多克隆抗体
第六章多克隆抗体
传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经不同途径免疫动物，由于抗原性物质具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，所以称这种免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体(polyclonal antibody，PcAb)。多克隆抗体的亲和力较一般单克隆抗体高。多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为制备高效价和高特异性的多克隆抗体，必须要有理想的免疫原、适宜的动物及切实可行的免疫方法。本章主要介绍多克隆抗体的制备及相关技术。
第一节动物选择
实验动物是生物医学中的重要组成部分。目前常用于生物医学科学研究的实验动物种类很多，主要包括有两栖纲的青蛙、蟾蜍，鸟纲的鸡、鸭、鸽等，哺乳纲啮齿目的小鼠、大鼠、豚鼠等，兔形目的家兔，食肉目的猫、狗，有蹄目的羊、猪和灵长目的恒河猴、猩猩、绒猴等。其中最常用和用量最大的是哺乳纲啮齿目动物，其次是兔形目和食肉目等。
一、实验动物的生物学特性
实验动物选择得当与否是实验研究成败关键之一。掌握实验动物的生物学特性，则能以最佳的设计选择实验动物，进行科学实验，从而获得预期的实验结果。
1. 小鼠小鼠是啮齿目中体型较小的动物。新生小鼠1.5g左右，21天断乳时12～15g，1.5至2月龄体重达20g以上，可供实验使用。成年雌小鼠体重18~35g，成年雄鼠体重20~40g。小鼠性情温顺，易于捕捉，对外来刺激敏感，喜群居于阴暗环境。
2．兔草食性动物，性情温顺，胆小易惊，喜居安静、清洁、干燥、凉爽、空气新鲜的环境，耐冷不耐热，耐于不耐湿。兔耳大，表面分布有清晰的血管。有特殊的血清型和唾液型，血清型分为α'、β'、α'β'和O型四种。α'、α'β'型易产生人A型抗体，β'、O型易产生人B型抗体。唾液型分两种：排出型与非排出型。排出型易获得人血细胞A型物质，非排出型不易获得，这种A型物质与A型抗体产生能力有关。因此，要获得A型抗体，应选用排出型的α'、α'β'血清型兔。由于抗原刺激机体后，体液免疫应答反应强烈，故兔被广泛用于制备高效价的特异性强的免疫血清。
3．豚鼠草食动物，性情温顺，胆小，对外界刺激极为敏感，喜居干燥、清洁的环境。自动调节体温的能力较差，对环境温度变化较为敏感，最适宜的温度为18~20℃，对抗生素敏感。
4．羊草食动物，性情温顺，合群，易于接近，喜居干燥、清洁的环境，怕潮湿，怕热不怕
冷，寿命为15年。山羊可用于生产多种抗血清，也可用于营养学、免疫学、微生物学、生理学
等方面的研究。绵羊常用作制备抗血清，其红细胞是血液学诊断中最常用的材料。
二、选择实验动物的原则
1．3R原则3R指的是reduction(减少)、replacement(替代)和refinement(优化)。“减少”指减少实验用的动物和实验的次数；“替代”指尽可能采用可以替换实验动物的替代物；“优化”指对待实验动物和动物实验工作应做到尽善尽美。
2．从微生物学和寄生虫学标准去选择实验动物要求选用三级的实验动物，原因是三级实验动物已经排除了人兽共患疾病，排除了实验动物本身的传染病，也排除了影响实验研究的相应微生物和寄生虫，使实验研究处于没有或很少有外源干扰的情况下进行。
3．从遗传学的观点选择实验动物即根据动物的不同生物学特性选择适宜的实验动物。
4．不能忽略的一些因素如性别、年龄、体重、营养状况、饲养环境等。
三、免疫动物的选择
可作为免疫用的动物主要是哺乳类和禽类，常选用的有家兔、绵羊、豚鼠、马、鸡等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗体的数量和用途，如制备抗γ-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清。具体选择时，应考虑以下因素：
(一)动物种系
免疫学理论研究已经证实：机体的免疫应答受遗传基因的控制。同一种系不同个体对不同抗原的免疫应答以及不同种系对同一抗原的免疫应答均不尽相同。一般认为，抗原与免疫动物种属的差异越远越好，亲缘关系太近不易产生抗体应答(如兔一大鼠之间，鸡-鸭之间)。实验中最常用的动物是家兔，因它与人类的交叉较少。
(二)动物个体的选择
由于个体差异的存在，同一抗原免疫同一种系不同个体的动物，产生的抗体效价有很大的差异，这与动物的年龄及营养状况密切相关。用于免疫的动物应适龄、健壮、无感染性疾患，体重合乎要求，如用家兔，应选择年龄在6个月以上，体重以2-3kg为宜。
(三)抗血清的需要量
需要大量制备免疫血清时，应选用马、驴、绵羊等大型动物，如一头成年马反复采血可获得10 000ml 以上的抗血清。若需要量不多，则可选用豚鼠、家兔等小动物。
(四)抗原性质
不同种类的动物对同一种抗原有不同的免疫应答表现。因此，对不同性质的免疫原，所选用的动物有所不同。蛋白质类抗原对大部分动物皆适合，常选用家兔和山羊。但在某些动物体内有类似的物质或其他原因，对这些动物免疫原性极差，如IgE对绵羊，胰岛素对家兔，多种酶类(如胃蛋白酶原等)对山羊等，免疫时皆不易出现抗体，这些物质有时可用豚鼠(如胰岛素等)、火鸡，甚至猪、狗、猫等做试验免疫。
(五)免疫血清的要求
按免疫动物的种类不同，所获免疫血清可分为两大类，即R型(rabbit)和H型(horse)。R型是用兔及其他动物免疫产生的抗体，H型是用马以蛋白质类抗原免疫获取的抗体。在免疫扩散实验中，R型免疫血清能和很小量的抗原结合，形成肉眼可见的沉淀线，具有较宽的抗原抗体合适比例范围，只有抗原过量时才形成可溶性复合物，使沉淀线减弱或消失。而H型免疫血清的抗原抗体适合反应的比例范围较狭窄，抗原或抗体过量时易形成可溶性复合物，均不出现可见的沉淀反应，在沉淀反应中难以掌握，因而极少应用，人和许多大型动物皆属此型。
此外，动物免疫后还要认真做好编号、标记、管理和记录，注意动物的体温、体重、呼吸、粪便是否正常，注射部位的变化及是否有其他异常表现等。
第二节抗原的剂量与免疫途径
抗原初次进入具有应答能力的动物体内需经过一段较长的潜伏期(一般为7～10天)才能出现抗体，经过一段高峰期后，抗体量逐渐下降直至消失，这段时间总的抗体生成量是较低的，主要成分为IgM，称为机体对抗原的“初次应答”。但当相同抗原再次进入同一动物体内时，血清中的抗体很快出现，并迅速到达高峰期，持续较长时间后才逐渐下降。这一次抗体的含量远高于初次应答，其成分主要是高亲和力的IgG，称为“再次应答”。由此可知，要获得高效价的抗血清，不仅与免疫剂量有关，而且免疫方法、接种途径和免疫的间隔时间等均至关重要。
一、抗原剂量
抗原剂量的选择应考虑抗原性强弱、分子质量大小、注射途径、免疫时间及动物的个体状态等因素。抗原剂量过低不能形成足够强的免疫刺激，剂量过高，又有可能造成免疫麻痹。在一定范围内，抗原量与免疫反应强度成正相关。一般而言，对于蛋白质抗原，小鼠首次剂量为50~400μg／次，大鼠为0.1～1mg ／次，兔为0.2～1mg／次；对于细胞抗原，每次用于免疫羊的细胞数一般不低于1×108，免疫兔不低于1×107，免疫小鼠不低于1×106。第一次免疫剂量宜小，随后可增大抗原剂量。
加强注射剂量，依据抗原的性质不同而不同。有的抗原用量与首次剂量相同或增加一倍，有的则减少一半。加强免疫通常用不完全佐剂乳化。如果抗原的免疫原性弱，需多次加强才能获得满意的抗血清。
为了增强免疫反应，可以把免疫佐剂注射到接种抗原结合部位的附近或对侧，或者先注射佐剂，再注射抗原。如用可溶性蛋白质抗原免疫家兔，在加用佐剂后一次注入量一般为0.5~1mg／kg。如不加佐剂，则抗原剂量应加大10～20倍。用半抗原免疫时，使用的载体必须始终相同，以免影响淋巴细胞的识别功能。
下面是几种成功的免疫方案。
1．家兔初次免疫用50～200μg蛋白加入福氏完全佐剂，在背部皮下注射6～8点，每点0.1～0.2ml，
也可肌内或皮内注射。每隔10天用50～200μg蛋白于PBS或福氏不完全佐剂中，在肌内、皮下、静脉或腹腔内注射加强免疫一次，每点0.25～2ml。
2．豚鼠和大鼠初次免疫用10～100μg蛋白加入福氏完全佐剂，在背部皮内注射4~6点，每点0.1ml，也可肌内或皮下注射，每隔7~8天用10~50μg蛋白于PBS或福氏不完全佐剂中，在肌内、皮下或静脉注射，加强免疫一次，每点0.25～2ml。
3．小鼠与大鼠一样，但每次免疫量用5~50μg蛋白。
4．绵羊或山羊初次免疫用0.5~10mg蛋白加入福氏完全佐剂，在肌内、皮下或皮内注射4~6点，每点0.2～2ml。14～28天后用0.5~10mg蛋白于PBS或福氏不完全佐剂中，在肌内、皮下或静脉注射，加强免疫一次，每点0.25～2ml。有时可用较少量的抗原，特别是在免疫间隔较长的情况下。
二、免疫途径
抗原的进入途径决定了抗原吸收、分布和代谢的速度，吸收越快，分解代谢越快，对机体的影响时间越短。吸收越快，单位时间内的有效抗原量就越大，机体的免疫应答就越强，不良反应也越强。应根据不同抗原及实验要求选择不同的注射途径。注射途径多种多样，常用的注射途径有皮内、皮下、肌内、静脉、腹腔、脾脏、淋巴结。对抗原的吸收速度为：静脉=脾脏=淋巴结>腹腔>肌内>皮下>皮内。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
免疫时一般采用多点注射，如足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。皮内易引起细胞免疫反应，对提高抗体的产生很有利。通常认为半抗原适宜采用皮肤多点注射(一般注射40点左右)。但皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入(因佐剂加入后黏度较大)。静脉或腹腔注射后抗原能很快进入血流，一般多用于颗粒性抗原的免疫和加强注射，如抗原昂贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10～100μg抗原即可获得较好的免疫效果。方法是先用不完全佐剂在动物足部做基础免疫，10~15天后可见肘窝处有肿大的淋巴结(有时可在腹股沟处触及)，用两手指固定好淋巴结，消毒后用微量注射器直接注射人抗原(一般不需要佐剂)。
三、间隔时间
免疫间隔时间也是重要因素之一。第一次免疫后，因动物机体正处于识别抗原和B细胞增殖阶段，如很快接着第二次注入抗原，极易造成免疫抑制。一般以间隔10～20天为好。两次以后每次的间隔一般为7～10天，不能太长，以防刺激变弱，产生的抗体效价不高。对于半抗原的免疫间隔则要求较长，有的报告1个月，有的长达40～50天，这是因为半抗原是小分子，难以刺激机体发生免疫反应之故。免疫的总次数多，多为5~8次。如为蛋白质抗原，第8次免疫未获得抗体，可在30～50天后再追加免疫一次；如仍不能产生抗体，则应更换动物。半抗原需经长时间的免疫才能产生高效价抗体，有时总时间为一年以上。
第三节免疫程序
免疫程序应根据设计的目的和要求、抗原性质、佐剂的种类等而制定。一般而言，如需制备高度特异性的抗血清，可选用低剂量抗原短程免疫法；反之，欲获得高效价的抗血清，宜采用大剂量抗原长程免疫法。常规免疫方案为抗原加CFA皮下多点注射进行基础免疫，再以免疫原加IFA做2~5次加强免疫，每次间隔2～3周，皮下或腹腔注射加强免疫。完成免疫程序后，先取少量血清检测抗体效价，达到要求后即可经心脏、颈动脉或颈静脉放血获取多克隆抗体。
以家兔为例，免疫方案包括以下几种：
1．全量免疫法首次于家兔脚掌皮下注射福氏完全佐剂抗原1～10mg，1～2周后在皮下注射福氏不完全佐剂抗原1~10mg，以后每隔一周皮下多点注射1～10mg，共4~5周，5周后试血，如合格即可放血。
2．微量免疫法于家兔两足掌皮下注射活卡介苗，每只约10mg，7~10天后于胭窝淋巴结注入完全佐剂抗原100~200μg，1个月后再注入抗原400—600μg，8~10天试血。
3．淋巴结免疫法主要为胭窝淋巴结。为了使淋巴结肿大，可在其邻近注射活卡介苗，如家兔可预先在双后足掌，每侧注入活卡介苗(75mg／ml)0.3ml。1～2周后淋巴结肿大，如黄豆大或蚕豆大。用两个手指固定淋巴结可注入福氏完全佐剂抗原0.5ml，两周后再重复一次。
4．混合免疫法此法综合足掌皮下、淋巴结和静脉途径进行免疫，具有抗原用量小、产生抗体效价高的优点。其方法是先于家兔双足掌皮下注射福氏不完全佐剂抗原混合物[羊毛脂：石蜡油：抗原(5mg／ml)=1：4：5]各0.5ml，两周后于双侧后肢肿大的胭窝淋巴结内各注入0.5ml同样抗原制剂，第三周于耳静
脉采血测试效价。若效价不高，可用不加佐剂的抗原(5mg／ml)通过耳静脉以加强免疫，一周内注射3次，分别为0.1、0.3、0.5ml，一周后再次采血测试效价。
下面分别以可溶性蛋白抗原和颗粒性抗原免疫为例详述之。
一、可溶性蛋白抗原
以可溶性蛋白抗原(人IgG抗体)免疫家兔为例，具体免疫程序如下：
1．抗原制备将纯化的人IgG 1mg用1～2ml PBS或生理盐水稀释后与等体积无菌CFA分别装入两支注射器中，用三通阀连接两注射器，反复推拉混合，使之完全乳化。可将乳化好的抗原滴一滴人冷水中进行检测，无油滴扩散即符合要求。
2．免疫动物健康雄性家兔3只，体重2.5～3kg。
3．免疫方法最常用方法为家兔背部及后腿肌肉、皮下多点注射。第一次免疫后间隔3～5周再以IgG 1mg/ml抗原加等体积IFA乳化后注入后腿肌肉或背部皮下多点加强免疫。以后间隔7～10天用抗原加强一次，约2~3次后试血。
4．试血末次注射后第7天取少量静脉血，分离血清，用环状沉淀实验测定抗体效价达1：5000以上(稀释抗原)，或用琼脂双向扩散实验测定抗体效价达1：16以上(稀释抗体)，即可放血，如效价不高，继续加大剂量，加强1～2次后，常可使效价增高。
5．多克隆抗体的采集在放血前动物应禁食24小时，以防血脂过高。目前常用的采血方法有以下三种：
(1)颈动脉放血法：这是目前最常用的一种方法，尤其在家兔、山羊和绵羊等动物采血时更为常用。此法放血量较多，动物不宜中途死亡。具体方法如下：
1)将动物仰面固定于动物固定架上，头部放低，暴露颈部。
2)沿颈部中线用2％普鲁卡因溶液局部麻醉，15分钟后剪开颈中部皮肤10cm长。沿气管钝性分离皮下组织，暴露气管前的胸锁乳突肌。
3)分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，在肌束下面靠近气管两侧，可见淡红色搏动的颈动脉，将双侧动脉仔细分离，于每侧动脉分别套入两根丝线，一根在远心端，一根在向心端。
4)腹腔内注射肾上腺素1mg，以升高血压，加快心率，避免因放血后血压降低造成凝集而影响取血量。
5)先将一侧动脉远心端丝线结扎紧，然后再向心端用止血钳夹住(止血钳头部用细塑料管包裹，避免损伤动脉)。用小的尖头剪刀在两侧丝线中间的动脉壁上剪开一小口，以便插入塑料放血管，再用向心端丝线固定，避免放血管从动脉内滑出。
6)轻轻松开止血钳，使血液很快射入玻璃瓶皿，直至血流缓慢点滴而出时，以同法在对侧动脉内插管放血，并将动物固定架后端抬高，增加放血量，一般一只家兔可放血80~100ml。
(2)心脏采血法：将动物做仰卧位或垂直位固定，剪去左胸部毛，消毒皮肤，用食指触其胸壁探明心脏搏动最明显处，用16号针头在预定部位与胸壁呈45。角刺入，针头刺中心脏时有明显的搏动感。待见到血液进入针筒后，即将注射器固定并往外抽血，一只家兔一次可取血20~30ml。此法常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等动物。本法要求操作技术熟练，否则穿刺不当，易引起动物死亡。
(3)静脉采血法：家兔可用耳中央静脉，山羊和绵羊可用颈静脉。这种放血法可隔日一次，有时可采集多量血液。如用耳静脉切开法，一只家兔可采血百余毫升。一只绵羊经颈静脉采血时，一次可放血300ml 左右。放血后立即回输100g／L葡萄糖盐水，3天后仍可采血200~300mll。动物休息一周，再加强免疫一次，又可采血两次。如此进行，一只羊可获1500~2000ml血液。
家兔耳静脉的放血方法是，首先剪去兔耳缘的毛，用少许二甲苯涂搽耳郭以刺激其血管的扩张和充血。用手轻拉耳尖，以单面剃须刀或尖的手术刀片快速切开静脉，血液即可流出，每次可收集30～40ml。然后用棉球压迫止血，凝血后洗去二甲苯。两周后可在另一耳放血。
小自鼠取血通常采取摘除眼球或断尾法，每只可获血量在1～1.5ml。
6．血清分离采血后应尽快将血清与血细胞分离。否则细胞溶解释放出的蛋白水解酶等杂蛋白会污染抗体并将抗体水解，降低效价。
(1)从血液中直接分离血清：血液置室温中凝固约1小时，然后置4℃过夜，使血块收缩。将血块自容器壁分离，将血清全部倾人离心管，在4℃下2500g离心30分钟，取上清液即血清部分与前面的血清混合。4℃1500g离心全部分离的血清部分。将血清分装存于-20℃或-70℃冰箱内，也可加抑菌剂存于4℃条件下。
但鸡血清不宜冻存。大鼠和小鼠的免疫球蛋白与其他动物相比较不稳定，因此当血液凝固后应立即分离血清。
(2)由血浆分离血清：如果血液中加了抗凝剂分离到血浆，可将血浆脱纤维以制备血清。这样可以去除一些污染物，如凝血因子，并且在操作过程中标本不会凝固。但脱纤维过程中一些蛋白可被内源性蛋白酶降解。具体方法是：
1)从酸性枸橼酸盐-葡萄糖抗凝血浆中分离血清：将血浆温育到37℃，加1／100体积的凝血酶溶液(凝血酶溶于1mol／L的氯化钙中，100U／ml)。用力搅拌促使凝块形成，置37℃温育10分钟，然后置室温1小时使凝块形成完全。40 000g离心15分钟，按前述方法保存血清。
2)肝索抗凝血浆的血清分离：与酸性枸橼酸盐-葡萄糖抗凝血浆中分离血清基本相同，但所加1／100体积的凝血酶溶液中含5mg/ml鱼精蛋白硫酸盐，如果凝块形成较慢，可适当加一些鱼精蛋白硫酸盐使凝块形成加快。
二、颗粒性抗原
以兔抗变形杆菌抗体的制备为例，简述其过程：
1．抗原制备斜面生长的抗原性完整的菌体，用0.3％甲醛盐水制成浓悬液，37℃孵育24小时，无菌实验合格后用盐水稀释至1×1010个细菌／ml，置4℃备用。
2．免疫动物健康雄性家兔3只，体重2.5—3kg。取少量静脉血分离血清，与抗原做凝集实验，检测有无天然凝集素存在。如果结果未达到阳性(+)，则该动物可以使用。
3．免疫方法最常用的免疫途径为耳静脉注射，每次注射剂量约为109～1010个细菌，每周注射2~3次，共3~5周(表6-1)。末次注射后第7天试血。一般动物免疫后可有发热、食欲减退、一般状况欠佳等不良反应，应注意观察。根据动物状况调整剂量、间隔时间或改变注射途径。
表6-1 变形杆菌的注射剂量和日程
日期第1日第3日第6日第9日第12日
注射剂量(ml) 0.3 0.5 1.0 1.5 2.0
注：每ml含1×1010个细菌。
4．试血末次注射后第7天取少量静脉血，分离血清，与抗原做凝集实验，如果抗血清效价>1：2000即可放血。如效价达不到要求，继续加大剂量静脉加强1～3次后，常可使效价明显增高。重复试血符合要求后，颈动脉放血，分离血清，分装，储存备用。
三、注意事项
(1)免疫用实验动物的抗体反应性个体差异较大，因此免疫时至少应选用两只以上动物。另外，不能使用妊娠动物。
(2)佐剂一方面可提高特异性免疫反应的效果，获得高效价的免疫血清，但若抗原不纯，也可使抗原中极微量的污染物(0.005mg)产生抗体，以至免疫血清的纯度受到影响。另外，有些实验动物种系对卡介苗过敏，尤其是豚鼠和家兔，当再次注射完全佐剂时，可以引起变态反应而导致免疫失败。为此，第二次免疫时应减少佐剂中的卡介苗含量或改用不完全佐剂，以减少和防止变态反应的发生。
(3)有时不能获得满意的抗血清，可以从以下几方面找原因，并改进之。
1)免疫原是否符合要求，可从耦联剂、载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进。
2)免疫的方法、剂量、加强免疫的间隔时间和次数、免疫的途径是否合适。
3)所用的佐剂是否合适，乳化是否完全。
4)免疫动物的种属和品系是否合适，如不合适可考虑改变动物的种属或品系，或扩大免疫动物的数量。
5)动物的饲养是否得当，环境卫生是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。
第四节抗血清的效价测定与保存
抗体效价高低、特异性强弱及亲和力大小是判断免疫血清质量优劣的主要标准。免疫血清在保存或应用之前、纯化之后以及在动物免疫的后期(采血做抗体效价滴度以决定采血的时机)都必须进行抗体活性的
鉴定。
一、抗血清的效价测定
抗血清的效价测定，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价的测定可根据抗体的不同性质，分别采用放射免疫法、琼脂双向扩散、环状沉淀实验、单向免疫扩散、溶血实验、凝集反应、酶联免疫等方法。目前常用的是放射免疫法和琼脂双向扩散，前者测定的效价极为精确，而后者要粗糙得多。
(一)放射免疫法
以不同稀释度的抗血清与标记抗原混合，孵育24小时后，测定其结合率。通常以结合率为50％的血清稀释度为效价。如某抗血清的结合率为50％时的稀释度为1：15 000，则该血清的效价就是1：15 000。抗血清的效价除由抗血清本身的性质决定外，还受标记抗原的质量、孵育时间、所用稀释液的成分及pH 等因素的影响，在实验中应加以重视。
(二)双向免疫扩散法
利用抗原和抗体可以在琼脂板上从浓度高处向浓度低处扩散，两者在相遇处形成抗原抗体复合物呈现一条沉淀线，根据沉淀线的位置即可鉴定抗血清的效价及纯度。
测定抗血清效价有两种稀释方法：一是稀释抗血清，如1／2、1／4、1／8、1／16对倍稀释，分别与一个浓度的纯抗原反应；另一是稀释抗原，印把抗原做对倍稀释或按浓度(如mg／ml)进行稀释，分别与不同浓度的抗血清进行双向扩散试验(称为棋盘滴定)(表6-2)。
表6-2 抗血清效价测定
抗原
抗血清
不稀释1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128
不稀释+++ +++ +++ ++ ++ + - -
1/2 +++ +++ +++ ++ ++ + - -
1/4 +++ +++ +++ ++ ++ + - -
1/8 +++ ++ ++ ++ + + - -
1/16 ++ ++ ++ + + + - -
1/32 + + + + - - - -
1/64 + + + + - - - -
琼脂板的制备：将琼脂糖用生理盐水配成1.25％的溶液，加0.02％叠氮钠抑菌，用时于水浴中加热使琼脂完全溶解，用移液管把琼脂浇注在一张载玻片上，待琼脂硬化后，用中空(0.3～0.5mm直径)打孔器打孔，各孔间距应在0.8~1cm之间。继而在中央孔内加适量抗原，周围各孔内加不同稀释度的抗血清，置湿盒中于37℃孵育24~48小时。
结果观察：表中+~+++代表出现沉淀线的浓度，如抗体1：8稀释时出现中等浓度沉淀线，而1：16、1：32稀释则出现较弱的沉淀线。一般而言，效价在1：8以上即可用于一般试验。
二、抗血清特异性和亲和性鉴定
主要采用双向免疫扩散、定量沉淀、免疫电泳和平衡透析法、饱和平衡法测定。具体方法详见第十三章。
三、抗血清的纯化
免疫血清纯化的目的是尽量除去抗血清中与目的抗体不相关的成分，以防止抗体外的其他血清成分对试验结果产生影响。因此，要根据不同的目的要求，从免疫血中除去容易干扰的有关成分，或提取相应的免疫球蛋白。
(一)杂抗体的除去
有亲和层析法和吸附法两种。亲和层析法是将交叉抗原交联到Sepharose 4B上，装柱后，将预吸收的抗体通过亲和层析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是单价的特异性抗体(单价特异性是指抗血清只与其特异性抗原发生反应)。吸附法是利用不含特异性抗原的抗原液，即不含用于免疫动物的抗原，而含有其他杂抗原的抗原液，如血清、组织液或已知的某种吸附剂。用双功能试剂将其交联，做成固相吸附剂，如用不
含甲胎蛋白的血清稀释一倍后，加入2.5％戊二醛溶液或丙酮醛，放冰箱过夜后，该血清成为胶胨状，将其打碎并用缓冲液经多次洗涤后，则成为颗粒状的凝胶吸附剂。用这种吸附剂直接加到免疫血清中(约1／10)，抗原则与杂抗体结合，上清液则成为无杂抗体的单价特异性抗体。有时因杂抗体太多，必须处理两次才能完全除去。吸收过的凝胶用3mol／L硫氰酸钾(或钠)洗涤，解脱杂抗体后可继续使用。有时杂抗原较少，其他蛋白质也少，加入戊二醛后不形成胶胨状。此时可加入无关蛋白(如牛血清白蛋白、兔血清白蛋白等，加人量应达到含蛋白的2％~3％为宜)进行交联即可达到目的。
(二)IgG类抗体的纯化
可用盐析法获得较纯的IgG，也可用离子交换层析、亲和层析等获取。具体方法参阅第十二章。
四、抗血清的保存
抗血清的保存有三种方法：第一种是4℃保存。将抗血清除菌后，液体状态保存于普通冰箱，可以存放3个月到半年，效价高时，一年之内不会影响使用。保存时要加入0.01％硫柳汞或0.1％叠氮钠以防腐，若加入半量的甘油则保存期可延长。第二种方法是低温保存，放在-20~-40℃，一般保存5年抗体效价不会有明显下降。抗体切忌反复冻融，反复冻融会使抗体效价显著降低。因此，低温保存应分装成小份，以备取出后在短期内用完。第三种方法是冰冰干燥。最后制品内水分不应高于0.2％，封装后可以长期保存，一般在冰箱中5～10年内效价不会明显降低。
(何小鹃吴林艳：Kin-Fu Zhou)
参考文献
巴德年．1998．当代免疫学技术与应用北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社
卢耀增．1995．实验动物学．北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社
沈关心，周汝麟．1998．现代免疫学实验技术．武汉：湖北科学技术出版社
杨廷彬，尹学念．1994．实用免疫学长春：长春出版社
单克隆抗体制备的基本原理
单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针
对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
多克隆抗体的制备,纯化及检测
实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳 【实验目的】 ⒈ 加深对抗体基本知识的了解。 ⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。 ⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。 一、多克隆抗体的制备 【实验原理】 当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。 将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。 免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。 【实验材料】 ⒈ 实验动物 初次抗原注射后的周次 0 1 2 3 4 5 6 7 初次免疫 二次免疫 血 清 中 抗 体 的 水 平
成年兔。 ⒉实验器材 特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。 ⒊实验试剂 ⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。 ⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂： 【实验方法】 ⒈抗原的制备 抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。如果多肽抗原在SDS/PAGE中为可见的单一带，抗原从凝胶中的抽提可作为纯化的最后一个步骤。 ⒉预放血 轻轻的将兔子放在特制兔盒中，处于放松状态的兔子采血会较容易。按压兔子耳根部直至血管突出,然后将针头插入耳部血管的中上部，观察到进针后小心推出活塞收集血液1ml -5ml。结束收集后，退出针头并按压伤处以制止血流，再用乙醇消毒。取收集的血液在37°C 恒温箱中放置30分钟以防止激活补体系统，再将试管在4°C放置过夜使血液凝固。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液在4°C保存。 ⒊注射抗原 ⑴准备两只成年兔，将100μg抗原/兔溶入1ml磷酸缓冲溶液中待用。在1ml福氏不完全佐剂中加入分枝杆菌制成完全佐剂，并加入1ml抗原溶液，剧烈震荡使之充分乳化，用3ml注射器抽取该乳化液，接上25G针头，排除注射器中的气泡。从笼中取出兔子放在平坦处，在4个不同的部位进行皮下注射，两处在后背，两处在大腿处。抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。捏出皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中，在4个不同部位分别各注射约500μl抗原溶液。注射结束后，将针在注射处放置几秒钟后再轻轻拔出，并用乙醇在注射处消毒。在4个部位重复上述操作。用相同方法免疫另一只家兔。 ⑵每4-6周注射抗原，并在注射后的7天-10天按照步骤2收集血液。将收集的血液与注射前收集的血液进行比较，检查是否有抗体产生。待确定产生抗体后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。 ⒋收集血液 ⑴将家兔轻轻放入固定架上,二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片倾斜45°在该处切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在结束之前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集。收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患处，轻按患处10秒-20秒确定血流停止后方可结束。
多克隆抗体制备
多克隆抗体制备 多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。【晶莱生物】 具体实验步骤如下： 1.兔子的准备 挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血. 预采血（作阴性参照用） 1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静； 1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)； 1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀； 1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)； 1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口； 1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清； 1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min； h.收集上清，即为血清。 2. 兔子的免疫 2.1注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。 2.2 将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色； 2.3 小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。 2.4 免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。 3.效价检测 3.1 2个参照:阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液);阳性参照为以前阳性血清 3.2 于96孔板中每孔滴加100ul，1ug/ml抗原，于4℃过夜，也可以37℃孵育2小时。3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200ul的封闭液，4℃过夜或者37℃孵育2小时。 3.4倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次,每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间, 37℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。 3.5取包被好的96孔板，第一孔加入阴性参照液100ul，第二孔加入阳性参照液100ul，第三孔加入1:500的待测抗血清，后续各孔在此基础上倍比稀释，于37℃孵育1 小时。 3.6倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的HRP标记的小鼠抗兔IgG（1：2000稀释），于37℃孵育45分钟。
单克隆抗体的制备及应用
单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫
多克隆抗体技术
第九章多克隆抗体技术 （Polyclone antibodies preparation technique） 一、概述 （一）多克隆抗体的概念 抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。 抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B 淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monclone antibody）。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD 等五类抗体。 （二）免疫动物 供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。动物的选择常根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关。如要获得大量的抗体，多采用大动物；如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体；如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备；一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备。 免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物，雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫抗体则非常不合适，有时甚至不产生抗体。由于对免疫应答的个别差异，免疫时应同时选用数只动物进行免疫。 抗原是多种多样的，而且千差万别。就其化学成分而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。就抗原性而言，有完全抗原和不完全抗原。为了 ? 1 ?
单克隆抗体制备方法(全)
单克隆抗体制备方法 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。 主要仪器设备： 超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。 方法 动物的选择与免疫 1. 动物的选择 BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2. 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备方法 多克隆抗体的概念：由多个B淋巴细胞克隆所产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可与多种抗原表位结合的抗体。多克隆抗体的制备主要包括以下几个步骤：免疫动物、佐剂、免疫原、免疫、取血等。 多克隆抗体的制备步骤 一、器材 剪刀(剪兔毛用)一把、弯头眼科手术镊子(游离血管用)一把、直头眼科手术剪(剪血管用)一把，手术刀架，手术刀片，注射器(1ml、10ml，25ml)附针头，兔子固定架，灭菌三角烧瓶(200ml)或平皿(直径18cm)、弯头止血钳四把，直头止血钳两把，手术缝合线，塑料放血管，纱布等。 二、试剂 生理盐水(或PBS) 弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，FCA) 弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant，FIA) 二甲苯，酒精棉，脱脂棉，2% NaN3 三、免疫原：蛋白或KLH偶联的多肽。每次免疫100-200μg免疫原。 四、兔子的选择 兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健康。 五、免疫 用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/4的免疫原。这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。 注：
抗原注射以前需要收集一些正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。待兔子在新环境中稳定，大概需要四天左右时间，可以进行耳动脉取血。取血量约5ml足矣。 免疫用的抗原必须纯化，否则影响抗体的质量。抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。首次免疫用FCA，以后都用FIA。 免疫方法可采用背部多点注射法。即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，间隔2周后再于上述部位选不同点注射(不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好)。每次免疫的抗原量约100μg。免疫次数在四五次即可，抗原用量大可以减少次数。 六、取血： 免疫一周后，可以耳动脉取血检测抗体效价。因为起初几次免疫产生的抗体的效价比较低，头两次取血，够检测用即可。在三次免疫后，可以获得较高效价的抗体，每次取血量可以在40ml，不要取太多，否则会造成兔子贫血。 前几次取血用19号针头对兔子进行耳动脉取血，室温过夜析出血清。 最后一次取血可以采用颈动脉放血，具体操作如下： 1、家兔仰卧于兔架上固定头部，用纱布固定四肢。头部略放低以暴露颈部。剃毛并消毒皮肤。 2、沿颈部中线用手术刀切开皮肤约10cm，分离皮下结缔组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌(小心操作，如碰到小血管出血，可用止血钳止血)。 3、用直头止血钳分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后用弯头眼科镊使之游离，剥离神经和结缔组织。 4、于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住。 5、用小拇指垫在血管下，用尖头眼科手术剪在两根丝线间的动脉璧上剪一小口(勿剪断)，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱。 6、松开止血钳，使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐 剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：① 将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 （二）细胞融合
单克隆抗体的制备、纯化及鉴定
单克隆抗体的制备、纯化及鉴定 一、实验目的： 单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。 二、实验原理： 骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。 三、试剂与器材： 细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。 四、操作方法： 1、抗原制备； 一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。 A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。
多克隆抗体的制备方法1
抗体的制备方法与原理 一、抗血清的制备 有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。 （一）用于免疫的动物 作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。 （二）免疫途径
免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。 （三）佐剂 由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。 佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。 配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。为避免损失抗原，亦可用一注射器装抗原液，另一注射器装佐剂，二者以聚乙烯塑料管连接，然后二者来回反复抽吸，约数十分钟后即能完全乳化。检查合格后即以其中一注射器作注射用。 免疫佐剂
免疫学实验-多克隆抗体的制备
JLU 免疫学实验-多克隆抗体的制备吉林大学生命科学学院生物实验教学示范中心 王飞 fei@https://www.wendangku.net/doc/6f5598254.html, 内容提要 抗体的产生及免疫功能 1 抗体的临床及科研应用 2 抗体制备原理 3 ELISA法测定抗体效价 4 实验项目简介 5
免疫系统概述 Immune system：protect against disease Major target: detect and distinguish pathogens (virus, bacteria, fungi, parasite, others) Innate/固有 immune system: nonspecific rapid (leukocyte, NK cell, complement) scavenge recruit activate Adaptive/适应性immune system: specific slow (lymphocyte, antibody) recognize tag memory 免疫反应时间线
概念 抗原(antigen)：能刺激机体免疫系统产生抗体和/或致敏淋巴细胞，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内外发生特异性结合而出现反应的物质。 抗体(antibody)：机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞增殖分化形成的浆细胞所产生的，可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中。 抗体的产生及功能 抗体的产生： B细胞被激活后分化为浆细胞并分泌抗体。 抗体的免疫学功能： 识别病原菌表面抗原 阻止病原菌侵袭体细胞 介导特异性免疫攻击
多克隆抗体的制备 实验报告
实验二多克隆抗体的制备 实验目的和要求： 1、掌握多克隆抗体制备方法 2、多克隆抗体纯化、保存及效价测定 实验内容： 1、猪链球菌（ 2、7、9型）分型血清制备 2、猪链球菌（2、7、9型）分型血清效价测定 实验方法和步骤： （一）相关免疫血清的制备 2014年11.25达，2014年12.2 注射2.0ml抗体 1、实验动物分组：成年家兔4组，2只/组 2、适应新环境之后，进行免疫：加入之前实验制备的猪链球菌全菌抗原，2ml/只，首免-2w后二免-4w后三免 3、采血：首免后2w-4w-6w采血，耳缘静脉采血3mL 5、分离血清之后，-20℃保存备用 （二）琼脂扩散实验： 材料和试剂 1、PH8.6，0.1M巴比妥——巴比妥钠缓冲液 巴比妥钠10.3 g，巴比妥 1.84 g，硫柳汞100 mg（防腐剂），蒸馏水加热溶解并定容至500ml。 2、1%预复琼脂（或琼脂糖） 1g琼脂（或琼脂糖）加蒸馏水100ml溶化即可。 3、1%琼脂糖凝胶 1g琼脂糖加50ml蒸馏水置水溶中煮沸溶解或用与波炉加热溶解（注意不要溢出且注意加入蒸发的水），然后再加入50ml上述巴比妥缓冲液混匀，置4℃保存备用。 4、抗原及相应免疫血清。 操作步骤 1．预复琼脂玻板的制备
将溶化的1%预复琼脂用滴管加玻板上，使之能将表面覆盖即可，放于温箱内干燥（或自然干燥），即可用以制备凝胶板。 2．凝胶板的制备 溶化琼脂糖，在水平桌上将溶化的琼脂糖倒在预复琼脂玻板上，制成厚度约3～4mm厚的琼脂糖凝胶板，待冷却后根据所需形状打孔（注意不宜在室温下放置过久，尽量缩短操作时间，以免干燥）。 3．免疫扩散及结果观察 将抗原加入中心孔，倍比稀释的免疫血清加入周围孔，留1孔加双蒸水，以作空白对照（注意：加样至孔满为止，不可外溢）。待孔内液体渗入凝胶后即可放于温盒中（如需要可重复加样，加样间隔时间应掌握在第一次加样后孔内液体尚未完全扩散完的情况下即加入，以免孔周围形成不透明的白色圈）。湿盒于25℃中，一般保温24～48h，观察抗原抗体产生的白色沉淀线。 4．免疫血清的滴度以一定抗原浓度下出现白色沉淀线的最高稀释度来表示。如不知抗原浓度是否与免疫血清相当时，抗原也可倍比稀释，多做几个梅花孔以作比较。 （三）标本的保存 为了保存标本，可染色处理，步骤如下： 1用生理盐水浸洗待保存的玻板2～3天，每天换水1～2次，洗去多余的抗原抗体及其他蛋白。 2 浸洗后于玻板的凝胶上加5%甘油或用0.5%琼脂填孔防裂，用湿的优质滤纸覆在凝胶上（两者之间不要有空气），37℃过液使其彻底干燥。 3打湿滤纸，轻轻揭下，洗净胶面。 4用0.05%氨基黑（用5%醋酸配）染色10min，再用5%醋酸脱色至背景无色为止，干燥保存。也可用0.1～0.5%考马斯亮蓝（10～20%醋酸配制）染色5～15min，再用10～20%醋酸脱色至背景无色，干燥保存。 实验结果 讨论
兔多克隆抗体的制备(2020)
兔多克隆抗体的制备 一、兔多克隆抗体 1.多克隆抗体的概念 抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。一般而言，抗体按靶位点不同主要分为单克隆抗体和多克隆抗体，由多个B淋巴细胞克隆产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可以与多种抗原表位结合的抗体就是多克隆抗体。 2.兔多克隆抗体的优点 1.制备体系成熟。 2.抗兔二抗产品丰富，商业化好，适合检测。 3.制备成本相对低廉。 3.为何选择兔子 4.一般流程
多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。 二、兔多克隆抗体制备流程 1.兔子的准备 挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血. 预采血（作阴性参照用） 1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静； 1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)； 1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀； 1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)； 1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口； 1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清； 1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min；h.收集上清，即为血清。 2. 兔子的免疫 2.1 注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。 2.2 将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色； 2.3 小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。 2.4 免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。
如何选择合适的单、多克隆抗体及抗原
如何选择合适的单、多克隆抗体及抗原多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆，产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。 一、单多抗优缺点 二、单抗和多抗的选择 如果对抗体的特异性要求高，用量较大或需要长期使用一致的抗体，制备的抗体应用要求多（WB/IP/IF/ICC等)，可以选择制备单克隆抗体。
多克隆抗体的特异性较差，即使是使用相同的抗原制备多抗，不同批次间也会存在差异，因而在特异性、一致性方面有很大的局限。所以在用多抗做免疫检测时，更容易造成背景，例如在WB 中有杂带，在IHC 中背景较深等等。虽然还存在着交叉反应的问题，但由于多抗识别多个抗原表位，即使是有少数几个抗原表位被破坏或者抗原构象改变，实验的结果也不会受到影响。另外多抗需要免疫原的量大，如果免疫原制备困难，建议制备单抗。 若对抗体的特异性要求不高，需要做沉淀和凝集反应的检测性实验或者只需做ELISA 检测，可以选择制备多克隆抗体。 多抗相比较单抗仍然有制备时间短、首次制备成本低的特点，在一些情况下也是一种选择。另外，在相同条件下，使用多抗可以提高检测的灵敏度，对于丰度偏低的蛋白也更容易检出。 三、抗原的选择 抗原的选择可以是天然蛋白、重组可溶蛋白、重组变性蛋白和多肽，抗原质量越高，最终制备高质量抗体的几率也会越大！目前抗体制备常采用重组蛋白或多肽作为抗原。 常规情况下，重组蛋白作为抗原往往含有更多的抗原决定簇，既有空间表位，也会有线形序列表位，对于机体的免疫刺激也会相对充分一些，那么最终获取应用面较广的抗体几率也会大很多，尤其是目的蛋白已证明有修饰或者复杂结构的，一般都会优先选择重组蛋白。 当然也有必须用多肽制备的，比如对同源家族某一个蛋白抗体的制备，同源性非常高的，需要找到特异性aa合成多肽，再或者一些修饰化抗体，需要在多肽合成阶段定点修饰某些AA来制备抗体。抗原多肽选择一般遵循如下基本原则1.尽可能是在蛋白表面；2.保证该段序列不形成α-helix；3.N，C端的肽段比中间的肽段更好；4.避免蛋白内部重复或接近重复段的序列；5.避免同源性太强的肽段；6.交联可以交联在N，C两端，选择依据就是交联在对产生抗体不太重要的一端；7.序列中不能有太多的Pro，但有一两个Pro有好处，可以使肽链结构相对稳定一些，对产生特异性抗体有益。
单克隆抗体的制备
单克隆抗体的制备 摘要:单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具,在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着不可或缺的作用。近年来,随着分子生物学技术的发展,出现了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核糖体展示技术及共价展示技术所产生的单克隆抗体。这些技术将有效解决单克隆抗体的鼠源性等问题。下面主要讲述制备单抗的实验过程。 关键词：抗体，单克隆，肿瘤，细胞融合，淋巴细胞 现代生物技术制药工业始于1971年，现已创造出35个重要治疗药物，全球大约有2500多家公司，主要产品有重组蛋白质药品、重组疫苗和诊断、治疗用的单克隆机体三大类。我国自80年代在采用现代生物技术改造传统生物技术制药产业方面已取得初步成果。但我国生物技术诊断试剂、酶工程、动植物细胞工程医药产品、现代生物技术支撑技术、后处理技术和制剂技术等方面与国外还存在差距。 1．国外现代生物技术产业发展的现状 自1971年Cetus公司成立至今，现代生物技术制药工业已走完了二十五年的路程，创造出35个重要的治疗药物，目前已在治疗癌症、多发性硬化症、贫血、发育不良，糖尿病、肝炎、心力衰竭、血友病、囊性纤维变性和一些罕见的遗传性疾病中取得良好效果。在医药工业中，传统生物技术（包括近代生物技术）已为人类提供了许多重要药品，在保障人类生命健康和推动社会进步中发挥了巨大作用；现代生物技术以其特有的高新技术又为人类提供了传统生物技术难以获得的极微量的珍贵药品。由于这一系列现代生物技术新型药物的出现，使过去无法治疗的疑难疾病得到了治疗。同时，应用现代生物技术DNA重组，细胞融合以及细胞大规模培养等现代生物技术发展和提高传统生物技术的生产水平，为抗生素、氨基酸、维生素以及基体激素等药品的生产，构建了高产新菌株，创造新工艺，提高生产能力，降低生产成本，促进生产发展。
单克隆抗体制备实验过程
单克隆抗体制备实验过程 I 细胸培养 选出所需要的细J腕 群,继续培养 免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞 的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器 官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B 淋巴细胞。 杂交瘤细腕 体内培养 体外培养 从培养液中 \ /从腹水中提取 单克隆抗体
说明：FCA弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody ，北京康碧泉公司研制 的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。 PS：1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。 2 、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。 3 、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B 细胞数量会下降到未冲击前的水平。 二、细胞融合（Cell fusion） 【材料和试剂】 （1）骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。 （2）免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，？分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠，浸泡于75%酒精中3?5min。无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围
的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3?5个小块，然后用注射器内芯研磨。将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml, 1000r/min 离心5min,弃上清，再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5?2X 108个脾细胞。 (3)饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊 从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟， 随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2X 105/ml，备用。 (4)主要试剂的配制 ①细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM (Dulberco Modified Eagles Medium )两种基础培养基，配好后过滤除菌 (0.22um),分装，4C保存。 不完全RPMI-1640培养基: 完全RPMI-1640或DMEI培养基: HT或HAT培养基:
最新单克隆抗体制备方案
单克隆抗体制备方案
单克隆抗体制备方案 细胞融合前准备 一、动物免疫 1.1 动物 选择与所用骨髓瘤细胞同源的纯系Balb/c小白鼠，雌雄皆可，鼠龄8周左右。为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。 1.2免疫原制备 15ml离心管15个、50ml离心管7个、10ml注射器5支、Tip头20个、电子天平、CFA、PBS、CFA（使用前需震摇） 50μg /只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。取1ml加入7mlPBS 中，混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃，用注射器反复推吸。取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。4℃保存。100μg/只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。取1ml加入3mlPBS 中，混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃，用注射器反复推吸。取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。4℃保存。150μg/只：称取90mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。取1ml加入2mlPBS 中，混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃，用注射器反复推吸。取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。4℃保存。200μg/只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。取1ml加入1mlPBS 中，混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃，用注射器反复推吸。取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。4℃保存。250μg/只：称取100mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。取1ml加入1mlPBS 中，混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃，用注射器反复推吸。取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。4℃保存。 1.3 实验步骤 初次免疫： 50μg、100μg、150μg、200μg、250μg抗原溶于PBS中，加等体积的福氏完全佐剂（CFA）腹腔和皮下注射。（共25只小鼠，每组5只，两只采用背部皮下注射，共1ml，0.2ml/点，3只采用腹腔注射） 3周后 第二次免疫：与初次免疫等量的抗原溶液加等体积加福氏不完全佐剂（IFA），腹腔和皮下注射 3周后 第三次免疫：与初次免疫等量的抗原溶液加等体积加IFA，腹腔和皮下注射，5天后内眦静脉或断尾取血以ELISA间接法测效价 2～3周后 加强免疫：取初次免疫抗原一半的量溶于PBS，静脉或脾内缓慢注射，以免动物发生过敏性休克而死亡。 3～4天后 腹腔注射 大鼠、小鼠一般一人即可注射：以左手大拇指与食指执住鼠两耳及头部皮肤，腹部向上，将鼠固定在手掌间，必要时，以左手无名指及小指夹住鼠尾；右手持连有5号针
多克隆抗体
传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经不同途径免疫动物，由于抗原性物质具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，所以称这种免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体（polyclonal antibody ，PcAb）。多克隆抗体的亲和力较一般单克隆抗体高。多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为制备高效价和高特异性的多克隆抗体，必须要有理想的免疫原、适宜的动物及切实可行的免疫方法。本章主要介绍多克隆抗体的制备及相关技术。 第一节动物选择实验动物是生物医学中的重要组成部分。目前常用于生物医学科学研究的实验动物种类很多，主要包括有两栖纲的青蛙、蟾蜍，鸟纲的鸡、鸭、鸽等，哺乳纲啮齿目的小鼠、大鼠、豚鼠等，兔形目的家兔，食肉目的猫、狗，有蹄目的羊、猪和灵长目的恒河猴、猩猩、绒猴等。其中最常用和用量最大的是哺乳纲啮齿目动物，其次是兔形目和食肉目等。 一、实验动物的生物学特性 实验动物选择得当与否是实验研究成败关键之一。掌握实验动物的生物学特性，则能以最佳的设计选择实验动物，进行科学实验，从而获得预期的实验结果。 1. 小鼠小鼠是啮齿目中体型较小的动物。新生小鼠 1.5g 左右，21 天断乳时12～15g，至 2 月龄体重达20g 以上，可供实验使用。成年雌小鼠体重18~35g，成年雄鼠体重20~40g。小鼠性情温顺，易于捕捉，对外来刺激敏感，喜群居于阴暗环境。 2 ．兔草食性动物，性情温顺，胆小易惊，喜居安静、清洁、干燥、凉爽、空气新鲜的环境，耐冷不耐热，耐于不耐湿。兔耳大，表面分布有清晰的血管。有特殊的血清型和唾液型，血清型分为α ' 、β ' 、α'β'和O型四种。α ' 、α' β'型易产生人A型抗体，β ' 、O型易产生人B型抗体。唾液型分两种：排出型与非排出型。排出型易获得人血细胞 A 型物质，非排出型不易获得，这种A型物质与A型抗体产生能力有关。因此，要获得A型抗体，应选用排出型的α'、α' β' 血清型兔。由于抗原刺激机体后，体液免疫应答反应强烈，故兔被广泛用于制备高效价的特异性强的免疫血清。 3 ．豚鼠草食动物，性情温顺，胆小，对外界刺激极为敏感，喜居干燥、清洁的环境。自动调节体温的能力较差，对环境温度变化较为敏感，最适宜的温度为18~20℃，对抗生素敏感。 4 ．羊草食动物，性情温顺，合群，易于接近，喜居干燥、清洁的环境，怕潮湿，怕热不怕冷，寿命为1 5 年。山羊可用于生产多种抗血清，也可用于营养学、免疫学、微生物学、生理学等方面的研究。绵羊常用作制备抗血清，其红细胞是血液学诊断中最常用的材料。 二、选择实验动物的原则 1 ．3R原则3R 指的是reduction（减少）、replacement（替代）和refinement（优化）。“减少”指减少实验用的动物和实验的次数；“替代”指尽可能采用可以替换实验动物的替代物；“优化”指对待实验动物和动物实验工作应做到尽善尽美。 2 ．从微生物学和寄生虫学标准去选择实验动物要求选用三级的实验动物，原因是三级实验动物已经排除了人兽共患疾病，排除了实验动物本身的传染病，也排除了影响实验研究的相应微生物和寄生虫，使实验研究处于没有或很少有外源干扰的情况下进行。 3 ．从遗传学的观点选择实验动物即根据动物的不同生物学特性选择适宜的实验动物。 4 ．不能忽略的一些因素如性别、年龄、体重、营养状况、饲养环境等。 三、免疫动物的选择 可作为免疫用的动物主要是哺乳类和禽类，常选用的有家兔、绵羊、豚鼠、马、鸡等。动物种类的选 择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗体的数量和用途，如制备抗γ- 免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清。具体选择时，应考虑以下因素：（一）动物种系免疫学理论研究已经证实：机体的免疫应答受遗传基因的控制。同一种系不同个体对不同抗原的免疫应答以及不同种系对同一抗原的免疫应答均不尽相同。一般认为，抗原与免疫动物种属的差异越远越好，亲缘关系太近不易产生抗体应答（如兔一大鼠之间，鸡-鸭之间）。实验中最常用的动物是家兔，因它与人类的交叉较少。