氯乙烷法将三氯乙烷按1: 1的比例加到多糖提取液中,在低温下搅拌约10m i n,离心得上层水层,水层继续用上述方法处理几次即得,此法效率较高,但因其易挥发,不宜大量应用。 2.2脱色在多糖提取过程中,由于氧化作用会有色素生成,色素的存在会影响多糖的色谱分析和性质测定。 2.3分离纯化 2.3.1沉淀法 2.3.1.1分部沉淀法利用不同分子量的多糖在不同浓度低级醇或低级酮中的溶解性不同的原理,逐步提高溶液中醇或酮中的浓度,使不同组分的多糖依分子量由大到小的顺序分级沉淀可达到纯化的目的。 2.3.1.2季胺盐沉淀法根据季胺盐能与酸性多糖形成不溶性化合物的性质,以分离酸性多糖。一般地说,酸性强或分子量大的多糖首先沉淀出来。2.3.1.3盐析法盐析法的机理是当溶液中有一定的离子浓度,醇析时多糖能完全沉淀出来。不同的多糖在不同浓度盐溶液中溶解度不同,常用的盐析剂N aC l、K C l和(NH 4 ) 2 SO 4 等,其中以(NH 4 ) 2 SO 4 效果最佳。 2.3.1.4超滤法一种用于分子分离的膜分离方法,利用不同孔径的超滤膜排阻不同分子量的多糖,达到分离。常用的有醋酸纤维素膜,聚砜酰胺膜等。该方法操作条件温和,不需要添加化学试剂,适用于热敏药物。 135 经验交流 中国民族民间医药 E xperi en ces C o mm un i cate C h i nese J ou rnal of E t hno m ed ici ne and E thnophar macy