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组织病理切片制备流程

组织病理切片制备流程

组织病理切片按照制备方法的不同分为石蜡切片、冰冻切片和振动切片。

石蜡切片制备过程包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般从取材固定到封片制成玻片标本需要数日。

冰冻切片(frozen section)是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度,然后进行切片的方法。制作过程不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续,避免组织细胞中可溶性物质的分解,并能保存细胞形态的原。与石蜡切片相比,在抗原完整性的保存上有其不可取代的优势,尤其在免疫组化方面。因此冷冻切片也是脂肪染色、酶组织化学染色以及某些免疫组织化学染色和原位分子杂交的理想制片方法。不足是组织细胞的形态略逊于石蜡切片。

振动切片在文献中讨论较少。制备方法是采用的专用振动切片机,利用刀片振动原理,将新鲜的活体组织,直接固定在切片槽中切片。该方法能保持样品活性和细胞良好形态,给免疫细胞化学研究及脊髓和脑薄片神经生物学研究提供了良好条件,适合做组织电生理学等研究。

不同切片方法由于制作的工艺流程不同,所需的仪器设备和工具有差别。

一、石蜡切片的制作

根据文献报道石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。

1.固定

用适当的固定液浸渍新鲜材料,凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化,使组织硬化,尽可能保持活体时的结构。固定时间从1小时至数天,通常为数小时至24小时。

2.洗涤与脱水

组织在固定后要把渗入里面的固定液洗去,否则留在组织中的固定液有的会妨碍染色,有的会产生沉淀或结晶。

固定后或洗涤后的组织内充满水分,如不除去水分就无法进行以后的透明、浸蜡与包埋,因为透明剂多数是苯类,苯类和石蜡均不能与水相融合,水分不脱尽,苯类不能浸入。因此,在透明、浸蜡前必须进行脱水。脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来,以利于有机溶剂的渗入。常用用的脱水剂为一系列不同浓度的乙醇。

脱水步骤是:80%、90%、95%、100%各种浓度乙醇2小时,此过程可用脱水机自控完成。

3.透明

组织脱水后,因乙醇不溶于石蜡,为使石蜡能浸入组织块,必须经过一种既能与酒精相混合,又能溶解石蜡的溶剂的替代过程,通过这种溶剂的媒介作用替换出组织内的酒精,而达到石蜡浸入组织块的目的。材料块在这类媒浸液中浸渍,出现透明状态,此液即称透明剂,

透明剂浸渍过程称透明。

目前最好的透明剂是二甲苯。通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1~2小时,再转入纯透明剂中浸渍。

4.浸蜡与包埋

组织透明后,放入熔化的石蜡内浸渍,使石蜡渗入组织同时取代组织内的二甲苯,这个过程称浸蜡。

浸蜡用的石蜡熔点在56℃,浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行。

将熔化好的石蜡倒入包埋框,用加温的镊子将浸蜡后的组织材料块切面朝下放入,待蜡液表层凝固即迅速冷却,完全凝固后即做成含有组织块的蜡块。

5.切片

包埋好的蜡块用刀片修整蜡块成方形或者长方形,在切片机上切成一片接着一片的4~7um的蜡带,用毛笔轻轻托起放在纸上。

6. 展片、捞片和烤片

展片:用眼科镊子镊起蜡带轻轻平铺在40~45℃的水面上,借水的张力和水的温度,将略皱的蜡带自然展平。

捞片:待切片在恒温水面上充分展平后,将蜡片捞到载玻片的中1/3和下1/3的中间,倾去载玻片上的余水。

烤片:一般在60℃的温箱内烤片0.5~1小时左右,脱去溶化组织间隙的石蜡。

7.切片脱蜡及水化

干燥后的切片需脱蜡及水化才能在水溶性染液中进行染色。如果脱蜡不干净,切片不易着色或着色不匀,脱蜡用的二甲苯要经常更换因此。因此H.E染色前还需用二甲苯脱蜡,再逐级经梯度酒精脱苯、直至蒸馏水复水。

8.染色

苏木精(Hematoxylin)和伊红(曙红,Eosin)染色法是组织学标本及病理切片标本的常规染色,简称HE染色。H.E染色后还需切片脱水、透明、封固处理。

所需仪器设备:全自动染色机

9.切片脱水、透明和封片

染色后的切片尚不能在显微镜下观察,需经从低浓度到高浓度的酒精梯度脱水、二甲苯透明。

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