MYB基因表达载体的构建及转化热研2号柱花草的研究_胡珊娜

MYB基因表达载体的构建及转化

热研2号柱花草的研究

胡珊娜1，徐立2，李志英2，雍伟1

(1.海南大学农学院，海南海口570228；2.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/

农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室，海南儋州571737）

摘要：通过PCR扩增得到红掌（Anthurium andraeanum）的MYB基因全长，将MYB基因片段克隆到pMD18-T 载体上，然后将此基因插入CaMV35S启动子后构建成表达载体Cam35S-GFP-MYB。通过冻融法将带有目的基因的表达载体导入根癌农杆菌，并转化热研2号柱花草获得转基因植株若干。抽取10株转化的柱花草植株的基因组DNA进行PCR分子验证，结果表明有6株阳性，MYB基因已成功整合到柱花草的基因组中。转基因柱花草植株的获得为柱花草等豆科牧草的适口性和抗逆性的提高提供了可能，并且为以后柱花草的遗传转化工作提供了可靠的依据。

关键词：MYB基因；柱花草；遗传转化

中图分类号：S541文献标识码：A文章编号：1004-874X（2014）11-0154-03 Study on MYB gene expression vector constructing and

transformation of Stylosanthes gianensis cv.Reyan No.2

HU Shan-na1,XU Li2,LI Zhi-ying2,YONG Wei1

(1.College of Agriculture,Hainan University,Haikou570228,China;

2.Institute of Tropical Crop Genetic Research,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/

Key Laboratory of Tropical Crop Genetic Research and Germplasm Enhancement

in Southern China,Ministry of Agricultur,Danzhou571737,China）

Abstract:The full length of MYB gene was amplified from Anthurium andraeanum,this gene was cloned to pMD18-T firstly and then inserted pBI121under CaMV35S promoter to construct expression vector Cam35S-GFP-MYB.the expression vector was transferred into EHA105by agrobacterium-mediated transformation,transformed the Stylosanthes gianensis cv.Reyan No.2and some transgenic plants was obtained.Taking10plants of transformed stylo for PCR analysis, the results showed that MYB gene successfully integrated into the6transgenic plants.The transgenic plants made it possible to improve palatability and resistance of Stylo,and to provide a reliable basis for genetic transformation of Stylo in future.

Key words:MYB gene;Stylosanthes gianensis;genetic transformation

柱花草（Stylosanthes）又名笔花豆，是我国热带地区广泛种植的优良豆科牧草，适应性强，耐酸性土壤，有“热带苜蓿”之称[1]。柱花草产量高、营养价值丰富且富含多种维生素和氨基酸，其干物质中粗蛋白含量在10%以上[2]。高蛋白含量的豆科牧草会引起反刍家畜（牛、羊）的消化疾病[3-4]，但是在柱花草育种中，目前从改善牧草适口性和消化率等角度出发的应用少有报道。

原花青素（proanthocyanidin，PA）又叫缩合单宁，是广泛分布于高等植物中的一种聚多酚类物质[5]，经公共苯丙烷-核心类黄酮-原花青素复合途径合成[6]。PA对于植物具有抗紫外线、抗病、抗虫、清除自由基等生理功能，并影响作物的适口性、可消化性、保健价值等品质性状[7-8]。一方面，缩合单宁的抗营养因素影响动物的蛋白摄入量和生产性能，另一方面，适宜含量的缩合单宁又能正向调节瘤胃发酵作用，防止反刍动物鼓胀病的发生[9]。MYB类转录因子参与公共苯丙烷-核心类黄酮-原花青素复合途径等植物的次生代谢途径的调控过程[9-11]，在植物对外界环境、抗病胁迫反应中起重要的

收稿日期：2013-11-28

基金项目：农业部“948”项目（2010-S6）；海南省自然科学基金（310070）

作者简介：胡珊娜（1986-），女，在读硕士生，E-mail：145926 6275@https://www.wendangku.net/doc/684965804.html,

通讯作者：徐立（1975-），男，博士，副研究员，E-mail：xllzy@ https://www.wendangku.net/doc/684965804.html, 广东农业科学2014年第11期

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图1Cam35S-GFP-MYB

表达载体的构建

M：DNA Maker DL2000；1、2：RT-PCR扩增产物

图2RT-PCR红掌MYB基因全长

调控作用[12-13]。

本试验根据已克隆得到的红掌中与类黄酮代谢相关的调控因子基因MYB1（GenBank登录号为: AY236865.1）的全长序列，构建表达载体Cam35s-GFP-MYB，优化热研2号柱花草的遗传转化再生体系，并通过转化热研2号柱花草获得转基因植株。以提高柱花草的适口性和消化率以及抗逆性为目的，并且为类黄酮次生代谢在牧草品质改良方面提供基础依据。

1材料与方法

1.1试验材料

供试材料为热研2号柱花草，由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所牧草中心提供。

根据红掌（Anthurium andraeanum）中克隆出的MYB1基因序列设计酶切位点的上游引物和下游引物分别为MYB-KPNI-F（5'-CGGGGTACCCCGCTGCCGA AGAAGACCAGAA-3'）和MYB-XbaI-R（3'-TGCTCTA GAGCACCCTAAACCCCTCCATACC-5'）。羧苄青霉素（Carbenicillin，Cb）、潮霉素（Hygromycin，Hym）等均购自上海生工生物工程技术有限公司，rTaq酶等PCR试剂、克隆载体PMD-18T、限制性内切酶KpnI和XbaI购自大连宝生物技术有限公司，表达载体Cam35S-GFP大肠杆菌（Escherichia.coli）DH5α、农杆菌EHA105均由中国热带农业科学院品种与资源研究所快繁中心提供。1.2试验方法

1.2.1表达载体Cam35s-GFP-MYB的构建MYB 基因全长的PCR扩增产物，通过双酶切连接到克隆载体PMD-18T上，转化大肠杆菌（E.coli）DH5α，通过菌液PCR检测获得阳性克隆菌落，提取重组质粒，再以同样双酶切位点区域连接到表达载体Cam35S-GFP上（图1），经过限制性酶切验证得到带有目的基因的质粒后，通过冻融法导入农杆菌，加入1%的无菌甘油于-80℃保存。构建好的表达载体命名为Cam35S-GFP-MYB（图1）。

1.2.2热研2号柱花草茎段再生体系无菌苗的培养：热研2号柱花草种子经80℃热水处理5min，0.1%的升汞灭菌5min无菌水冲洗3~5次，无菌滤纸吸干后接种在MS培养基上。待无菌苗生长40d后取0.5cm茎段（不带腋芽）为外植体，然后经过预培养和共培养，分化获得完整植株。

1.2.3热研2号柱花草抗生素的筛选和农杆菌介导转化外植体为0.5cm无菌苗茎段，每个因素外植体接种个数为45个，诱导愈伤的预培养培养基黑暗培养48 h后转光照培养，两周后观察诱导愈伤情况。

农杆菌EHA105转化的OD值为0.8~1.0，侵染时间为10min，诱导愈伤黑暗培养48h后转光照培养，两周后转接诱导不定芽的含有Car和Hym的抗性筛选培养基上生长。

柱花草茎段外植体经含有MYB目的基因片段的农杆菌菌液侵染后接种在诱导愈伤的培养基MS+2,4-D2 mg/L+KT2mg/L+Sucrose30g/L+卡拉胶7.5g/L、pH6.0上，经过24h的黑暗培养后在无菌环境下用加羧苄青霉素的无菌水进行外植体的清洗，然后放置在光照黑暗交替模拟自然环境下培养7d后转接到诱导不定芽培养基MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.1mg/L+Sucrose30g/L+卡拉胶7.5g/L、pH6.0上，待愈伤组织长出不定芽后继代1次，待植株高度达到3~4cm后转接到生根培养基MS+IAA0.5 mg/L+Sucrose30g/L+卡拉胶7.5g/L、pH6.0上。

1.2.4热研2号柱花草转基因阳性植株分子鉴定柱花草基因组DNA的提取方法采用微量CTAB法，RNA 提取亦采用CTAB法，65℃消化时间为8min。然后分别通过PCR和RT-PCR对阳性克隆植株进行分子水平的验证，PCR扩增程序：94℃预变性10min；94℃变性45s、55.9℃退火1min、72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。

2结果与分析

2.1表达载体Cam35s-GFP-MYB的构建

利用RT-PCR技术从红掌cDNA中扩增出一条特异性条带，大小与已知的MYB1一致，在954bp左右，初步认定为目的片段（图2）。将目的片段经过KpnI和XbaI双酶切，链接到克隆载体PMD-18T上，转化大肠杆菌DH5-α，通过菌液PCR检测获得阳性克隆菌落（图3），提取重组质粒，再以同样双酶切位点将目的片段区域连接到表达载体Cam35S-GFP上，构建表达载体Cam35s-gfp-MYB（图4），经KpnI和XbaI双酶切验

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M ：DNA Maker DL2000；1、2：菌液PCR 扩增产物

图3MYB 基因阳性克隆菌液

PCR

M ：DNA Maker DL2000；1：表达载体酶切产物图4表达载体Cam35s-GFP-MYB 双酶切鉴定

证目的片段已成功连接至Cam35S-GFP 。进一步测序结果表明该片段长度为954bp ，与AY236865.1核苷酸序列相似性为99%，连接方向正确。

2.2抗生素的筛选及农杆菌介导转化

共培养后柱花草茎段周围附着大量农杆菌，可利

用羧苄青霉素抑制农杆菌的生长。试验结果表明：羧苄青霉素的浓度分别为100、300、500、700mg/L 时，柱花草的愈伤组织的诱导率分别为97%、91%、60%、40%，当羧苄青霉素的浓度达到700mg/L 时，愈伤的诱导率降低并且伴有严重褐化现象，所以采用500mg/L 浓度的羧苄青霉素既能有效地抑制农杆菌的生长，又能致死部分外植体，有利于阳性克隆植株的筛选。柱花草为双子叶植物，较单子叶植物的转化率高一些，因此不用添加乙酰丁香酮（Acetosyringone ，AS ）。潮霉素的筛选浓度分别为10、20、30、40mg/L ，愈伤诱导率为97%、

73%、46%、20%，采用30mg/L 半致死量的潮霉素浓度对转基因柱花草进行有效筛选培养。农杆菌的OD 值为0.8，侵染时间为10min 最适宜，不但能达到农杆菌

介导转化的目的，而且后期筛选过程中农杆菌的生长也较少，有利于完整转基因植株的形成。

2.3转基因柱花草的分子验证

经过转化270个外植体，共得到20株转基因柱花

草，由于在农杆菌介导转化后的植株再生体系中始终以30mg/L 潮霉素和500mg/L 羧苄青霉素作为筛选浓度，所以初步确定能够达到较高的转化率，所以试验随机抽取10株转基因柱花草在分子水平上进行验证。结果表明，10株转基因柱花草基因组DNA 通过特异性引物进行PCR 扩增，其中6株得到长度约为954bp DNA 片段（图5），与目的基因片段的大小相一致。初步证明目的片段已经整合到转化植株的基因组DNA 上。提取

阳性克隆的转基因柱花草和阴性对照株的RNA ，通过

RT-PCR 扩增，得到长度大约为954bp 的片段（图6），而对照株没有条带，初步推测转入的MYB 基因在柱花

草中可能有所表达。

3结论与讨论

在柱花草遗传转化技术方面，农杆菌介导法已成

功获得转基因植株[14]，本试验采用EHA105农杆菌进行转基因侵染，农杆菌菌液的OD 值在0.8~1.0范围内，外植体均可长出正常愈伤组织，但如果农杆菌菌液OD 值在0.8以下，侵染效果会大大降低，1.0以上会因为农杆菌的过度繁殖而不利于后期的芽分化[16]。

柱花草的整个侵染过程采用一步法[15]，即从最初开始诱导愈伤组织到芽分化再到生根培养都采用合适的抗生素筛选压力，浓度分别为500mg/L 羧苄青霉素和

30mg/L 潮霉素，此法能够有效杀死非转化细胞和抑制

假阳性细胞的分化生长，从而达到提高阳性转基因植株的筛选率的目的，试验表明通过此方法的柱花草阳性转化率在60%左右。

值得一提的是在后期生根培养过程中由于潮霉素保持30mg/L 的浓度会使根的生长受到抑制，而且影响须根和根毛的生长分化，可能是因为根的生长对潮霉素较敏感。因此，在生根培养的过程中还需适当降低潮霉素的浓度以保证根组织正常的伸长生长。

MYB 转录因子参与类黄酮的代谢调控，此外，MYB

类转录因子还参与植物对外界环境、抗病胁迫反应中起重要的调控作用，本试验获得的阳性转基因柱花草为提高热研2号柱花草的适口性以及抗逆性提供可能，并为今后柱花草遗传转化工作提供一定的理论依据。

M ：DNA Maker DL2000；1~10：转基因植株基因组DNA 扩增产物

图5转基因柱花草基因组DNA

水平验证

M ：DNA Maker DL2000；C-：对照植株RT-PCR ；

1~6：转基因植株RT-PCR 扩增产物图6转基因柱花草RT-PCR 分子验证

（下转第171页）

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（责任编辑杨贤智）

（上接第156页）

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（责任编辑崔建勋）

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171

基因表达载体构建教学设计

“基因表达载体的构建”教学设计

专题1 1.2基因工程的基本操作程序之基因表达载体的构建 一、目的基因和运载体的连接 二、利用标记基因筛选含目的基因的受体细胞 三、目的基因和启动子的相对位置关系 附件1： 附件2：

【教学反思】 基因表达载体的构建是基因工程的关键步骤，空间想象难度大，科学理论和技术实践密切联系，思维跨度也大。福州屏东中学学生程度一般，正因如此，处理不好会提高学习难度，令学生视高科技为畏途，导致教学流于形式。本节课用微课和模型成功地化解了难点。 一方面基于学生课前微课的“先学”，学生对表达载体的构建有个整体的认识，然后以此为支架在课堂上填充和拓展内容，当学生在课堂上遇到相关问题时，能尽快到达“最近发展区”，获得进一步的发展，使学生逐渐对细节有更丰富更具体的理解，这种先整体后局部的处理符合学生的认知规律。基于微课的先学后教模式实质上是利用微课为学生创设一个情境，使学生带着思考和疑惑走进课堂，节省课堂的热身时间，从而使高效率大容量的课堂教学目标得以实现。 另一方面高二学生具有抽象思维，但是仍然需要感性知识，形象知识作为支持，所以教师精心设计纸质模型，基于教材原有的学习完“DNA重组的基本工具”后的纸圈模拟活动，再设计了双酶切的活动，化微观为直观，一系列问题的发生都源自学生自己亲手构建的模型，从模型中发现问题，进而逐步由浅入深。学生像科学家一样思考问题、解决问题，获得成功的体验。由于是带着问题的探究模拟活动，使学生的课堂参与是形式之上思维的积极参与。学生获得的体验是：基因工程这么高深的原理原来我也能想得到。学生的纸质模型立体、科学、易操作，但不好展示，而教师利用不同颜色的磁贴，随着课程的逐步推进，简洁明了地逐步在黑板上呈现，让整个环节衔接自然，师生互动流畅。直观的教学手段——模型构建，减轻了学生掌握这些知识的阻力，激发了学习积极性，使学生在轻松愉快的氛围中突破了重难点，强化了学生交流合作意识。 总之，作为教师，应该想学生之所难，积极探索有效途径，一堂成功的课不是展示教师的才智、形象、语言，更要通过学生的成功来反映。

维真生物-如何阅读基因载体图谱

如何阅读基因载体图谱 基因载体是基因工程的核心，也是基因治疗中强有力的生物工具，我们先来认识和阅读载体图谱吧。 一、载体分类及载体组成元件 载体分类 1、按属性分类：病毒载体和非病毒载体 病毒载体是一种常见的分子生物学工具，可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入目的细胞，进行感染的分子机制。可发生于完整活体或是细胞培养中。可应用于基础研究、基因疗法或疫苗。用于基因治疗和疫苗的病毒载体应具备以下基本条件： （1）携带外源基因并能包装成病毒颗粒； （2）介导外源基因的转移和表达； （3）对人体不致病； （4）在环境中不会引起增殖和传播。 非病毒载体一般是指质粒DNA。 2、按进入受体细胞的类型分类：原核载体、真核载体、穿梭载体（含原核和真核2个复制子，能在原核和真核细胞中复制，并可以在真核细胞中有效表达）。 3、按功能分类：克隆载体、表达载体 克隆载体：具有克隆载体的基本元件（Ori，Ampr，MCS等），可以携带DNA片段或外源基因进入受体细胞并克隆和大量扩增DNA片段（外源基因）的载体。 表达载体：克隆载体中加入一些与表达调控（具有转录/翻译所必需的DNA顺序）有关的元件即成为表达载体。 载体组成元件 1、复制起始位点Ori：即控制复制起始的位点。Ori的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。 2、抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+ ，Kan+ （1）Ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。

（2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。 （5）hygr：使潮霉素β失活。 3、多克隆位点：MCS克隆携带外源基因片段，它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。还要再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 4、P/E：启动子/增强子 5、Terms：终止信号 6、加poly（A）信号：可以起到稳定mRNA作用 示例阅读载体： pENTER载体 1）human ORF + pENTER载体 2） CMV启动子，T7启动子 3） ORF的C端融合了Flag和His tag 4) 多克隆位点，常用AsisI 和 MluI(人源基因上不常见的)

陕西省渭南市2020年高考生物二模试卷 (有解析)

陕西省渭南市2020年高考生物二模试卷 一、单选题（本大题共6小题，共36.0分） 1.下列有关细胞的结构与功能的叙述，正确的是（） A. 线粒体内膜上附着与细胞呼吸有关的酶，与其分解丙酮酸的功能相适应 B. 通过碱性染料染色，在光学显微镜下可看到高等植物成熟筛管细胞的细胞核 C. 真核细胞具有核糖体，其形成与核基质有关 D. 生物膜功能的复杂程度取决于膜上蛋白质的种类和数量 2.ATP（甲）是生命活动的直接能源物质，据图判断下列叙述正确的是（） A. 在主动运输过程中，乙的含量会明显增加 B. 丙中不含磷酸键，是RNA基本组成单位之一 C. ATP中的能量可以来源于光能、化学能，也可以转化为光能和化学能 D. 甲→乙和乙→丙过程中，其催化作用的酶空间结构相同 3.下列关于果蝇的叙述正确的是（） A. 雌果蝇体细胞含有两条X染色体 B. 雄果蝇产生的精子中一定有Y染色体 C. 雌果蝇产生的卵中有两条X染色体 D. 雄果蝇的体细胞中有两条Y染色体 4.下列有关组成生物体化合物的叙述，错误的是（） A. tRNA可识别并运输特定的氨基酸 B. 磷脂分子既有亲水基团，也有疏水基团 C. 不可用双缩脲试剂检测溶液中的氨基酸含量 D. 生物体内常见的糖类如糖原、核糖、淀粉都经脱水缩合形成 5.现代生物进化理论的基本观点是（） ①种群是生物进化的单位 ②生物进化的实质是种群基因频率的改变 ③生物进化是长期应用的结果 ④进化的根本原因是遗传．

A. ① B. ①② C. ①②③④ D. ①②③ 6.下列关于生态学相关概念的理解正确的是（） A. 根据生态系统能量流动的特点可知，每一营养级同化的能量也将有10%-20%流向分解者 B. 某草原丰富的植物资源为田鼠提供了良好环境，田鼠的大量繁殖引来鹰的捕食，田鼠种群数 量下降，该草原群落的丰富度也将随之下降 C. 科研人员在调查某河流污染情况时发现每毫升河水中含有9个大肠杆菌，该结果不能反映出 种群的空间特征 D. 生态系统中的能量流动环节越多，人可获得的能量就越少 二、探究题（本大题共7小题，共69.0分） 7.柱花草是我国南方地区重要的豆科牧草，对低温胁迫较为敏感，易发生冷害。如表为科研人员 在不同温度下测得的柱花草叶片光合速率等相关指标。 ②RuBPcase是催化CO2和RuBP（C5）结合的酶。 请回答下列问题： （1）20℃时，柱花草叶肉细胞中能够消耗水并伴随着[H]产生的场所有______。与对照组相比，高温处理相同的时间，柱花草光合作用制造的有机物量______（填“较多”“较少”“相等” 或“无法确定”）。 （2）据表分析，低温处理能抑制光合作用的原因主要包括两方面：一方面是低温导致______，从而引起光反应生成的ATP、NADPH少；另一方面，低温使______降低，从而导致暗反应速率降低。 8.在温度和光照等适宜的条件下，将A、B两种绿色植物分别放在相同的密闭玻璃容器中，容器 中O2浓度变化情况（如图）。回答下列问题： （1）当时间为b时，A、B两种绿色植物净光合作用强度______（填“是”、“否”或“不一定”）相等。 （2）a～b时间段，植物A光合速率的变化趋势是______，原因是______。 （3）b～c时间段，植物A所在的玻璃容器中O2浓度基本没有发生变化，是因为______。若将 A、B两种绿色植物置于同一密闭玻璃容器中，在光照等其他条件适宜的情况下，一段时间内， 生长首先受影响的植物是______（填“A”或“B”）。

基因的克隆、表达载体构建与功能验证

基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法） 一、基因克隆 ★事前三问 a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？ b.这个基因在哪种材料中扩增？ c.材料需要怎么处理？ ◎实验前准备工作 a.设计引物，准备材料， b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试 剂盒 c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准 备 ※基本流程 提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序 1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成 1.1叶片、根总RNA的提取 Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。 1）实验前准备 预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。 2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下： （1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，

移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 （2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。 （3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。 （5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。 （6）在≤12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。 （7）用≥1 ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在≤7500g，4℃离心5 min，弃上清。（8）室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100μl用枪头吸几次，55～60℃温育10 min使RNA溶解。 （9）配制以下体系： 10×DNase buffer 5 μl DNase I （RNase-free）（40 μg/μl） 1 μl RNasin Inhibitor（40 μg/μl） 1 μl Total RNA 70 μg 加去RNase水至总体积为50 μl （10）37 ℃水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100 μl，加入等体积氯仿抽提一次。（11）取上清，加入10 μl的3 mol/L NaAC溶液，200 μl的无水乙醇，-80 ℃沉淀30 min。 （12）2～8 ℃，12000g离心10 min，弃清液，干燥后取50μl无RNase的水溶解RNA。3）RNA的质量及纯度检测 （1）电泳检测取2ul RNA 与1 ul 10×Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。 （2）分光光度计RNA纯度检测 取1ul RNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/ A280 比值，估测RNA质 量。 4）cDNA第一条链的合成 按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA： 1）在Eppendorf管中配制下列混合液：

农业技术试验示范 (国家草品种区域试验)项目指南

农业技术试验示范（国家草品种区域试验）项目指南 为做好2016年农业部部门预算编制工作，农业部特印发2016年农业部部门预算项目指南。具体内容如下： 一、项目目标 通过继续组织实施国家草品种区域试验项目，对拟申请审定的新草品种区域适应性、丰产性、特异性、一致性、稳定性、抗逆性等进行科学、客观、公正的测试，对已审定的主要牧草品种生产性能进行较为全面的测试，为草品种审定登记和优良品种示范推广提供可靠的技术支撑，增加优良品种数量，提高优良品种比例，为落实国家重大草原政策提供技术支持和物质保障。 二、项目内容 （一）开展新品种区域试验。依托全国29个省区的53个试验站（点），对2012～2014年已参试和2015年新增参试品种区域适应性、丰产性等农艺性状进行多点联合测试。 （二）新品种“三性”测试。继续开展并完成紫花苜蓿等6类牧草品种“三性”田间测试技术验证完善和DNA指纹图谱辅助鉴定体系、指纹图库构建工作；新增启动鸭茅、羊草等牧草品种“三性”测试指南的编制和DNA指纹图谱辅助鉴定体系、指纹图库构建工作。 （三）参试品种抗性鉴定。对以耐盐碱为选育目标的苜蓿、碱茅等参试品种进行耐盐性专业鉴定。 （四）已审定苜蓿和多花黑麦草品种生产性能测试。对部分已审定苜蓿和多花黑麦草品种农艺、抗性性状进行综合测试，编制综合测评表，指导生产者科学选择优良品种。 （五）对照品种种子（种茎）扩繁。对项目实施急需的对照品种种子（种茎）进行扩繁，确保试验工作顺利开展。 三、实施区域 北京、天津、河北、山西、内蒙古、辽宁、吉林、黑龙江、江苏、安徽、福建、江西、山东、河南、湖北、湖南、广东、广西、海南、重庆、四川、贵州、云南、陕西、甘肃、青海、宁夏、新疆、西藏等省（区、市）。 四、资金使用方向 主要用于开展新品种区域试验、“三性”测试、抗性鉴定等工作过程中专业技术人员培训、土地租赁、田间雇工、专家技术指导、试验设施维护、专用材料购置、检验检测、信息统计分析、网络信息系统运行、差旅、会议等的支出。

如何申请植物新品种保护

如何申请植物新品种保护 为什么要申请植物新品种保护?申请植物新品种保护有利于科技创新，有利于调动相关企业和个人研究开发新品种的积极性，有利于提升农产品的市场竞争力。那么如何申请植物新品种保护?下文小编通过七问七答为您详细介绍解读。 1问：什么是植物新品种? 答：植物新品种是经过人工培育的或者对发现的野生植物加以开发，具有新颖性、特异性、一致性和稳定性的植物品种。 2问：什么是品种权?品种权保护的好处是什么? 答：品种权是知识产权的重要组成部分，是由国家植物新品种保护审批机关依照法律、法规的规定，赋予品种权人对其新品种的经济权利和精神权利的总称。申请品种权的新品种，可是新育成的品种，也可以是对发现的野生植物加以开发所形成的品种。品种权保护的好处是：有利于科技创新，有利于调动相关企业和个人研究开发新品种的积极性，有利于提升农产品的市场竞争力。 3问：授予品种权的条件是什么? 答：一个植物新品种要取得品种权，必须同时具备以下几个条件：一是该品种必须是国家植物新品种保护名录范围内的品种;二是该新品种必须是不违反国家法律、妨害公共利益或者破坏生态环境的品种;三是该新品种必须具有新颖性、特异性、一致性和稳定性，还应有适当命名。品种权保护要求新品种在品质、抗性等方面明显区别于已知品种，同时在申请保护前不能进行商业销售。 4问：目前我国植物新品种保护名录范围是哪些? 答：截至2008年10月，我国发布了农业植物品种保护名录七批、共74个属或种。具体名单如下：水稻、玉米、普通小麦、大豆、甘蓝型油菜、花生、甘薯、谷子、大白菜、马铃薯、普通番茄、黄瓜、辣椒属、普通西瓜、普通结球甘蓝、食用萝卜、春兰、菊属、石竹属、兰属、百合属、鹤望兰属、补血草属、紫花苜蓿、草地早熟禾、唐菖蒲属、酸模属、梨属、桃、荔枝、高粱、大麦属、苎麻属、苹果属、柑橘属、香蕉属、猕猴桃属、葡萄属、李、

真核细胞常见表达载体

真核细胞常见表达载体 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein V ector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。 5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞

运载体与基因表达载体的区别

运载体与基因表达载体的区别 1、不同点： ⑴“运载体”泛指基因工程操作中能将目的基因送达受体细胞的工具。如细菌质粒等。 相对“基因表达载体”而言，“运载体”主要是强调它能运输目的基因这一功能，只要能运输目的基因就算是运载体，并不计较是不是真正运输了目的基因。 ⑵“基因表达载体”，是实施了运输目的基因、并且要保证目的基因到达受体细胞后能够表达的运载体。 这样看来，运载体、基因表达载体二者之间就不能完全等同。 2、联系： “基因表达载体”是在”运载体”的基础上构建成的。 基因表达载体的构成：目的基因+ 启动子+ 终止子+ 标记基因。 3、表达载体上的启动子和终止子是本身具有还是后加上去的呢？ 这个问题，教科书中并没有明确说明，但我个人的观点是：这要看获取目的基因的方法，而问题的根源在于基因的结构。关于基因的结构，在新课程标准中也不再做为教学的要求了。 （人类）结构基因的基本结构：上游非编码区+ 启动子+ 编码区+ 终止子+ 下游非编码区 人类结构基因4个区域： ①前导区，位于编码区上游，相当于RNA5’末端非编码区（非翻译区）； ②编码区，包括外显子与内含子； ③尾部区，位于RNA3’编码区下游，相当于末端非编码区（非翻译区）； ④调控区，包括启动子和增强子等。基因编码区的两侧也称为侧翼顺序（图1－１）。 ⑴启动子：启动子（promoter）能促进转录过程。也有人将启动子称为“RNA聚合酶识别位点”。 包括下列几种不同顺序： ①TATA框（TATA box）：其一致顺序为TATAATAAT。它约在基因转录起始点上游约-30-50bp 处，基本上由A-T碱基对组成，是决定基因转录始的选择，为RNA聚合酶的结合处之一，RNA聚合酶与TATA框牢固结合之后才能开始转录。 ②CAAT框（CAAT box）：其一致顺序为GGGTCAATCT，是真核生物基因常有的调节区，位于转录起始点上游约-80-100bp处，可能也是RNA聚合酶的一个结合处，控制着转录起始的频率。 ③GC框（GC box）：有两个拷贝，位于CAAT框的两侧，由GGCGGG组成，是一个转录调节区，有激活转录的功能。 此外，RNA聚合酶Ⅲ负责转录tRNA的DNA和5SrDNA，其启动子位于转录的DNA 顺序中，称为下游启动子。

表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活

叶绿体表达载体--如何构建载体

如何构建载体 1 启动子的选用和改造 外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。 目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。 在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分重要的途径。例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。在植物基因工程研究中，这些人工组建的启动子发挥了重要作用。 2 增强翻译效率 为了增强外源基因的翻译效率，构建载体时一般要对基因进行修饰，主要考虑三方面内容： 2.1添加5｀-3｀-非翻译序列 许多实验已经发现，真核基因的5｀-3｀-非翻译序列（UTR）对基因的正常表达是非常必要的，该区段的缺失常会导致mRNA的稳定性和翻译水平显著下降。例如，在烟草花叶病毒（TMV）的126kDa 蛋白基因翻译起始位点上游，有一个由68bp核苷酸组成的Ω元件，这一元件为核糖体提供了新的结合位点，能使Gus基因的翻译活性提高数十倍。目前已有许多载体中外源基因的5｀-端添加了Ω翻译增强序列。Ingelbrecht等曾对多种基因的 3｀-端序列进行过研究，发现章鱼碱合成酶基因的3｀-端序列能使NPTII基因的瞬间表达提高20倍以上。另外，不同基因的3｀-端序列增进基因表达的效率有所不同，例如，rbcS3｀-端序列对基因表达的促进作用比查尔酮合酶基因的3｀-端序列高60倍。 2.2 优化起始密码周边序列 虽然起始密码子在生物界是通用的，然而，从不同生物来源的基因各有其特殊的起始密码周边序列。例如，植物起始密码子周边序列的典型特征是AACCAUGC,动物起始密码子周边序列为CACCAUG，原核生物的则与二者差别较大。Kozak详细研究过起始密码子ATG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响，并总结出在真核生物中，起始密码子周边序列为ACCATGG时转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称为Kozak序列，并被应用于表达载体的构建中。例如，有一个细菌的几丁质酶基因，原来的起始密码周边序列为UUUAUGG，当被修饰为ACCAUGG，其在烟草中的表达水平提高了8倍。因此，利用非植物来源的基因构建表达载体时，应根据植物起始密码子周边序列的特征加以修饰改造。 2.3对基因编码区加以改造

不同基因表达载体的优缺点 孟凡顺

不同基因表达达载体的优缺点 理化系生物技术班孟凡顺 进入21世纪以来，基因工程的发展越来越快，也越来越完整，作为新世纪生物科学前沿，基因工程的快速发展也大大的刺激了人们对科学知识的向往，走进基因工程，我们发现在基因工程的四大步骤，目的基因的获取，基因表达载体的构建，将基因表达载体打入受体细胞以及目的基因的监测与鉴定，这其中最重要的是也是最繁琐的莫过于第二步基因表达载体的构建，而在基因表达载体的构建这一过程中，最重要的无疑就是目的基因导入受体细胞，将目的基因导入受体细胞的关键就是运载体的选择，在这里，我们要对运载体的种类进行介绍。 首先我们要知道什么东西可以作为运载体，作为运载体又有哪些特征？ 首先，作为运载体的物质它必须可以进行自我复制，这样才可以在它与外源基因融合后，独立在宿主细胞中复制繁殖，其次有至少一个在融合外源基因后仍未被破坏的遗传表型，这便于将载体导入受体细胞后的识别与筛选，通常表现在为抗性与显色表型反应等，再次，载体上至少有一个限制性核酸内切酶的单一识别位点，这样方便了外源基因的插入，最后，要有适当的拷贝数，理论上在一定范围内，拷贝数量越多，越利于载体的制备，所有的基因工程中的表达载体都必须具有以上四个条件。 在这里，我介绍三种载体。 1质粒载体 质粒载体是基因工程中最常用的载体之一，它源于细菌，是一种源于染色体外却可以自由复制的小型环状DNA，大小在1~200Kb之间，质粒通常含有一些编码对细菌有利生存的基因也含有抗生素的抗性基因，经科学家多年的努力，人们终于对一些质粒的生物学特征有了一些了解，进行了比较详尽的研究，比如F质粒那F基因或性质粒，R质粒即抗性因子和col质粒即大肠杆菌因子。 其实，一个质粒就是一个复制子，复制子往往有宿主专一性，但奇怪的是，人们也发现了可以在两种不同宿主内复制的复制子，即可构建的穿梭载体，这种新型载体的发现，大大的推进了克隆

运载体与基因表达载体的区别

运载体与基因表达载体地区别 、不同点： ⑴ “运载体”泛指基因工程操作中能将目地基因送达受体细胞地工具.如细菌质粒等. 相对“基因表达载体”而言，“运载体”主要是强调它能运输目地基因这一功能，只要能运输目地基因就算是运载体，并不计较是不是真正运输了目地基因.文档收集自网络，仅用于个人学习 ⑵“基因表达载体”，是实施了运输目地基因、并且要保证目地基因到达受体细胞后能够表达地运载体. 这样看来，运载体、基因表达载体二者之间就不能完全等同. 、联系： “基因表达载体”是在”运载体”地基础上构建成地. 基因表达载体地构成：目地基因启动子终止子标记基因. 、表达载体上地启动子和终止子是本身具有还是后加上去地呢？ 这个问题，教科书中并没有明确说明，但我个人地观点是：这要看获取目地基因地方法，而问题地根源在于基因地结构.关于基因地结构，在新课程标准中也不再做为教学地要求了.文档收集自网络，仅用于个人学习 （人类）结构基因地基本结构：上游非编码区启动子编码区终止子下游非编码区 人类结构基因个区域： ①前导区，位于编码区上游，相当于’末端非编码区（非翻译区）； ②编码区，包括外显子与内含子； ③尾部区，位于’编码区下游，相当于末端非编码区（非翻译区）； ④调控区，包括启动子和增强子等.基因编码区地两侧也称为侧翼顺序（图－１）. ⑴启动子：启动子（）能促进转录过程.也有人将启动子称为“聚合酶识别位点”. 包括下列几种不同顺序： ① 框（）：其一致顺序为.它约在基因转录起始点上游约处，基本上由碱基对组成，是决定基因转录始地选择，为聚合酶地结合处之一，聚合酶与框牢固结合之后才能开始转录.文档收集自网络，仅用于个人学习 ② 框（）：其一致顺序为，是真核生物基因常有地调节区，位于转录起始点上游约处，可能也是聚合酶地一个结合处，控制着转录起始地频率.文档收集自网络，仅用于个人学习 ③ 框（）：有两个拷贝，位于框地两侧，由组成，是一个转录调节区，有激活转录地功能.文档收集自网络，仅用于个人学习 此外，聚合酶Ⅲ负责转录地和，其启动子位于转录地顺序中，称为下游启动子.文档收集自网络，仅用于个人学习 ⑵终止子：在一个基因地末端往往有一段特定顺序，它具有转录终止地功能，这段终止信号地顺序称为终止子（）.文档收集自网络，仅用于个人学习 终止子地共同顺序特征是在转录终止点之前有一段回文顺序，约核苷酸对.回文顺序地两个重复部分由几个不重复碱基对地不重复节段隔开，回文顺序地对称轴一般距转录终止点.文档收集自网络，仅用于个人学习

真核细胞常见的表达载体及真核细胞表达外源基因的调控

真核细胞常见表达载体 1. pCMVp-NEO-BAN载体 特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507 图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域： Ase1.pCMV…ccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+ Nhe1 Age1 3. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV 启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。

(完整word版)基因表达载体构建

一、简述原核生物和真核生物基因表达调控的异同点，并说明基因表达调控与基因工程表达载体构建的关系。 1．原核生物和真核生物基因表达调控的共同点： （1）结构基因均有调控序列； （2）表达过程都具有复杂性，表现为多环节。 2．不同点： 原核生物：（1）RNA聚合酶只有一种，其σ因子决定RNA聚合酶识别特异性；（2）操纵子模型的普遍性；（3）阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性（负性调节占主导）；（4）转录和翻译偶联进行；（5）转录后修饰、加工过程简单；（6）转录起始是基因表达调控的关键环节。 真核基因表达调控特点：（1）RNA聚合酶有三种，分别负责三种RNA转录，每种RNA聚合酶由约10个亚基组成；（2）活性染色质结构发生变化；（3）正性调节占主导；（4）转录和翻译分隔进行；（5）转录后修饰、加工过程较复杂；（6）转录起始是基因表达调控的关键环节。 3.由于基因的表达调控受到多种因子的影响，而构建基因工程表达载体时多是将真和生物的目的基因转入到原核生物载体上表达，所以应注意以下几点： （1）外源基因插入序列必须保持正确的方向和阅读框架。其遗传密码不得缺失、遗漏、或错位及错码。否则会导致编码错误的蛋白质分子，特别是目的基因序列内部应不含两端酶切位点的识别序列。 （2）插入的外源基因必须放在原核的启动子控制之下，也就是使原核的RNA 聚合酶能够识别插入的基因。 （3）外源基因必须能在大肠杆菌中进行有效转录（如无内含子），转录后的mRNA 在菌体必须相当稳定，并且能有效地进行翻译，转译的蛋白分子在菌体内不致于受菌体蛋白酶的降解。 二、目的基因功能和表达分析的意义是什么？目的基因功能与表达分析的主要环节有哪些？各有什么目的？这些环节与基因工程的主要环节有什么异同？ 1．意义：克隆的目的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能及基因表达调控的机理，明了其利用价值和途径。 2．主要环节： （1）目的基因的获得和加工：将得到的目的基因通过加工以期能连接到表达载体上并稳定表达； （2）载体的选择与加工：根据不同的实验目的和实验条件选择不同的载体，并

基因表达载体的构建(2)

基因工程（2）---------基因工程的原理及技术 教学要求： （A级，课标要求：1简述基因工程基本操作程序的四个步骤；2、简述目的基因的获得、运载体的构建、目的基因的导入与检测等常用的方法及其基本原理。） 教材分析与教学构想 (1)理论分析：本课时基因工程的基本操作程序是苏教版选修3第一章基因工程中第1节内容。上节课学习了基因工程的概念含义、基因工程的诞生历程、DNA重组技术的基本工具及其作用、特点等内容，本课时要在上节内容的基础上理解基因工程基本操作程序。本课主要的学习任务是：理解基因工程每一步操作的原理、方法和过程，从整体上把握基因工程的全过程，将上节课学习的零散的知识进行归纳，把已掌握的知识系统化。 （2）学情分析：学生通过上节课的学习对基因工程的概念含义、基因工程的诞生历程、DNA 重组技术的基本工具及其作用、特点等有了深入了解，学习本课内容重要的是对基因工程每一步操作的原理、方法和过程做到了理解，同时将零散的知识进行归纳从整体上把握基因工程的全过程，这对学生的思维和方法都是很好的训练。 （3）教学设计构想： 1、巧妙运用插图及多媒体技术，化“抽象”为“形象”。对于基因工程的全过程，学生接触了解的少，只运用文字来教学会感到很抽象。如在讲授如何构建基因文库时，教师会提供一幅非常形象的插图，结合图文提出相应问题，诱导学生思考，从而把学习的注意力从简单的死记硬背引导到分析、批判、创新等有利于学生终身发展的能力上来。 2、巧妙利用概念图串联知识，化“部分”为“整体”。概念不可能单独存在，每个概念都必须根据与之有关的其他概念间的关系才能确定其准确的含义。通过分步探讨，学生已经对基因工程每一步操作的原理、方法和过程做到了理解，但并未从整体上把握到基因工程的全过程，教师可以指导学生构建概念图，将零散的知识进行归纳，把已掌握的知识显性化、可视化，实现新课程有效教与学的策略。 一、自主学习 基因工程操作步骤：. （1）获取目的基因的方法有. （3）基因表达载体的构建关键步骤是，基因表达载体的组成： 。（3）将目的基因导入受体细胞：基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。动物常把细胞作为受体细胞。导入植物细胞的方法有等；农杆菌转化法可以将目的基因导入细胞并把其整合到受体细胞的上，导入动物细胞的方法有；如果运载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用处理，以增大细菌的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制，由于，在很短的时间内就能够获得大量的目的基因。 （4）、检测目的基因是否进入受体细胞可以用方法，用方法检测目的基因是否转录，用免疫（）法检测目的基因是否表达。另外也可进行个体水平检测。如 4、基因拼接成功的原因； 转基因表达成功的原因是生物。 基因工程的意义：

叶绿体表达载体--如何构建载体

如何构建载体 1启动子的选用和改造 外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。 目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。 在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分重要的途径。例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。在植物基因工程研究中，这些人工组建的启动子发挥了重要作用。 2增强翻译效率 为了增强外源基因的翻译效率，构建载体时一般要对基因进行修饰，主要考虑三方面内容：2.1添加5｀-3｀-非翻译序列 许多实验已经发现，真核基因的5｀-3｀-非翻译序列（UTR）对基因的正常表达是非常必要的，该区段的缺失常会导致mRNA的稳定性和翻译水平显著下降。例如，在烟草花叶病毒（TMV）的126kDa蛋白基因翻译起始位点上游，有一个由68bp核苷酸组成的Ω元件，这一元件为核糖体提供了新的结合位点，能使Gus基因的翻译活性提高数十倍。目前已有许多载体中外源基因的5｀-端添加了Ω翻译增强序列。Ingelbrecht等曾对多种基因的3｀-端序列进行过研究，发现章鱼碱合成酶基因的3｀-端序列能使NPTII基因的瞬间表达提高20倍以上。另外，不同基因的3｀-端序列增进基因表达的效率有所不同，例如，rbcS3｀-端序列对基因表达的促进作用比查尔酮合酶基因的3｀-端序列高60倍。 2.2优化起始密码周边序列 虽然起始密码子在生物界是通用的，然而，从不同生物来源的基因各有其特殊的起始密码周边序列。例如，植物起始密码子周边序列的典型特征是AACCAUGC,动物起始密码子周边序列为CACCAUG，原核生物的则与二者差别较大。Kozak详细研究过起始密码子ATG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响，并总结出在真核生物中，起始密码子周边序列为ACCATGG时转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称