细胞铺板：怎样才能铺得均匀

细胞铺板：怎样才能铺得均匀

做cell biology实验，细胞铺板大概是最常见的一个实验了。但是有很多人不是很得要领，铺得不是均匀：要么中间密周围稀，要么周围密中间秃顶。

以前分享的一些技巧：

1、一般96孔板我每孔是加100微升细胞悬液，从孔的左边靠近底部加入，加完半边板后，将未加的细胞悬液混一下再，继续加剩余的半边板子，都加完后盖上盖子，左手轻轻扶住板的左边，右手轻轻敲击板的右边缘，注意把握力度（我一般轻巧敲三下），太强或次数太多会导致细胞集中成堆，将板顺时针旋转（逆时针效果不好），依次敲击剩余三个边，静置约5分钟，放入37度培养箱。

6孔板12孔板或24孔板，我均采用将第一个孔加入少量无血清培养基，晃动浸润整个孔底，然后用移液枪吸至第二孔，同样方法浸润孔底，其它孔一次类推，这样整个孔底都是湿润的，细胞悬液会平铺在整个孔底，加细胞悬液的时候可以避免加在中间中间细胞多，而加在周边晃匀后周边细胞多中间少的现象，细胞分散较均匀，注意加完细胞悬液后要放工作台静置一下。这个方法就是有点慢，但操作熟练了也不慢。也可以采用轻拍的方式，但力度没有96孔板好掌握，效果没有96孔板好，所以我放弃改用浸润孔底的方法。

2、细胞悬液加完后，将细胞培养板抬高，对着灯光，从底部往上看，看细胞有没有抱团。然后从底部敲击，使之分散。

3、如果实验室有平板振荡器的话，我建议用这个仪器稍振荡一下，效果不错，就是振幅小，频率高的那种。

4、细胞要尽量打散，大部分呈单个状态。离心后，要充分悬浮！还有转移到六孔板后，是要晃得！晃的时候最好不要让那个细胞液转圈，不然细胞就全被带到中间去了，就会不均匀！

5、一瓶细胞长满后，正常处理，在培养瓶里吹匀，然后铺6孔板，每孔2毫升，铺完之后不用观察直接用酒精棉擦拭，然后放到培养箱里，轻微的左三圈右三圈前三圈后三圈。

基本上24小时之后观察每孔的细胞都会很均匀。

6、计算好所需要的全部液体量和细胞量，混匀后，加到六孔板里，六孔板按横8字型晃，显微镜下观察，如果不均匀，按上述方法再晃。如果细胞未计数直接种的话，在种六孔板的过程中，随时晃一下混匀用的瓶子，瓶子我通常是顺时针或逆时针转圈。

7、放在水平板面上先上下移动，再左右移动，每个方向５到６次，但关键的是摇完后最好直接放入培养箱中，不要再做过多的运动，例如放到镜下去看，否则很容易就又聚到中间去了。

细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结)

细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结) 一、消化与吹打 版上很多朋友讨论细胞培养问题，见到很多很好的经验总结，这里说一些我个人的经验，因为一些比较特殊的原因，我自己培养接触过近300种细胞，常用于做实验的，累积有百余种，可以说遇到过许多各式各样古怪的细胞。这里挑细胞消化开始做我的第一篇专题，并不是因为细胞消化最重要，而是近期看到大家频繁讨论这个话题，我就抛砖引玉，下面几点拙见，可能与其它朋友总结的一些经验有点出入，仅供大家参考。 许多同学对细胞消化做了许多研究，得出了很多有价值的经验，也见到很多人的困惑。其实细胞培养，尤其是细胞系的培养，就消化而言，不是太难，做得多了，善于总结经验，就能把细胞越养越好。一般的程序步骤，细节操作，我这里就不讲了，只讲一些基本操作背后的知识，如果不对之处，欢迎指正，一起讨论： 1，其实绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可，吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37度消化。 2，什么算是消化好了呢？不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养

细胞培养的一般过程

细胞培养的一般过程 一、准备工作 准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。 二、取材 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。 三、培养 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。 一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。 四、冻存及复苏 为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度—－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。 复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。 冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。 培养细胞的细胞生物学 一、体内、外细胞的差异和分化 1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞

细胞培养全过程

我是细胞培养的新手，在开始养细胞前看到篇文章（老师给的）很实用，希望对大家有帮助。细胞培养室实验操作规范 一、细胞培养室的环境 1. 细胞生长要求严格的无毒无污染环境，因此必须注意培养室的清洁卫生，保持操作空间的无菌条件： 1) 培养室应为独立、封闭的空间。培养室及缓冲间都应保持整洁，不要随意出入； 2) 保持超净工作台的无菌环境，每次使用前打开紫外灯照射消毒15—30分钟；每次使用后将废弃物清理干净，各用具规放整齐，用70%酒精擦净台面，再打开紫外灯照射30分钟以上； 3) 定期擦洗桌面、地板、清洁培养室，并用0.1%的新洁尔灭溶液消毒；定期打开培养室的大紫外灯，将整个房间进行照射消毒； 4) 每次打开培养箱前，或手伸入超净工作台进行操作之前，均应用70%酒精擦手。 5) 定期清理冰箱。将药品试剂分类摆放，过期的试剂应及时清除； 6) 培养箱要定期清洁。隔板及内壁等用0.1%的新洁尔灭溶液清洗，再用70%酒精擦净；并要注意底层水箱的水位，及时补充水份； 7) 注意监测CO2的气压，及时补充。 8) 注意监测液氮罐中液氮的挥发情况，及时补充，液面不能低于最高一层细胞冻存盒的位置。 2. 实验器具的清洗、消毒灭菌： 1) 反复使用的器皿应严格清洗干净，其清洗程序为：清水浸泡——去污剂刷洗

——清水冲洗——超声波洗涤——洗液浸泡（过夜）——充分冲洗（务必冲洗干净，不能残留洗液）——蒸馏水漂洗——烘干；若为新的玻璃器皿，要在刷洗后用5%的稀盐酸浸泡过夜。 *洗液：浓硫酸+重铬酸钾 2) 胶塞的清洗：清水浸泡——2%NaOH煮沸10—20分钟——冲洗——1%稀盐酸浸泡30分钟——充分冲洗——蒸馏水漂洗——烘干 3) 玻璃器皿，如玻璃吸管、离心管、玻璃培养瓶、套管等等以及胶塞，清洗后均可用高压蒸气灭菌，15磅灭菌30分钟。 4) 不能高压灭菌而又需反复使用的器具，如加样枪、多道枪的加样槽、塑料吸头等，应事先用70%的酒精擦洗，置于超净工作台中用紫外线照射2小时以上。 二、细胞培养用水、用液： 1. 胞培养必须使用玻璃蒸馏器制备的三次蒸馏水，二次蒸馏水或外购的金属蒸馏器制备的蒸馏水只能用来清洗器皿； 2. 平衡盐溶液（BSS）严格按照配方配制，含Ca++、Mg++离子的要避免其沉淀。可过滤灭菌或高压灭菌。采用高压灭菌时如含有葡萄糖等成份，应避免高压过度，一般8磅10分钟及即可。灭菌后的BSS于4℃冰箱中保存，如出现浑浊或沉淀时，应废弃，重新配制。 3. 培养液的配制，以配制1000ml RPMI1640为例： 1) 将RPMI1640干粉倒入约800ml三蒸水中，搅拌使其溶解； 2) 加入5.94g HEPES，在磁力搅拌器上搅拌约半小时； 3) 加入2g NaHCO3，继续搅拌约2小时； 4) 定容至1000ml；必要时用1N NaOH凋至PH7.0 5) 过滤除菌。滤纸由上到下为：普通定性滤纸、0.4μm滤膜、0.22μm滤膜；

细胞培养

实验二细胞传代培养 一、目的和要求 (1) 掌握贴壁细胞传代的培养方法； (2) 掌握细胞计数和存活率计算方法； (3) 培养建立无菌操作意识。 二、实验原理 细胞培养是培养连续细胞系或者离体正常组织或肿瘤细胞的技术。当离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止；若不及时分离、传代培养，细胞将逐渐衰老死亡。传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或其他比例转移，接种到其他培养瓶的培养。贴壁细胞的传代通常是用胰蛋白酶消化，把细胞分散成单细胞再传代；而悬浮生长的细胞则用直接法传代或离心法传代。 细胞计数是观察判别所培养细胞的状态的重要手段，也是细胞传代培养及判断实验处理对细胞的影响所必需的方法。细胞计数的结果一般用每毫升（液体培养）或每平方厘米（固体单层培养）的细胞数来表示。通常细胞计数是运用光学显微镜和血球计数板对细胞进行直接计数。图1为血球计数板一个计数区的示意图。血球计数板具有两个可以计数的区室，每个计数区由9个亚区构成，每个亚区的面积为1mm2，同时血球计数板上覆盖一个具有一定厚度的血盖片，保证计数区与盖片之间的距离为0.100mm。当盖片放置正确，每个亚区上的体积为0.1mm3即1×10-4mL。统计计数区中的4个角亚区中的平均细胞数（或中央亚区中的细胞数），记做N；若在准备过程中，对细胞的稀释倍数为D，则样品的细胞密度 4 N C个/mL。 =D ? 10 ? 图1 血球计数板构造示意图细胞膜是一层选择性通过的半透膜，当细胞膜完整时，某些染料无法进入细胞中。利用这一特性可以进行细胞存活检查。通常使用台盼蓝，活细胞无法被台盼蓝染色，而死细胞则会吸收染料被染色。 三、器材与药品 (1) 实验器材： CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压灭菌锅、水浴锅、离心机、血球计数 板、离心管、培养瓶、移液枪、微孔滤器等。 (2) 实验材料：

细胞培养复习题有答案

1.体外培养的细胞按生长方式可分为哪二种? 按细胞在体外生长的形态特征,可分为哪几种常见类型? ⑴按生长方式分为二型： 粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。 悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。（绝大多数有机体细胞属粘附型细胞。） ⑵可分四型：(1)上皮型细胞 (2)成纤维型细胞 (3)游走型细胞 (4)多形型细胞 2.简述体外培养细胞的整个生命活动过程的分期及每代贴附生长细胞的生长过程 ⑴通常，体外培养细胞的全部生命期大致可被分为以下三个阶段： ①原代培养期：也称初代培养，是指从机体中取出细胞接种培养到第一次传代之前的这一阶段。此期的细胞呈现出活跃移动的特点，可见细胞分裂，但不旺盛。处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很大的相似性。细胞群具有明显的异质性，细胞间的相互依存性强，在软琼脂培养基培养时细胞集落形成率很低。 ②．传代期：通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期，原代培养的细胞经传代后常被称做细胞系。一般情况下，正常体细胞在传代10-50次左右后，细胞分裂的能力就会逐渐减弱，甚至完全丧失，细胞便进入衰退期。 ③衰退期：处于衰退期的培养细胞，增殖速率已经变得很慢或不再增殖，直至最后衰退死亡。 以上特点，主要是针对体外培养的机体正常细胞，对于体外发生转化的细胞和肿瘤细胞而言，永生性或恶型性的获得使得这类细胞获得持久性的增殖能力，这样的细胞群体常被称为无限细胞系或连续细胞系。 ⑵每代贴附生长细胞的生长过程：①游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。时间：10分钟一4小时②贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。底物：玻璃、塑料、胶原、

细胞培养中常见的问题

细胞培养中常见的问题 2006-11-23 15:53 细胞中的颗粒到底是怎么回事？ 我的细胞总有颗粒，开始是细胞中有，后来细胞之间也好像有许多颗粒。好像是细胞碎片一样。是什么东西啊？是支原体污染吗？这可是我刚买回来的细胞啊! 我们实验室也有这种情况，是不是黑的小碎片，有人说是细胞代谢产物，后来拿到高倍镜下看还会动，就怀疑是污染了，也想问问大家到底是什么 是黑色的小碎片。我没注意到它会动，只是觉得不像是活的微生物。我觉得是由于某种污染或外界因素导致的细胞状态变差，裂解出的东西。但是，是什么东西不清楚。 的确很常见 在以前帖子见到说是“黑焦虫”。长时间培养的很容易出现，我根据自己的经验估计是一种污染，因为随着黑点增多，本来生长旺盛的细胞逐渐停滞甚至死亡。而且我后来原代培养的几批细胞并没有发现，我怀疑有好多细胞系本身就是污染的。不过增加换液次数的情况下，好象一般不太娇气的细胞生长不是很受影响。 以前听很有经验的老师说黑焦虫是国产血清的问题，可以有条件换进口血清试试，或者离心一下也可能能解决问题。那么所谓的“黑焦虫”到底是什么东西啊？有谁知道？ 我培养的细胞也出现过此中问题，放到高倍镜下看时有东西在动，但培养液不混浊，估计不是细菌污染，可能是血清问题，是支原体污染。 我培养的细胞也出现过这样的问题，我个人认为是一种支原体污染。国产血清是罪魁祸首，因为只要将细胞饥饿一下，不超过24小时，这种东西就会疯长 我培养的细胞也有出现这中情况。但是并不影响细胞生长。应该不是支原体污染 最近，我复苏细胞细胞的时候也发现过这样的东西，尽管我用的是GIBCO的FBS，后来，每天换液之前洗几遍后，就慢慢变少，现在没了 细胞培养的细菌污染 我们新建的细胞室。每周都会做清洁，用0。2%新洁尔灭消毒，照紫外。实验前也会照至少30分钟。培养基中加青霉素，链霉素。可是培养细胞时还是常有细菌污染，有时甚至分析不出原因。用培养瓶还好一点，用多孔板或平皿就更凄惨。我养的是哺乳动物细胞，不知各位有什么好的方法避免污染！谢谢！ 很可能是超净台无效了，，或者培养基？其实严格操作箱污染都难 我们是新的超净台，不可能失效。而且用同一瓶培养基，一瓶传两瓶，原始的一

常用的五种动物细胞培养方式

?一、半连续式培养 1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系 统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。 2.半连续式特点： ·培养物的体积逐步增加； ·可进行多次收获； ·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。 二、连续式培养 1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模 式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。

细胞培养的注意事项

相关疾病： 每天对待细胞比孝敬爹妈还用心，那真是捧在手里怕碎了，含在嘴里怕化了，看在眼里怕丢了，培养细胞时有哪些惨痛经验教训可以分享呢? 早走早脱身，从此专注黑生物 1. 严格无菌操作，多喷喷酒精，要是对灭菌的东西不放心，自己包自己送自己烘干。 2. 不要和别人共用试剂耗材，自己准备一套。 3. 有可能的话在拿到新细胞的时候做好支原体衣原体检测。 4. 水浴锅很脏，生化培养箱要是得手动加湿的话盘里的水也会很脏，勤换(灭菌水加进去)。 5. 晚上离开的时候最好给细胞房照紫外，超净台是用完就开。 6. 最好的是同一时间就你一个人在用细胞房在养细胞。 非科班出身经验分享 1. 别怕浪费。枪头什么的只要有可能污染就换，如果用酒精灯就什么都稍微烤一下，别直接放到火上，离一段距离。 2. 动作要既轻柔又有力。动作太重会有一堆一堆的气泡，动作太轻就吹不下来... 刚开始的时候吹细胞太痛苦了，稍微一下就起泡。后来就是吹的时候枪里的培养基不要一次全都压出来，留一点，枪的最头部尽量深的在液面以下。 3. 离开过操作台的东西再进操作台之前一定要用酒精喷一遍，包括一切实验耗材、仪器、以及你带着手套的手。 4. 实验结束后对实验台的消毒。紫外什么的，用前用后都照个30 分钟。 5. 身体的各个部分尽量的少接触不需要接触的地方的地方。比如实验台，又比如培养箱内部。 6. 细胞的密度根据细胞的性质、传代的时间以及自己的心情来定。培养基的话最多最多不要超过2 天就要换一次。细胞可以不传代，但是培养基是一定要换的。 大概就是，不该碰的地方不碰，有影响的地方少碰; 该使劲的时候绝对不含糊，不该使劲的地方一定忍住。如果是比较简陋的操作台就一定要摆个酒精灯，所有操作紧密围绕在酒精灯周围进行。如果是高级台子就多用酒精喷喷。感觉生物的实验，心疼钱就还是不要做了。 最后一点点绝对非科班的经验。癌细胞真是坚挺。有一次实在是不想传了，放了 5 天

细胞培养(hela, 293,239T等细胞的培养)

Hela细胞传代培养操作步骤 1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。观察时拧紧盖子。 2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。 3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。取小离心管一个，置于架子上。 4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。5．取待传代的细胞。打开versene，用酒精灯外焰烧。烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。 6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。在离心管中间部分将液体加入。吸液体和加液体时都不要对着细胞。7．打开胰酶，然后将versene弃掉。换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。 8．将细胞放入37度孵箱。放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。别忘了用旧培养基中和。 9．取细胞，镜下观察消化情况。消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。 10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。 11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。 12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。不要把枪伸到离心管内。 13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。镜下观察，摇匀，放入37度孵育。收超净台。 293T细胞 培养条件： 37℃，5% CO2，PH值7.2~7.4，无菌恒温培养。 细胞相关操作： 细胞复苏 1.37°C水浴预热培养基（DMEM+10% FBS）； 2.从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）； 3.在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min； 4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀； 5.置于37°C，5% CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话,瓶盖不要拧太紧)； 6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。

细胞培养基本方法

1.操作台基本要求： 2.随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20℃或-80℃冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。 3.细胞污染： （1）细菌污染

（2）酵母污染 （3）霉菌污染 初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。 （4）病毒污染 一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。 （5）支原体污染 唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE、PCR、免疫染色、放射自显影 4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出 5．适合贴壁的细胞和悬浮的细胞

6.基础培养基，减血清培养基，无血清培养基 7.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4； 成纤维细胞系适合轻度偏碱（pH7.4-7.7） Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长8.温度：大多数人和哺乳动物细胞系在36℃至37℃最佳 昆虫细胞在27℃为最佳 禽类细胞在38.5℃最佳 冷血动物（15℃-26℃） 9.动物细胞形态划分： ●成纤维细胞，贴附生长 ●上皮样细胞呈多角形，贴附 ●淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附 ●特殊形态： ?I型有长突触 ?Ⅱ型没有轴突 10.细胞增长模式

11.何时传代？ ●哺乳动物：生长的PH值通常表示乳酸储积，且有毒性，当PH迅速降低（） 0.1-0.2PH单位），同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。 ●昆虫细胞PH值会上升但不超过6.4 12．贴壁细胞的解离

细胞培养

一、复苏 1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。液体都融化后(大概1-1.5分钟)，拿出来喷点酒精放到超净工作台里。 2.把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中(用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来)，1000转离心5分钟。 3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。 培养箱中培 4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到37℃的5%CO 2 养，细胞贴壁后换培养基。 5.根据细胞增长速度2-3天换一次培养基。 二、传代 1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。 2.把原有培养基吸掉。（倒掉后用PBS洗两到三次） 3.加适当的胰蛋白酶(能覆盖细胞就行)，消化1-2分钟。 4.细胞都变圆后加入等体积的含血清的培养基终止消化。 5.用移液枪吹打细胞，让细胞悬浮起来。 6.把细胞吸到10ml或15ml的离心管中，1000转离心5分钟。 7.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。 8.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。继续培养。 三、冻存 把细胞消化下来并离心(同上)。用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。4℃30min，- 20℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。 冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。 注意事项： 1，把要用的所有东西放入超净台，喷酒精，紫外杀菌至少30min. 2，关紫外，通风，开灯，点燃酒精灯。 3，每一次进入超净台和培养箱都要喷酒精

细胞培养的基本原理与技术

第一章细胞培养的基本原理与技术现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。第一节体外培养的概念一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。 二、体内、外细胞的差异和分化

1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。 2、分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。第二节细胞培养的一般过程一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。 二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。

细胞培养的操作步骤

细胞培养的操作步骤 一、原代培养及其操作步骤 原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后，经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群，使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，生存、生长和繁殖。原代培养细胞常有不同的细胞成分，生长缓慢，但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征。利用原代细胞培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。其操作步骤如下。 1.剪切组织先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除黏附的结缔组织等非培养所需组织。再次清洗后，用手术刀将组织切成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。 2.消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。 3.培养细胞悬液用计数板进行细胞计数。用培养液将细胞数调整为（2～5）×105 cells／ml，或实验所需密度，分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。一般3～5d，原代培养细胞可以黏附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1／2的新培养液，继续培养2～3d后换液，一般7～14d可以长满瓶壁，进行传代。 4.注意事项 （1）无菌操作：细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般很难消除。 （2）培养液：所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。 （3）小牛血清：小牛血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增殖起着关键性作用。可选择多种不同批号的小牛血清进行小样分析。一旦确定某一厂家的某一批号小牛血清后，就保持应用至实验完成。 （4）胶原酶溶液：必须新鲜配制，贮存时间过长(即使是-20℃低温保存)，也将影响消化效力，导致消化时间过长，细胞损伤增加。

细胞培养

细胞培养基本操作 一，清洗和消毒 胶塞的清洗 新老胶塞的清洗 1.2%NaOH 煮沸10-20分钟 2.用水冲洗后，用1%HCl 浸泡30分钟。 3.自来水冲洗，蒸馏水洗2-3次 4.一般冲洗：用洗衣粉清洗，自来水冲10遍，再用蒸馏水冲3遍。 塑料器皿的清洗 1.2%NaOH浸泡 2.用1%HCl 浸泡30分钟 3.自来水冲10遍，再用蒸馏水冲3遍 玻璃器皿的清洗 1.用试管刷和洗衣粉刷干净瓶子，用自来水冲10遍，确保将洗衣粉冲干净。 2.凉干后浸泡进酸缸，时间不得少于6小时。 3.捞酸后，用自来水冲10遍，再用蒸馏水冲3遍，烤干。 手术器械的清洗 1.实验完成后，洗衣粉将其清洗一遍，凉干。 2.使用之前高温消毒或用75%的酒精浸泡。 高压锅的使用 培养基DMEM，胰酶的配制 DMEM的配制： 胰酶的配制：

抗生素的配制： 1.青霉素（80万单位/瓶）+无菌双蒸馏水2ml 2.链霉素（100万单位/瓶+无菌双蒸馏水2ml 将上述2ml的青霉素和2ml的链霉素混合在加入36ml的双蒸馏水配制成储备液。混匀，分装，-20O C 保存。 使用时，配制成0.5ml青-链霉素储备液/100ml培养基 3.庆大霉素8万单位/支×2支2ml/支×=4ml，加入无菌的双蒸馏水36ml配制成储备液。 -20O C保存，使用时，100ml培养基加1滴，终浓度为0.5-1ml/100ml培养基。 二，细胞培养 细胞株的传代培养法 1.吸去原来培养瓶中的培养基 2.PBS轻轻冲洗一遍，吸去。 3.用0.025%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化细胞，见细胞收缩后，吸去胰蛋白酶， 加入新的培养基终止消化 4.用吸管小心地吸取培养基反复吹打，分装在每一个培养瓶中。 内皮细胞原代培养方法： 1.在动物的颈动脉放血处死，无菌条件下分离主动脉； 2.清除动脉外壁的筋膜和脂肪，用PPS冲洗两次，沿正中剪开，内膜朝下切于已经滴 加少量0.1%胰酶和0.02%EDTA的培养皿中，20消化10min。用细胞挂子轻轻刮取内膜上的内皮细胞，置入加有RPMI-1460培养液（含20%小牛血清，2×105U/L青霉素和200mg/L链霉素）的培养瓶中。 3.置于培养箱内培养，约4-5天保长满整瓶，即进行传代。 细胞解冻方法 1、先准备37-39度温水； 2、从液氮罐中取出细胞，迅速放进水中，振摇至复温。

细胞培养的基本技术原理

第一章细胞培养的基本原理与技术 现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以 CHO 细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。 第一节体外培养的概念 一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体或其寄生体取出，放在类似于 体生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。 ●组织培养：是指从生物体取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。 ●细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。 ●器官培养：是指从生物体取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。 二、体、外细胞的差异和分化 1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体细胞相同的基本结构和功能，也有一些

细胞培养的过程及注意事项

细胞的培养过程及注意事项 根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细胞培养分为原代培养和传代培养。 一、原代培养 （一）过程 原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种及培养等步骤。原代培养的方法很多，基本和最常用的是组织块培养法和分离细胞法。 1、组织块培养法 (1)基本操作过程 1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪将附在其上的脂肪和结缔组织去除干净。再用平衡液（PBS）或Hanks液漂洗；用锋利的眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS 或Hanks液漂洗多次，直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。 2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养瓶皿中，并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上，量不要过多，要将组织块切面贴在培养瓶底壁上； 3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一侧的对侧面加足培养液，勿使组织块与培养液接触，塞紧瓶塞； 4）、将种植了组织块的一侧朝上，静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1h到3h后翻瓶，使贴壁的组织块浸没与培养液中，静置； 5）、每隔2到3天更换一次培养液，或者根据培养瓶种颜色的变化确定换液时间。 2、注意事项 1）、组织块接种后的前3天，从组织块向外迁徙的细胞数很少，组织块的黏附不牢固，在观察和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。要避免经常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。 2）、加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。 3）、用组织块培养时，要及时观察，当细胞向外迁徙出来后要注意记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，因为已漂浮的组织块和那些细胞碎片已经死亡，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长，要及时清除。

细胞培养的常用术语及解释

细胞培养的常用术语及解释体外培养(in virto)：原意为在试管中，现常与组织培养一词通用，译为体外培养。 组织培养(tissue culture)：维持组织在体外生长、与泛指体外培养。 器官培养(organ culture)：在体外维持器官、器官的部分或器官的原基生存和生长的方法。 * 细胞培养(cell culture)：细胞（包括单个细胞）在体外条件下的生长称为细胞培养，在细胞培养中，细胞不再形成组织。 细胞融合(cell fusion)：两个独立的细胞融合成一个细胞。可用聚乙二醇（PEG）或仙台病毒诱发。 * 细胞杂交(cell hybridization)：两个或多个不同的细胞融合。导致一个含核体（aynkaryon）的形成。 体外培养转化(in vitro transformation)：细胞在体外培养中发生与原细胞遗传性状不同的变化，但不一定具有致癌性。 单倍体(haploid)：正常细胞染色体基本数（每一染色体只有一种）。 整倍体(euploid)：具有两个以上单倍体数目的细胞。 非整倍体(aneuploid)：细胞核内染色体数为单倍染色体数的非整倍数时，称非整倍体。 二倍体(diploid)：具有两套染色单体数目的细胞（2n） * 原代培养(primary culure)：从体内取出细胞或组织的第一次培养。 再培养(subculture)：同传代。 * 传代(passage)：无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到

另一个培养瓶即称为传代或传代培养。也称再培养。 单层培养(monolayer culture)：培养细胞在底物上长成单层。 悬浮培养(suspension culture)：细胞在培养液中呈悬浮状态生长。 * 贴壁依赖性(anchorage-dependent)：为细胞需贴附于底物或支持物上才能生长的性质。 贴壁依赖性细胞(anchorage dependent cell)：由它们繁衍出来的细胞（或培养物）只有贴附于不起化学作用的物体（如玻璃或塑料等无活物体）的表面时，才能生长，生存或维持其功能。 无贴壁性(anchorage-independent)：不依赖于贴附底物或支持物上生长的性质。 汇合(confluent)：细胞相互连接成片占据所有底物面积。 近汇合(sub-confluent)：细胞在底物上生长接近，但尚未完全汇合。 超汇合(super confluent)：单层培养细胞附在底物上生长，汇合后发展成多层状态。 接触抑制(contact inhibition)：细胞汇合相互接触后失去运动的现象。 密度抑制(density inhibition)：细胞数量到一定数量后引起抑制增殖的现象。 群体密度(population density)：培养底物单位面积上单层细胞数目。 饱和密度（saturation density）：在特殊培养条件下，每平方厘米（单层培养）或每毫升细胞悬浮液内可达到的最大细胞数。

细胞培养

AEP对LPS诱导的Raw264.7细胞炎症模型抗炎实验 一、试剂与仪器 （一）细胞系 RAW264.7。 （二）试剂 胎牛血清 DMEM HyClone，美国 10000 U/mL 青霉素/链霉素Gibco，美国 DMSO Sigma，美国 lipopolsaccharide Sigma，美国 甲基四唑蓝(MTT) Sigma，美国 对氨基苯磺酸Sigma，美国 N-α-萘乙二胺Sigma，美国 （三）仪器 超净台 酶标仪 CO2恒温细胞培养箱 显微镜 离心机 （四）供试品配置 LPS 溶液配置：称取LPS 粉末5 mg，溶于1 mL DMSO 中，得5 mg/mL 母液。用时将母液用培养基稀释至 2 μg/mL（DMSO＜0.1%）。 MTT 溶液配置：称取MTT 50 mg，溶于10 mL PBS 中，避光震荡30 min。 0.22μm 滤膜过滤除菌，分装于避光EP 管中，4℃保存，备用。 Griess试剂配置：A 液：对氨基苯磺酸0.5 g，溶于稀醋酸（10%）150 mL 中，浓度1%。B 液：N-α-萘乙二胺0.1 g 用纯净水20 mL 溶解，再用醋酸（10%）稀释至150 mL，浓度0.1%。临用前分别加入50 μLA液和50 μL B 液，避光显色30 min。

待测化合物：AEP1，AEP2，AEP3，称取化合物固体5-10 mg，用DMSO 溶解成50 mg/mL 母液。用前用培养基稀释至所测浓度。 二、实验方法 （一）细胞培养 RAW264.7细胞用含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素/链霉素的DMEM 培养基于37℃，5% CO2条件下培养。RAW264.7 细胞培养2-3 天或者长至70-80%左右时进行传代，弃去培养瓶中旧培养基，加入新鲜培养基，拧紧盖子后轻拍培养瓶底部再用吸管反复吹打，将细胞吹匀后进行传代。 （二）细胞毒性实验 取长至70%-80%的RAW264.7 细胞，用滴管吹成单细胞悬液，加入含10% FBS DMEM 培养基，调整细胞浓度为1×105cell/mL，接种至96 孔板中，100 μL/孔，每组6 个复孔，37℃和5% CO2培养过夜。除去旧液，除空白组外其他组给予相应浓度的含药培养基，培养24 小时。实验结束前 4 小时，除去上清，加入150 μL无血清DMEM 培养基和20 μL MTT (5 mg/mL)，37℃和5% CO2培养4 小时。4 小时后用注射器轻轻吸去上清，加入150 μL DMSO，漩涡震荡15 min，540 nm 下用酶标仪测各孔吸光度（OD）值，重复3 次。 （三）化合物对LPS 刺激RAW264.7 细胞TNF-α生成的影响 取长至70%-80%的RAW264.7 细胞，拍打培养瓶背面，吹成单细胞悬液，加入含10% FBS DMEM 培养基调整细胞浓度为5×105cell/mL，接种于24 孔板中，每孔1 mL，37℃5% CO2培养过夜。吸去上清，除空白组外其余加入 1 mL 含2 μg/mL LPS的DMEM 培养基，37℃5% CO2孵育 2 小时后，空白组和LPS 模型组加入1 mLDMEM培养基，其他加入1 mL 含各浓度药物的DMEM 培养基。37℃5% CO2孵育24 小时。培养结束后取上清用PBS 稀释20 倍，用ELSA 试剂盒测按说明书操作测上清中TNF-α含量。 （四）化合物对LPS 刺激RAW264.7 细胞IL-2生成的影响 取长至70%-80%的RAW264.7 细胞，拍打培养瓶背面，吹成单细胞悬液，加入含10% FBS DMEM 培养基调整细胞浓度为5×105cell/mL，接种于24 孔板中，每孔1 mL，37℃5% CO2培养过夜。吸去上清，除空白组外其余加入 1 mL 含2 μg/mL LPS的DMEM 培养基，37℃5% CO2孵育 2 小时后，空白组和

细胞培养技巧

细胞培养技巧 铺板： 1、一般96孔板每孔加100μl细胞悬液，从孔的左边靠近底部加入，加完半边板后，将未加的细胞悬液混匀一下再继续加剩余的半边板子，都加完后盖上盖子，左手轻轻扶住板的左边，右手轻轻敲击板的右边缘，注意把握力度（一般轻敲三下），太强或次数太多会导致细胞集中成堆，将板顺时针旋转（逆时针效果不好），依次敲击剩余三个边，静置5min左右，放入37℃培养箱。 2、6孔板、12孔板或24孔板，均采用浸润孔底的方法。在第一个孔加入少量无血清培养基，晃动浸润整个孔底，然后用移液枪吸至第二孔，同样方法浸润孔底，其它孔依次类推，这样整个孔底都是湿润的，细胞悬液会平铺在整个孔底，加细胞悬液的时候可以避免加在中间而中间细胞多，加在周边晃匀后周边细胞多中间少的现象，细胞分散较均匀，注意加完细胞悬液后要放工作台静置一下（在工作台上放置20-30min，细胞不差这一会温度和二氧化碳的，等细胞贴壁和孔板的底部有些附着了，轻轻移入到孵箱中）。振荡也可以采用轻拍的方式，但力度没有96孔板好掌握，效果没有96孔板好，所以推荐使用浸润孔底的方法。 3、细胞悬液加完后，将细胞培养板抬高，对着灯光，从底部往上看，看细胞有没有成团。然后从底部敲击，使之分散。 4、如果实验室有平板振荡器，建议使用这个仪器稍振荡一下，效

果会不错（振幅小，频率高）。 5、细胞要尽量吹散，大部分呈单个状态。离心后，要充分悬浮！还有，转移到孔板后要晃一下！晃的时候最好不要让细胞液转圈，不然细胞就全被带到中间去了，就会不均匀！ 5、一瓶细胞长满后（均匀铺满一层），正常处理，在培养瓶里吹匀，然后铺6孔板，每孔2毫升，铺完之后不用观察直接用酒精棉擦拭，然后放到培养箱里，轻微的左三圈右三圈前三圈后三圈。基本上24小时之后观察每孔的细胞都会很均匀。 6、计算好所需要的全部液体量和细胞量，混匀后，加到六孔板里，六孔板按横8字型晃，显微镜下观察，如果不均匀，按上述方法再晃。如果细胞未计数直接接种的话，在种六孔板的过程中，随时晃一下混匀用的瓶子，瓶子我通常是顺时针或逆时针转圈。 7、放在水平板面上先上下移动，再左右移动，每个方向５到６次，但关键的是摇完后最好直接放入培养箱中，不要再做过多的运动，例如放到镜下去看，否则很容易就又聚到中间去了。 注： 1. 悬浮离心后的细胞团时，先不要把所有液体都加进去！一般先加2mL液体，然后用1mL移液器“轻轻”将细胞吹起，细胞像云雾一样散开，这样易于形成单细胞。 2. 离心收集细胞一般用低转速离心，250g（1000rpm/min），5min