抗体

摘要

和哺乳动物的免疫球蛋白比较，就现实而言鸡的免疫球蛋白更有优势。这个研究中，两个质粒被构建用来来自一个鸡的杂交体重组鸡免疫球蛋白的表达。首先是轻链的表达，和在羧基末端用组氨酸标记的重链的表达。在重组体鸡免疫球蛋白基因转染到中华仓鼠卵巢细胞之后，就可以选择出一个可分泌特定抗体指定的HF33的转染体。HF33细胞能以每天每106个细胞产生

10~15mg的带有组氨酸标记的免疫球蛋白。在Western免疫印迹分析中，重组的免疫球蛋白由于一条H链的条带和两条L链的条带而被检测到。这个重组免疫球蛋白在一个利用？？步骤中被成功的纯化。这些结果显示，目前的重组鸡卵黄抗体对进一步的应用是有作用的。

2005，国际生物组织，由Elsevier Ltd 出版。

关键词：重组抗体；鸡；免疫球蛋白Y，CHO

1.引言

鸡卵黄抗体在各种免疫反应中更有于哺乳动物的免疫球蛋白，因为它不和蛋白A，蛋白G以及类风湿因子反应。进一步讲，它不激活哺乳动物的免疫系统，这个免疫系统可以在酶联免疫吸附试验中对减少血清标本干扰酶的方面更突出。免疫球蛋白Y抗体已被证明在诊断、异种移植和抗生素替代疗法等应用中更有优势。我们最近利用细胞融合技术和噬菌体表面表达技术生产出大量的可以识别阮病毒的鸡单克隆抗体，我们还生产出chickenehuman嵌合抗体。尽管单克隆抗体的使用导致了广泛的研究领域的巨大进展，杂交鸡抗体生产水平相对较低。这样的生产水平低，适合实验室使用，但严重地限制了鸡单克隆抗体的潜在的工业应用。保守的哺乳动物分子已知少通常用于immuni - zation用于哺乳动物的免疫原性。另一方面，鸡在对于这些蛋白的特异性抗体的发展是有益的，因为它位于不同于哺乳动物进化树的分枝，有更高的抗体生产潜力。例如，在不使用朊蛋白基因敲除的小鼠时，很难产生对哺乳动物朊蛋白单克隆抗体分子，因为在哺乳动物朊蛋白的氨基酸序列同源性超过84％。一步纯化鸡卵黄抗体是不容易的，因为鸡卵黄蛋白抗体并不和蛋白A或蛋白G结合，和哺乳动物免疫球蛋白比较，它在酸性或碱性条件下更敏感。在简化纯化和增加免疫球蛋白产量努力中，我们尝试用组氨酸标记来构建两个质粒以表达重组鸡卵黄抗体。用镍亲和层析柱可一步纯化的重组免疫球蛋白，产生于培养的哺乳动物细胞。在这里，我们显示了重组鸡卵黄抗体的作用。

2.材料和方法

2.1.细胞和介质

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞于37摄氏度5%的二氧化氮下保存在含有10％胎牛血清的F12 介质中。鸡杂交瘤细胞，HUC2 - 13 [11]，它可以产生特定朊蛋白抗体，在38.5摄氏度5%的二氧化碳下保存于在Iscove的修订贝科的含10％胎牛血清介质中。

2.2.cDNA的合成

根据制造商的指示，使用Isogen- LS型（日本大学，日本）协议，总RNA是从HUC2 - 13杂交瘤细胞中提取的。cDNA的第一条链是用12-18个寡聚T的引物来合成的。

2.3.轻链基因的克隆

编码鸡卵黄球蛋白抗体轻链的DNA片段可用KOD DNA聚合酶通过PCR扩增，使用

HUC2-VLF3(5#-A TA TA TAAGCTTGCCA TGGCCTGGGCTCCTCTCCT-3#)和

HUC2-VLR1(5#-TCTCTAGA TTAGCACTCGGACCTCTTCAG-3#)作为引物，以合成大小的cDNA 作为模板。这些引物包含有HindIII and XbaI的限制性酶切位点，可以退火到头部的氨基末端区域和位于IgY轻链基因的C1的羧基末端区域。扩增的PCR片段可以被HindIII and XbaI 处理，然后插入到pBluescript II SK相同的位点。这些克隆片段的序列就可以根据已知的HUC2-VLF3和种系的序列确定出。这些轻链基因片段再次用HindIII and XbaI处理，然后连接到位于表达载体的人居细胞病毒下游的相同位点上。这些表达蛋白既没有组氨酸标记，也没有myc基因表位，因为PCR 片段包含有一个终止密码子。

2.4.重链基因的克隆

编码重组IgY重链的DNA片段可以用Taq DNA聚合酶的PCR产生，在GC buffer中使用

HUC2-HF4(5#-TTGGTACCACCA TGAGCCCACTCGTCTCC-3#)and

HUC2-HR4(5#-TTACCGGTTTTACCAGCCTGTTTCTGCAG-3#)作为引物。这些引物包含有KpnI or PinAI的限制性酶切位点，可以退火到头部的氨基末端区域和位于IgY重链基因的羧基末端区域。每个基因扩增片段利用QIA快速纯化试剂盒通过琼脂糖凝胶回收并且通过KOD DNA聚合酶的PCR再次扩增。这些片段用ＫｐｎＩ处理，然后插入到具有KpnI and HincII 位点的pBluescript II SK，这些序列就被确定为轻链。这些来自质粒的基因片段再次用KpnI and PinAI处理然后连接到pcDNA4/myc-His A表达载体启动子下方的相同位点。

2.6.ELISA

ELISA法进行如前所述。过氧化物酶标记羊抗鸡lgG，或碱性磷酸酶标记羊抗鸡IgG中被用于检测。Supernatant从106跨fectant后收集细胞培养24用于H遭到to170吨。岛本等/生物制品33 169e174ELISA，以确定重组IgY.A小鼠单克隆抗体针对H链鸡卵黄抗体的生产水平被用于捕捉和碱性磷酸酶标记的羊抗鸡轻链抗体的检测。纯化鸡卵黄免疫球蛋白是作为标准。

2.7.Western blotting

杂交鸡软抗体的检测进行如前。在过氧化物酶标记的抗鸡IgG - Fab片段是用于开发的反应，并加ECL。南松-荧光信号，然后分析了使用荧-nescent图像分析仪。西方的朊蛋白检测杂交进行如前所述。简言之，用%10正常鼠脑组织匀浆分离12.5的SDS-PAGE.膜转让和阮病毒检测人进行的方式一样，对转染或HUC2培养上清-13被用来作为第一抗体和酶标记，？nity纯化阳抗lgG用作第二抗体

2.8青霉菌的治疗

稳定的（HF33，4 × 105个细胞）转染细胞培养24 h.在细胞用PBS后，洗涤液中加入不同浓度（0,1,3,10毫克/毫升的衣霉素）（1抑制剂的N -糖基重刑）（和光，日本）的补充试剂.分离上清，然后收集，24 h后，用收集西方的鸡免疫印迹检测链。

2.9提纯重组免疫球蛋白

稳定转染细胞在F12培养液无血清培养的含10％FBS.同一液体被用来洗细胞，和细胞培养四天血清培养基收集培养上清，并通过膜过滤，以去除死皮细胞.上清，然后与ProBond树脂纯化布相平衡，混合（50毫米的钠，磷，pH值7.5,0.5 M氯化钠）。树脂被冲走了净化液物，其次是净化液含10毫米咪唑。重新用组合IGY是洗脱净化，载有200毫米洗脱抗体的一小部分咪唑.为洗脱抗体的纯度在非还原条件下进行了分析部分10%的SDS-PAGE凝胶。为了探讨的L和H链分开，用B -巯基乙醇处理样品.蛋白质沾满考马斯亮蓝。

3结果

3.1制粒的构建

总的杂交瘤细胞（HUC2 - 13）RNA的分离和鸡抗体cDNA进行PCR扩增由反转录后获得。扩增的基因含有的L和H链，分为VL，VH，每断在不同的区域.因为在L和H链可变区基因，从cDNA序列扩增开始，他们并没有包含内含子.后在序列证实，用DNA的L和H链片段到pcDNA3/myc-his和pcDNA4/myc-his插入（指定pcCKL1和pcCKH1，分别）。在L链基因，myc基因表位和他的标签是在pcDNA3/myc-his没有翻译，因为他们所在的停止密码子.在另一方面下游，为H链基因，myc基因表位基因被删除，因此只有他的标签是翻译。

3.2鸡抗体在CHO细胞中的表达

CHO细胞共转与pcCKH1和pcCKL1作为描述材料和方法.未稳定转染与遗传学霉素和Zeocin.克隆抵抗两种药物是由特定的免疫选择以特定生产的稳定转染克隆上清.一具体球蛋白被指定HF33.这特定测试的抗体生产各级ELISA在HF的recombi-楠球蛋白是在大约10至15 mg/106 cells/24 h.这种生产比出现在较高的生产水平的杂交瘤细胞HUC2-13生产不到1mg/106cells/24每小时要高很多

3.3抗体纯化重组

重组免疫球蛋白使用镍树脂分离纯化得到的超级natants血清的HF33.IgY自由的遗传，主要是由于200毫米咪唑洗脱。与布洗脱的分数？用含200毫米咪唑分析10％的SDS - PAGE。在非还原条件下，球蛋白样品，分为两个频段，在约250 kDa和主要带一小乐队约150 kDa的，相应的完整的半分子，分别为，还原的条件下，1 H链和两个L链检测。这些结果表明重组免疫

球蛋白的纯化可以在下一个步骤使用镍树脂。

4.讨论

鸡卵黄抗体不激活人类补体系统，也不与类风湿因子，蛋白A，蛋白G或其他任何免疫球蛋白反应，这消除了假阳性结果和人抗鼠抗体反映.除此外，动物的反应，因为avianhost抗原系统发育，从哺乳动物来源的细胞，对高度保守的哺乳动物蛋白的活性禽流感抗体可以产生反应.通过融合细胞系的研究已经开发生产鸡杂交瘤。抗体杂交瘤细胞生产的鸡一般个体小.此外，纯化鸡卵黄抗体是，因为它不与蛋白A或G反映约束进一步纯化和大鸡卵黄抗体规模化生产，我们试图在CHO 细胞.重组表达鸡卵黄抗体IgY的提纯容易可以在一个加强与镍1？nity树脂，并作为一个主要的单频（250 kDa的在考马斯亮蓝）染色检测凝胶。此外，重组免疫球蛋白是在大约10-15 mg/106cells/24 ?生产在稳定的跨fectant，是HF33 HF33.IgY生产水平的10倍以上的杂交瘤细胞HUC2高出13.可以进一步改善甲氨蝶呤的依赖的DHFR基因扩增能力。关于多样化抗体在鸡nism，在对比的是哺乳动物的基因转化率，而不是单一功能V,J和D 段. 这使得一个放大的每个L和H链的引物抗体的可变区基因. 因此，所有的鸡卵黄抗体基因的扩增，可以使用本文章.此外，VL和VH使用噬菌体克隆可变区区域都通过转化为L和H鸡卵黄抗体链的表达质粒的区域插入描述引物,当重组抗体在使用印迹法，检测灵敏度高于与噬菌体事显示抗体，鸡卵黄抗体可被视为在实验室研究的多用途工具，本研究可以进一步的应用于医疗等领域使用的免疫球蛋白，如诊断技术。

western内参GAPDH

刚开始接触western，看了很多和内参有关的资料，越来越迷惑。 请教园子里的高手：1 内参的主要作用是什么，是必须的吗? 2 内参是和样品一起加，还是单独加，抗体孵育时是分着加，还是一起，条件一致吗？3 单是证明是否样品中存在某蛋白，不用内参可以吗？ 请赐教！ 1、在实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确；或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的 操作误差；这些误差需要通过测定每个样品中实际转到膜上的GAPDH 的含量来进行校正，所以一般的western实验都需要进行内参设置。具体校正的方法就是将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH 含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量。然后才进行样品与样品之间的比较。 所以有时候要用内参 2、和一抗一起加，按照内参的比例加 3、可以不用加内参 1.内参是样品中本身就有的，有其一定的分子量。一抗.二抗时得分开孵育。 2.只是定性的话不需要加内参 Western Blot除了能证明某样品中含有某种蛋白之外，其最为重要的作用是比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少。即为蛋白表达水平最直接的证据。 要衡量蛋白的表达水平，前提条件就是等量的上样量。内参的意义就是保证上样量的一致。内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。如果内参的条带亮度基本一致，那么就可以认为上样量也基本一致。 常用的蛋白质内参有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。最近发现tubulin的表达水平比其它看家基因更加恒定。因此人们越来越多的使用tubulin做为内参。 在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有： 一、超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。 二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。 三、（也是我们实验室用的方法）当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。 很感谢大家的帮助，现在总算明白了一些

抗体是什么

如对您有帮助，可购买打赏，谢谢 常识分享，对您有帮助可购买打赏抗体是什么 导语：抗体又称为免疫球蛋白也是由一种细胞分裂系统的，以及综合带来的一些细菌以及病毒的一些大分子的蛋白质，同时的发现主要是在人体的血液以及 抗体又称为免疫球蛋白也是由一种细胞分裂系统的，以及综合带来的一些细菌以及病毒的一些大分子的蛋白质，同时的发现主要是在人体的血液以及体液中，主要是细胞膜的表面抗体的主要是指机体的免疫能力，在抗原的刺激下有一些淋巴细胞或者是继续包增殖分化的，不同的免疫球蛋白产生的抗体也是各不相同的。 抗体也分布于组织液或者组织细胞，在日常生活中的主要是特异性的结合抗原以及一些激活酶的相互结合，调理作用就抗原抗体相结合不同的细胞，比如胎盘抗体通过胎盘进行保护免疫人体的功能。 抗体(antibody)指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中。 自身抗体是指针对自身组织，器官、细胞及细胞成分的抗体。人体的生长、发育和生存有完整的自身免疫耐受机制的维持，正常的免疫反应有保护性防御作用，即对自身组织、成分不发生反应。—旦自身耐受的完整性遭到破坏，则机体视自身组织、成分为“异物”，而发生自身免疫反应，产生自身抗体。正常人体血液中可以有低滴度的自身抗体，但不会发生疾病，但如果自身抗体的滴度超过某—水平，就可能对身体产生损伤，诱发疾病。 免疫球蛋白(immunoglobulim，Ig)是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。免疫球蛋白普遍存在于哺乳动物和人类的血液、组织液和外分泌中。人体的免疫球蛋白主要有五类：IgM、IgA、IgG、IgD、

抗体的制备方法与原理

抗体的制备方法与原理－单克隆抗体的制备 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。 表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较 单克隆抗体的制备方法如下。 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。

2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～ 1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。 ②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。

动物母源抗体与免疫程序精编版

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动物母源抗体与免疫程序 朱瑞良牛钟相崔治中赵宏坤（山东农业大动物科技学院 271018） 1 动物母源抗体 母源抗体的概念： 通过胎盘、初乳或卵(禽类)从母体所获得的抗体称为母源抗体。由于母源抗体的存在，幼小动物或婴幼儿对某些疾病具有较强的抵抗力，例如新生仔猪在二三个月内对猪丹毒杆菌，新生羔羊对布氏杆菌具有较强的不感受性，关键在于获得了母源抗体。母源抗体不仅在抗病免疫中具有重要意义，而且对疫苗接种后机体的免疫应答也有严重干扰，因而对免疫程序有巨大影响，应当引起注意。 母源抗体的转移途径： 母源抗体从母体到达胎儿的途径，取决于胎盘屏障结构的组成。人和其他灵长类动物的胎盘是血绒毛膜性的，也就是母体血液直接和滋养层相接触。这种类型的胎盘允许IgG通过，而不允许IgM、IgA和IgE转移到胎儿。母体的IgG可以经胎盘进入胎儿的血液循环，所以从母乳获得少量IgG(5～10%)，但大部分是从母体中获取。反刍兽的胎盘呈结缔组织绒毛膜型，胎儿与母体之间组织层次为5层，而马、驴和猪的胎盘则为上皮绒毛膜型，胎儿与母体之间的组织层次为6层，具有这两种胎盘的动物，免疫球蛋白分子通过胎盘的通路全被阻断，母源抗体必须从初乳获得。犬和猫的胎盘是内皮绒毛膜性的，胎儿与母体之间组织层次为4层，这些动物能从母体获得少量IgG，大量抗体也来自初乳。禽类的抗体可以经卵传给下一代，产卵前一周，母鸡的抗体通过卵胞膜进入卵黄，因此产卵时抗体(IgG)在卵黄内。鸡卵孵化的第4天，抗体转移到卵白内，12-14天抗体在鸡胚中出现。出壳后的3-5天内，继续从残余的卵黄中吸收剩余的抗体，因此母源抗体滴度的高峰在出壳后的第三天左右。 未吃奶的新生动物正常血清中只含极低水平的免疫球蛋白。成功地吸收了初乳免疫球蛋白的动物，立即得到免疫球蛋白供应，尤其是IgG，使其接近于

Western Blotting中使用内参

要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定*分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳*啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活*的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定*的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小），空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照），已知量标准产物的正对照；另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。 内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。 内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确*。 在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限*，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比*。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western blotting 实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。 在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。 实验结果分析其实很简单：如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分，可以先检测内参，观测样品间内参显色条带是否一致，根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验，至内参量一致为止；若内参一致，即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。这样虽然麻烦一点，但是可以保证结果更有说服力，更可信。毕竟我们的实验是一种严谨的工作。

内参基因βActin简介

内参基因βA c t i n简介标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]

内参基因β-Actin简介 日期：2012-05-03来源：未知作者：周慕云点击：次 β-Actin 内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。常用的PCR内参有GAPDH 、β- actin 、18sRNA、28sRNA 、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1、ARBP内参基因等。 β-Actin简介 Actin即“肌动蛋白”，是细胞的一种重要骨架蛋白。同时Actin在细胞分泌、吞噬、移动、胞质流动和胞质分离等过程中起重要作用。Actin在不同物种之间高度保守，以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括α-skeletal muscle actin，α-cardiac muscle actin，α-smooth muscle actin，和γ-smooth muscle actin; 其余两种广泛分布于各种组织中，包括β-actin(β-non-muscle)和γ-non-muscle actin。不同的actin之间同源性大于90%，但在N-terminal同源性仅50%-60%，因此N-terminal常被用作actin的抗原。β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。具有收缩功能，分布广泛。 β-Actin用途 β-Actin是PCR常用的内参，β-Actin抗体是Western Blot很好的内参指数。内参即是内部参照(Internal Control)，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。常用的蛋白质内参有细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin和GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)等。因此β-Actin

(整理)常用免疫学检查参考值

常用免疫学检查参考值 血清免疫球蛋白分类Ig通常是指具有抗体活性和（或）抗体样结构的球蛋白。 应用免疫电泳与超速离心分析可将Ig分5类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。 IgG：含量最多或最主要的Ig（75%），唯一能够通过胎盘的Ig。主要由脾脏和淋巴结中的浆细胞合成与分泌。 IgA：约占10%，SIgA在局部免疫中起重要作用。主要由肠系淋巴组织中的浆细胞产生。 血清免疫球蛋白 IgM：分子量最大，由5个IgM单体通过J链连接。是最早出现的Ig，是抗原刺激后最早出现的抗体，其杀菌、溶菌、溶血、促吞噬以及凝集作用比IgG高500-1000倍。 测定方法：单向免疫扩散法（RID）或免疫比浊法。 血清免疫球蛋白测定参考值 参考值：IgG：7.6-16.6g/L （RID法）IgA：710-3350mg/L IgM ：0.48-2.12 g/L 临床意义 免疫球蛋白增高 多克隆增高:常见于各种慢性感染、慢性肝病、肝硬化、淋巴瘤和某些自身免疫性疾病，如SLE、类风湿关节炎等。 单克隆增高:主要见于免疫增殖性疾病，如多发性骨隋瘤、原发性巨球蛋白血症等。 免疫球蛋白降低：常见于各类先天性免疫缺陷病、获得性免疫缺陷病、联合免疫缺陷病及长期使用免疫抑制剂的病人。 血清IgD测定 免疫扩散法：0-62mg/L 已发现有些抗核抗体、抗基底膜抗体、抗甲状腺抗体和抗“O”抗体等均属IgD，但活性甚低。 血清IgE：主要由鼻咽部、支气管、胃肠道等粘膜固有层的浆细胞分泌，为亲细胞抗体，能与肥大细胞、嗜碱性粒细胞膜上的FceR结合，产生I型变态反应。 ELASA：0.1-0.9mg/L 临床意义： 1. I型变态反应 2. IgE型骨髓瘤、寄生虫感染等 3. 慢性肝炎、SLE、类风湿性关节炎等。 血清M蛋白测定（M protein，monoclonal immunoglobulins）是一种单克隆B淋巴细胞异常增殖时产生的IgG分子或片段，一般不具有抗体活性。 参考值：蛋白电泳法，免疫电泳法：阴性 意义：1.多发性骨髓瘤（MM），占35%-65%，其中IgG型占60%左右；IgA型占20%左右；轻链型占15%左右；IgD、IgE型罕见。2.巨球蛋白血症。3.重链病（HCDs）。4.半分子病。5.恶性淋巴瘤。6.良性M蛋白血症。 血清补体测定 补体是具有酶活性的一种不耐热球蛋白，分3组：9种补体成分（C1-C9）；B、D、P、H、I 因子；补体调节蛋白，如C1抑制物、C4结合蛋白、促衰变因子等。 总补体溶血活性（CH50）测定 参考值试管法：50000-100000U/L 意义：增高见于急性炎症、急性组织损伤、恶性肿瘤及妊娠。降低见于急性肾小球肾炎、自身免疫性疾病、亚急性感染性心内膜炎、慢性肝病、肝硬化、AIDS、严重烧伤等。

动物母源抗体与免疫程序修订稿

动物母源抗体与免疫程 序 WEIHUA system office room 【WEIHUA 16H-WEIHUA WEIHUA8Q8-

动物母源抗体与免疫程序 朱瑞良牛钟相崔治中赵宏坤（山东农业大动物科技学院 271018） 1 动物母源抗体 母源抗体的概念： 通过胎盘、初乳或卵(禽类)从母体所获得的抗体称为母源抗体。由于母源抗体的存在，幼小动物或婴幼儿对某些疾病具有较强的抵抗力，例如新生仔猪在二三个月内对猪丹毒杆菌，新生羔羊对布氏杆菌具有较强的不感受性，关键在于获得了母源抗体。母源抗体不仅在抗病免疫中具有重要意义，而且对疫苗接种后机体的免疫应答也有严重干扰，因而对免疫程序有巨大影响，应当引起注意。 母源抗体的转移途径： 母源抗体从母体到达胎儿的途径，取决于胎盘屏障结构的组成。人和其他灵长类动物的胎盘是血绒毛膜性的，也就是母体血液直接和滋养层相接触。这种类型的胎盘允许IgG通过，而不允许IgM、IgA和IgE转移到胎儿。母体的IgG可以经胎盘进入胎儿的血液循环，所以从母乳获得少量IgG(5～10%)，但大部分是从母体中获取。反刍兽的胎盘呈结缔组织绒毛膜型，胎儿与母体之间组织层次为5层，而马、驴和猪的胎盘则为上皮绒毛膜型，胎儿与母体之间的组织层次为6层，具有这两种胎盘的动物，免疫球蛋白分子通过胎盘的通路全被阻断，母源抗体必须从初乳获得。犬和猫的胎盘是内皮绒毛膜性的，胎儿与母体之间组织层次为4层，这些动物能从母体获得少量IgG，大量抗体也来自初

乳。禽类的抗体可以经卵传给下一代，产卵前一周，母鸡的抗体通过卵胞膜进入卵黄，因此产卵时抗体(IgG)在卵黄内。鸡卵孵化的第4天，抗体转移到卵白内，12-14天抗体在鸡胚中出现。出壳后的3-5天内，继续从残余的卵黄中吸收剩余的抗体，因此母源抗体滴度的高峰在出壳后的第三天左右。 未吃奶的新生动物正常血清中只含极低水平的免疫球蛋白。成功地吸收了初乳免疫球蛋白的动物，立即得到免疫球蛋白供应，尤其是IgG，使其接近于正常成年动物的水平。在生后的12～24小时，血清中免疫球蛋白的水平达到高峰。在吸收终止后，这种被动获得的抗体水平，通过正常的降解作用开始下降，而下降的速度取决于免疫球蛋白的种类，而降到无保护力的水平所需的时间，也因为原有的浓度而不同。 从初乳中最早获得的IgG是幼畜抵抗败血性疾病所必需的。继续摄取IgA到肠管中则可以保护幼畜免于发生肠道疾病。以上任何一种免疫球蛋白吸收量小或吸收失败都会导致幼畜发生感染。 新生动物血清中免疫球蛋白的水平，可以应用测定血清中免疫球蛋白试验，如用硫酸锌浊度试验或辐射状态免疫扩散试验等来检查。对缺乏免疫球蛋白的新生动物可以进行人工补给，如补给冷冻贮存的初乳，成年动物的正常血清以及粗制的免疫球蛋白制剂等。 虽然初乳转移的免疫对幼龄动物的防病与保健是重要的，但也会发生问题。如母畜被其胎儿的红细胞免疫，产生了抗红细胞抗体，而初乳中的抗体可以引起胎儿红细胞的大量破坏，造成新生动物的溶血性贫血等。除此之外，每毫升的牛乳中含有107左右的淋巴细胞，其中5%为T淋巴细胞。这些淋巴细胞在新生动物的肠道中可以存活36h左右，并有可能穿越肠壁进入肝脏。实验证明，

Western Blot内参选择

Western Blot内参选择 要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。 虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。 良好的参照体系通常包括分子量Marker(用来确定蛋白条带对应的分子量大小)、空白载体对照(如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照)、已知量标准产物的正对照，另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果，即便有结果也可能影响结果的分析。 内参即是内部参照(Internal Control)，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。 实际上内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot 比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础，特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析，所以需要内参。在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。

常见内参基因

β-A c t i n Actin即“肌动蛋白”，是细胞的一种重要骨架蛋白。同时Actin在细胞分泌、吞噬、 β-Actin 移动、胞质流动和胞质分离等过程中起重要作用。Actin在不同物种之间高度保守，以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括α-skeletalmuscleactin，α-cardiacmuscleactin，α-smoothmuscleactin，和 γ-smoothmuscleactin；其余两种广泛分布于各种组织中，包括β-actin(β-non-muscle)和 γ-non-muscleactin。不同的actin之间同源性大于90%，但在N-terminal同源性仅50%-60%，因此N-terminal常被用作actin的抗原。β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。具有收缩功能，分布广泛。 β-Actin用途 β-Actin是PCR常用的内参，β-Actin抗体是WesternBlot很好的内参指数。内参即是内部参照（InternalControl），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。常用的蛋白质内参有细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin和GAPDH （glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase）等。因此β-Actin抗体、β-Tubulin抗体以及GAPDH抗体成为最常见的三个动物细胞内参抗体。β-Actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富。Beta-actin 由375个氨基酸组成，分子量大小为42-43kDa左右。 β-actin的蛋白水平通常不会发生改变，因此被广泛用于Western时上样量是否一致的参照，也常被用于免疫染色观察细胞的微丝结构。在用作Western的参照时，Actin抗体和Tubulin抗体的主要不同之处在于两者所识别蛋白的分子量不同，这样可以选择合适的参照在同一块胶同一张膜上实现同时检测目标蛋白和参照蛋白。 GAPDH GAPDH或G3PDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶 （glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase）的英文缩写。该酶是糖酵解反应中的一个酶，由4个30－40kDa的亚基组成，分子量146kDa。该酶基因为管家（housekeeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提totalRNA，poly(A)+RNA，Westernblot等实验操作的标准化的内参。 GAPDH结构图

各种抗体意义

免疫系统：参与免疫反应的器官、组织和细胞统称为免疫系统。包括： 1. 中枢免疫器官：胸腺，骨髓，禽类的“腔上囊”，及其类同器官。2. 外周免疫器官：脾脏和淋巴结，如扁桃体、阑尾、肠道集合淋巴结、消化道和呼吸道粘膜下层的淋巴小结及全身各处弥散的淋巴结是T 细胞和 B 细胞定居的场所。3. 参与免疫反应的细胞：（ 1 ）吞噬细胞，（ 2 ）免疫活性淋巴细胞：T 细胞、 B 细胞、NK 细胞、K 细胞 抗体什么叫：机体接受抗原刺激后，在体液中出现的特异性免疫球蛋白叫做抗体 免疫是指机体识别和消除异物的功能。免疫功能与疾病的主要关系：免疫防御功能抵抗病原微生物过敏或反复感染免疫监视功能消除机体突变的细胞恶性肿瘤自我稳定功能消除衰老、死亡和受损的细胞自身免疫病以上三种功能的完整性是机体正常的基本保证，其中任何一个成分的缺失或功能不全、都可引发疾病 SM 是一位病人名字的缩写，在这位诊断为红斑狼疮的病人血清中，首次找到了这种抗体而命名。抗SM 抗体是诊断红斑狼疮的特异性抗体，其阳性率占30% ，具有辅助诊断意义，但与疾病的活动无关 抗双链DNA 抗体又称为抗天然DNA 抗体，是抗核抗体的一种类型，它在红斑狼疮的发病中起一定的作用。一般认为抗双链DNA 的效价与病情相平行，即病情活动时，抗（DNA ）抗体效价升高，病情缓解时，效价降低 抗核抗体（ANA ）是参与细胞核或者核的组成成分（DNA ）反应的自身抗体，主要出现在红斑狼疮等一类自身免疫病中，是诊断红斑狼疮的主要手段之一，但是偶尔也可以在老年人和使用某些药物后出现ANA 阳性，但效价很低 抗Rib-P抗体：抗核糖体P蛋白抗体主要见于SLE，常在SLE活动期中存在，阳性率在10%～20%左右，是诊断SLE的特异性抗体。如仅有抗Rib-P抗体阳性的SLE患者，ANA常为阴性。抗Rib-P抗体阳性患者中枢神经系统病变发生率高。抗Rib-P抗体与抗dsDNA抗体的消长相平行，但与抗dsDNA抗体不同的是不会随病情好转立即消失，可持续1～2年后才转阴。 抗dsDNA抗体（抗双链DNA抗体），在SLE病人中发现抗dsDNA抗体，因不同的疾病活动度，其发生率在60% -90%，对SLE的诊断具有高度特异性。其他结缔组织病阳性率低（<10%)，一般认为是红斑狼疮重叠综合征。 R0、SSA抗原在免疫学上是一致的，即有共同的抗原决定簇。SSA／Ro是小分子细胞浆核糖核蛋白（scRNPs），是蛋白和小分子核糖核酸形成的复合物。它更多的存在于胞浆中，分子量52KD的多肽条带与干燥综合征（SS）相关，而分子量60KD的多肽条带则更多存在于SLE 患者中。抗SSA抗体主要见于原发性干燥综合征，阳性率高达60％～75％。此外，抗SSA 抗体常与亚急性皮肤性红斑狼疮、抗核抗体阴性狼疮、新生儿狼疮等相关（SSA抗体可通过胎盘进入胎儿引起新生儿狼疮综合症）。SSA抗体与广泛光过敏性皮炎症状相关。 抗Smith抗体，是SLE的特异性抗体。Smith抗原是U族小分子细胞核核糖核蛋白（UsnRNP），具有抗原性的蛋白。在SLE中阳性。虽然敏感性较低，但特异性高。在全部抗Smith阳性的病例中，%为SLE。因此，抗Smith抗体为SLE的标记抗体。对早期、不典型的SLE或经治疗

动物母源抗体与免疫程序

动物母源抗体与免疫程序 朱瑞良牛钟相崔治中赵宏坤（山东农业大动物科技学院 271018） 1 动物母源抗体 1.1母源抗体的概念： 通过胎盘、初乳或卵(禽类)从母体所获得的抗体称为母源抗体。由于母源抗体的存在，幼小动物或婴幼儿对某些疾病具有较强的抵抗力，例如新生仔猪在二三个月内对猪丹毒杆菌，新生羔羊对布氏杆菌具有较强的不感受性，关键在于获得了母源抗体。母源抗体不仅在抗病免疫中具有重要意义，而且对疫苗接种后机体的免疫应答也有严重干扰，因而对免疫程序有巨大影响，应当引起注意。 1.2母源抗体的转移途径： 母源抗体从母体到达胎儿的途径，取决于胎盘屏障结构的组成。人和其他灵长类动物的胎盘是血绒毛膜性的，也就是母体血液直接和滋养层相接触。这种类型的胎盘允许IgG通过，而不允许IgM、IgA和IgE转移到胎儿。母体的IgG可以经胎盘进入胎儿的血液循环，所以从母乳获得少量IgG(5～10%)，但大部分是从母体中获取。反刍兽的胎盘呈结缔组织绒毛膜型，胎儿与母体之间组织层次为5层，而马、驴和猪的胎盘则为上皮绒毛膜型，胎儿与母体之间的组织层次为6层，具有这两种胎盘的动物，免疫球蛋白分子通过胎盘的通路全被阻断，母源抗体必须从初乳获得。犬和猫的胎盘是内皮绒毛膜性的，胎儿与母体之间组织层次为4层，这些动物能从母体获得少量IgG，大量抗体也来自初乳。禽类的抗体可以经卵传给下一代，产卵前一周，母鸡的抗体通过卵胞膜进入卵黄，因此产卵时抗体(IgG)在卵黄内。鸡卵孵化的第4天，抗体转移到卵白内，12-14天抗体在鸡胚中出现。出壳后的3-5天内，继续从残余的卵黄中吸收剩余的抗体，因此母源抗体滴度的高峰在出壳后的第三天左右。 未吃奶的新生动物正常血清中只含极低水平的免疫球蛋白。成功地吸收了初乳免疫球蛋白的动物，立即得到免疫球蛋白供应，尤其是IgG，使其接近于正常成年动物的水平。在生后的12～24小时，血清中免疫球蛋白的水平达到高峰。在吸收终止后，这种被动获得的抗体水平，通过正常的降解作用开始下降，而下降的速度取决于免疫球蛋白的种类，而降到无保护力的水平所需的时间，也因为原有的浓度而不同。

GAPDH内参抗体,抗GAPDH单抗,GAPDH小鼠源单克隆抗体

https://www.wendangku.net/doc/6c4857644.html, GAPDH内参抗体，抗GAPDH单抗，GAPDH小鼠源单克隆抗体 Anti-GAPDH Mouse Monoclonal Antibody （ 2B5） 在Western Bloting实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确，或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差；这些误差可以通过测定每个样品中实际转到膜上的内参，比如内参GAPDH的含量来进行校正。GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。 GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。 应用类型：WB（1:1000-1:10,000）、IHC（1:100-1:800） Fig.Western blot analysis (1:10,000) of GAPDH expression in Rat brain (lane A), HeLa cell lysate (lane B), Mouse brain (lane C), Rabbit muscle (lane D), Chicken muscle (lane E) and Pig heart (lane F) with Anti-GAPDH mouse monoclonal antibody (2B5).

https://www.wendangku.net/doc/6c4857644.html, 免疫原：KLH偶联的GAPDH部分多肽序列 来源宿主：小鼠 反应性：该GAPDH内参抗体可识别人、小鼠、兔、大鼠、猴、狗、鸡、猪和绵羊等种属的GAPDH蛋白。 保存建议：能在-20℃保存1年。为最大限度的避免损失，请在打开管盖之前融化抗体并离心。建议使用前分装以避免反复冻融，分装后可在4℃保存1个月。 GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。因为GAPDH 作为看家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，因此在使用GAPDH内参抗体时，将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。 如何选择合适的GAPDH抗体？ 内参抗体虽然选择较多，但是也需要遵循一定的原则，并契合实际的应用要求。首先，需要考虑目的蛋白的大小，我们推荐内参要与检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上，因此你需要根据你目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参，由于GAPDH的检测分子量大约在36kD，因此该内参抗体不是很适合用于检测30kD-40kD大小目标蛋白的WB实验中。另外，不同的组织来源的样本在选择内参时还有一定的区别。比如某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，不适合做内参。

自身抗体检测项目及临床意义

一、抗核抗体 抗核抗体（antinuclearantibodies，ANA）泛指抗各种核成分的抗体，是一种广泛存在的自身抗体。ANA的性质主要是IgG，也有IgM和IgA，甚至IgD和IgE。ANA可以与不同来源的细胞核起反应，无器官特异性和种属特异性。ANA主要存在于血清中，也可存在于其他体液如滑膜液、胸水和尿液中。 ANA在SIE患者的滴度较高，但也出现在其他许多自身免疫病中，在许多研究报告中，都将检出ANA作为自身免疫甚至自身免疫病存在的依据。这种现象的机制尚未明了，有待于进一步研究。 （一）ANA的类型及意义 由于细胞核成分的复杂性，不同成分的抗原性也不同；因此就会有多种不同的ANA。 1．抗核蛋白抗体核蛋白抗原（DNP）由DNA和组蛋白组成。由于DNP抗原存在不溶性和可溶性两个部分，可分别产生相应的抗体。不溶性DNP抗体通常不完全被DNA和组蛋白所吸收，它是形成狼疮细胞的因子；可溶性抗原存在于各种关节炎病人的滑膜液中，其相应抗体也出现于RA病人的滑膜液中。 2．抗DNA抗体可以分为两大类：①抗天然DNA（nDNA）抗体，或称抗双链DNA （dsDNA）抗体；②抗变性DNA抗体，或称抗单链DNA（ssDNA）抗体。抗dsDNA抗体对SLE有较高的特异性，70％～90％的活动期SLE病人该抗体阳性，效价较高，并与病情有关。抗ssDNA抗体可见于多种疾病中，特异性较差。 3．抗ENA抗体可提取性核抗原（ENA）多从动物的胸腺中提取。先将胸腺匀浆并破碎细胞，分离出细胞核；再经盐水或磷酸盐缓冲液处理后，很容易从胞核中提取出来。ENA 不含DNA，对核糖核酸酶敏感。近年来的研究表明，ENA可分为十几种，现仅介绍几种主要的ENA及其相应抗体。

内参基因1

内参基因 内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达 水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差， 保证实验结果的准确性。借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样 半定量的结果才更为可信。一般要选择一个在处理因素作用的条件下不会发生表达改 变的基因作内参。 在进行基因研究的过程中,实时反转录 PCR也和传统的mRNA定量方法如 Northern b lot技术等一样, 要求使用参照基因以校正转录效率和 cDNA用量, 弥补制备过程中样本 纯度和浓度的差别, 使不同样本之间目的基因的比较成为可能,以期获得真实可靠的结果。大多数分析方法中这些差别可通过与内参照比较处理消除。最普通的内参照是内 源性参照基因,也叫管家基因。 管家基因：又称持家基因(house-keeping genes)生物体各类细胞中都表达，其产物 是对维持细胞基本生命活动所必需的蛋白质编码的基因。如微管蛋白基因、糖酵解 酶系基因与核糖体蛋白基因等。是为维持细胞基本生命活动所需而时刻都在表达的 基因。 管家基因表达水平受环境因素影响较小，而是在个体各个生长阶段的大多数、 或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。它的表达只受启动序列或启动子与RNA 聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。管家基因高度保守并且在大多数 情况下持续表达，因此管家基因常被用于分子技术--多位点基因分析。 内参基因通常是各种看家基因，在细胞内组成稳定性表达，有助于保持细胞的 功能。理想的内参基因应该满足以下条件：1, 不存在假基因（Pseudogene），以 避免基因 DNA的扩增； 2,高度或中度表达，排除低表达； 3,稳定表达于不同类型 的细胞和组织（如正常细胞和癌细胞），而且其表达量是近似的，无显着性差别； 4,表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；5, 其稳定的表达水平与目标基因 相似；6, 不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响. 近年来的研究发现：这些常用内参基因均存在缺陷，在不同类型的细胞和组织 细胞增殖和器官发育的不同阶段体外培养各种实验条件等情况下它们的表达量通 常变异较大。正确的选择内参基因, 很大程度上依赖所研究的细胞或组织, 不同的试验 需要寻找适合各自试验体系的特异性稳定表达的内参基因。然而,合适内参基因的选择, 需要在各种类型的细胞或组织和各种试验条件下进行比较选择。理想的内参基因应在 各种试验条件下,各种类型的组织和细胞中均恒定表达,而且其表达量是近似的,无显着 性差别。另外要求不存在假基因以避免基因组的扩增。

抗体介绍

抗体 它是高等动物在抗原物质的刺激下由浆细胞产生的一类能与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。抗体通常存在于血清合淋巴（组织液）中。 单克隆抗体及多克隆抗体：由单一克隆的细胞（通常是单一克隆的杂交瘤细胞）所产生的识别某一抗原表位的单一抗体；多克隆抗体是由多种细胞分别接触相应抗原而产生的多种抗体的总和，多克隆抗体抗原识别抗原的多个表位。 抗体分类 抗体分类：根据重链恒定区的血清学类型，可将抗体分为IgM，IgG，IgA，IgD，IgE五类，它们的重链分别为mu, gamma, alpha, delta, epsilon链。在上述每一类别中，按重链构造上的变异又可分为几个亚类，例如人的IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4四个亚类。 轻链分为两种类型，kappa链和lambda链，但每种抗体中只存在一种类型的轻链。 第一抗体 第一抗体就是能和非抗体性抗原特异性结合的蛋白。 第一抗体的选择

1.分析自己实验应用的实验方法是哪种？ 一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型，如：可以应用于WB、IHC、ICC、ELISA、FCM分析等。 2.分析自己实验中标本的种属是哪种动物或人的？ 一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种动物或人的标本，如：可以用于rat、mouse、human、pig、goat等动物的标本的实验。也就是说应选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸序列同源性较高。 3.分析样本中的蛋白质的结构性质 了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，至少两方面因素需要考虑 待测样本蛋白的结构域：抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。如果打算用FCM流式检测活细胞的表面蛋白，则需要选择含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。 样本的提取或处理过程：某些抗体要求样本经过某些特殊处理，例如：许多抗体只识别还原和变性的、表位已暴露不受二级四级结构阻碍的蛋白样本，另一方面，某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白。当选择免疫组化的抗体时，应注意某些抗体只识别未固定的冷冻的组织，而另一些抗体则适用于无需抗原修复解交联步聚的甲醛固定石蜡包埋的组织，这些都会在抗体说明书上应用部分标示出来。 4.抗体宿主物种的选择 一般说来，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗宿主动物的物种选择较为重要，对于免疫组化而言，尽可能选择与样本不同种系物种的一抗，从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应，例如：检测小鼠样本蛋白，则不应选择小鼠或大鼠源的一抗，最好选兔源的一抗，则二抗则可选择偶联了检测分子（酶、荧光素、生物素等）的抗兔IgG。如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况，除免疫组化外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法，则抗体宿主物种的影响不大。 第二抗体 第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。二抗是利用抗体是大分子的蛋白质具有抗原性的性质，对异种动物进行免疫，由异种动物的免疫系统产生的针对于此抗体的免疫球蛋白。如用抗AIV H5亚型血凝素单克隆抗体为包被抗体,兔抗AIV IgG为第二抗体。 由于二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛，如western blot（通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质），ELISA（以耦联有酶的抗体或抗原为标记来检测特异性的蛋白质，尤其是相应的抗原或抗体），免疫组织化学（检测组织中的特异性抗原），免疫细胞化学（通过免疫学方法检测细胞的抗原组成），流式细胞术（通过检测激光所激发荧光来鉴定分离不同类型的细胞）及免疫沉淀（通过抗原与抗体的特异性结合作用来分离相应抗