新手Western blot步骤及注意事项

WesternBlot操作步骤及注意事项

【原理】

Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

【试剂及配制】

1、SDS-PAGE试剂：见试剂盒说明书。

2、电泳缓冲液

Tris（分子量121.14） 3.03g

甘氨酸（分子量75.07） 18.77g

SDS 1g

蒸馏水定容至1000ml

溶解后室温保存，可配制成10X电泳缓冲液进行保存（Tris、甘氨酸、SDS用量X10倍，蒸馏水定容至1000ml）。电泳缓冲液使用2~3次后推荐更换。

3、转膜缓冲液

湿转法

48mmol/L Tris 2.375g

39mmol/L甘氨酸11.25g

0.0375%SDS 0.375g

加少部分蒸馏水溶解

20%甲醇200ml

蒸馏水定容至1000ml

溶解后室温保存，可配制成10X转膜缓冲液（不含甲醇）进行保存（Tris、甘氨酸、SDS用量X5倍，蒸馏水定容至500ml，或按10倍用量定容至1000ml等；用时取100ml，加入200ml 甲醇再加蒸馏水稀释至1000ml）。使用转膜缓冲液时注意室内通风。转膜缓冲液用于转膜一次后，建议更换新转移缓冲液，旧转移缓冲液可用于转膜前浸泡物品。

4、TBS缓冲液

1mol/LTris·HCl（pH7.5）10ml

NaCl 8.8g

蒸馏水定容至1000ml

配制后室温保存，可配制成10XTBS缓冲液，使用时稀释10倍。

5、TBST缓冲液（洗膜液）

20%Tween20 1.65ml

TBS 700ml

混匀后即可使用，现配现用，因含Tris缓冲液，其PH易受空气中二氧化碳影响，此外注意使用时不要直接接触到皮肤，其有致癌作用。

6、封闭液

脱脂奶粉5g

TBST 100ml

【蛋白质样品制备】

具体步骤参考RIPA试剂盒的说明书。

蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题:

（1）为防止蛋白质在样品处理过程中出现细胞破碎所致酶类修饰和蛋白降解，制备过程应在冰上操作，并加入合适的酶抑制剂。

（2）样品建议分装成合适的量（比如分装出20ul检测蛋白质定量用），然后保存于-20°或-80℃中长期保存，但要注意不要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。（3）若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验，也就很难做出好的结果了。除此之外loading buffer的作用也不容忽视，切莫使用不新鲜的

上样缓冲液，同时在处理时也应注意将样品与loading buffer混合均匀。

（4）为确保蛋白浓度在合适范围内，应注意加入裂解液的量，适度稀释蛋白。

【蛋白质定量】

具体步骤参考BCA试剂盒说明书。

BCA定量测吸光度后，用EXCEL作曲线，计算出不同样品蛋白含量（或大致估算出蛋白含量），再加入适量体积的loadingbuffer稀释样品至一定浓度（以确保等体积上样时不同样品蛋白质含量相似），上样前需将样品置于烧杯内，将烧杯置于石棉网上用加热器加至沸腾，在沸水中煮3~5min使蛋白充分变性。之后样品可在4℃冰箱内短期保存或在-20℃冰箱内保存半个月至一个月，应避免反复冻融。

【SDS-PAGE电泳】

1. 清洗玻璃板：

蘸点洗洁精轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在架子上晾干（为省时间也可用吹风机吹干)。若不继续使用，需用无水乙醇擦拭后晾干再妥善收起来，用保鲜膜包裹玻璃板封存。梳子应用自来水洗干净后再用蒸馏水冲洗，临用前（用无水乙醇擦拭）晾干。

2. 灌胶与上样

①玻璃板对齐后放入夹板固定卡紧（两块玻璃板的下缘不可有错位缝隙，若有明显的缝隙可能会导致漏胶）。然后放置于做制胶器上根据玻璃板间隙宽度选择压的程度并准备灌胶（操作前建议先往玻璃板间灌水，检查是否漏）。

②按配胶试剂盒说明书选择合适的分离胶浓度配置，试剂中AP和TEMED是促凝剂，在最后顺序加入，之后用1ml枪吹吸摇匀即可灌胶。配制凝胶时要充分混匀，此外应保证试剂的新鲜，特别是过硫酸铵。灌胶时掌握好速度，避免气泡产生（注意浓度越小的胶含水越多，凝固后胶体积缩小越多）。分离胶加至小玻板2/3宽处，大约在插入梳子的下缘1cm处，然后立即在胶上加水，液封后的胶凝的更快（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变形）。未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应该戴手套防护。

③当水和胶之间有一条折射线时（或配胶后管内剩余的分离胶差不多凝了），说明胶已凝了。再等几分钟觉得差不多的时候就可倒去胶上层水并用移液枪或吸水纸将水吸干。聚合时间由AP以及TEMED决定，通常在10min左右，AP不新鲜会导致聚合变慢，气温较低时胶是会凝得慢一些，必要时可适当增加AP以及TEMED的量，但通常不会超过30min，若超过30min 甚至更长仍未聚合，应检查配制的操作有无错误。由于TEMED催化AP释放相关化学基团，再由AP释放的基团催化Acr/Bis聚合，所以如果AP不新鲜的话加再多的TEMED效果也不佳，故已配制好的AP一般分装并-20℃保存。

④按说明书配浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶，如果液面上有气泡，则继续缓慢加浓缩胶使液面逸出同时将枪头朝一个方向将液面上方的气泡刮向角落，刮去气泡后将梳子插入浓缩胶中。梳子插入浓缩胶时，应确保没有气泡产生，可先将梳子接触到液面，使其润湿，再插入，同时注意要水平插入。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。

⑤趁浓缩胶聚合的时间里或在之前，可将样品从-20℃中取出置于-4℃解冻，若样品长时间未使用，加样时注意混匀。

⑥待到浓缩胶凝固后，往两胶间的内槽中加电泳液使其没过加样孔，之后两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出，即可开始加样。加样前可用5ml注射器先冲洗一下加样孔，避免有碎胶等杂物存在于加样孔；若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正。一般在第一个孔加入marker，之后用适当量程的移液枪吸取适量样品加入所需加样的孔内，注意加样时从孔的上方缓慢伸入液面下孔内，用枪头时注意不要插得太用力太深，否则容易把玻璃板撑开，样品就落到胶和玻璃板之间的空隙了，此外加样时不要过快避免样品被冲出加样孔。

⑦浓缩胶配好后也可先不加样，保鲜膜封好后于4℃保存，1~3天内使用。

3、电泳

从制胶器上取下凝好的胶板，将胶板置入电泳槽中，加入电泳液，注意电泳槽内的电泳液不要加太满，应低于内槽里的电泳液面水平2cm左右。电泳时间和电压没有标准，按照实验室的惯例或者电泳槽的使用说明来操作。当电泳至marker及样品被压成一条直线并即将进入分离胶或marker有分离趋势时即可转换电压，电泳至溴酚蓝刚跑出或即将跑出即可终止电泳，进行转膜。为减少蛋白质条带的扩散，上样后应尽快进行电泳，电泳结束后也应直接转膜。电泳时可将电泳槽至于冰水中浸泡，避免电泳时温度过热影响

目前转换电压：80V转至120V。时间不确定。

【湿法转膜】

1、在电泳结束前20min左右开始准备转膜所需要的东西。先准备一个托盘，在其内倒入适

量转移缓冲液，随后将电泳槽夹板、海绵放入其中浸泡，同时准备好洁净的培养皿（或其它容器）。

2、为了防止在没有电场的情况下蛋白条带的扩散，转膜操作要尽快。

3、取出玻璃板，用硬卡片将玻璃板撬开，翘的时候动作要适度力度适中，注意玻板比较脆

弱。撬开玻板后，将浓缩胶轻轻刮去，避免刮破分离胶，随后按照需要切胶（为避免胶干可加些转移缓冲液在胶上），保留下需要的部分（表面一般为长方形），用尺子量出长宽并记录，随后将膜放入托盘内。按照长宽剪取两块厚滤纸和一块PVDF膜（先剪好两块滤纸，再根据滤纸大小剪膜，使膜比滤纸稍微大一点点，避免转膜时滤纸过大相互接触而引起短路）。滤纸剪好后，放入托盘内转移缓冲液中泡10min左右；膜剪好后，放入盛有甲醇的培养皿中泡1~2min（活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白质结合），随后将膜转入盛有蒸馏水的培养皿中泡至其沉底（3min左右），最后将膜放入盛有转移缓冲液的培养皿中浸泡待用。

4、打开夹板，将夹板的黑色面（代表阴极）朝下放置，在黑色面上放置一块海绵，再将一

块滤纸放在海绵上，随后将胶小心铺在滤纸上，用硬卡片轻轻刮一刮赶气泡，随后镊子夹取PVDF膜铺在胶上，硬卡片刮一刮，之后再铺一层滤纸，最后铺上一层海绵，将夹板阳极透明面盖上夹紧（注意铺完最后一块海绵时不能使滤纸胶膜的相对位置移动，若有移动则需重新操作）（形成阴极黑色面—海绵—厚滤纸—胶—膜—滤纸—海绵—阳极透明面层次，注意赶气泡，注意阴阳极），随后插入电泳槽中。滤纸在浸泡后容易胀大，若大于膜，则需用剪刀再做修整，此外，铺滤纸之前可捏一捏滤纸，确保滤纸全部被浸透而无气泡。将膜铺于胶上时，为避免产生气泡，可通过多加转移缓冲液使胶被浸没（或者镊子夹住膜的一端，使膜与胶呈一定夹角缓慢放置）。

5、将夹板固定好后插入电泳槽内，向电泳槽中加转移缓冲液，转移缓冲液应浸没夹板，盖

好电泳槽盖子，随后将电泳槽置于冰水中浸泡即可开始转膜。转膜条件：电流200mA时间1h20min（电压适当调高些，否则无法达到电流200mA的条件），时间可依据蛋白分子量大小及转膜情况做适当调整。

【免疫杂交反应及显影】

1、预先准备盛有TBST的平皿，转膜结束后，取出PVDF膜，在靠近marker的一侧上方或

下方剪一个小三角，以区分膜的正反面（以贴近胶的那一面称为膜的正面），同时注意镊子夹取膜的时候尽量夹膜的边角。若未见marker条带，可将膜在20%甲醇中泡一下，随后对着白透射光线看，若蛋白转在膜上则可依稀看到透明的蛋白条带，用于观察电泳效果和转膜效果。

2、将膜正面朝下放入盛有PBST的平皿中，摇床摇洗3次，每次5min，转速80r/min。

3、随后将膜夹入盛有封闭液的平皿内，此时可将膜的正面朝上，摇床摇动封闭2h，转速

80r/min（封闭是为了封闭膜上的蛋白吸附位置，这样抗体才能够特异结合到目的蛋白上）。

4、封闭完毕后，将膜正面朝下放入盛有PBST的平皿中，摇床摇洗2次，每次5min，转速

80r/min。

5、摇洗后，将膜正面朝下置于盛有一抗的一抗孵育盒中（若一抗足够最好正面朝上），摇

床震荡孵育15min（80r/min），随即放入4℃冰箱中静置过夜孵育。

6、一抗过夜孵育后，将膜正面朝下置于盛有PBST的平皿中（注意及时回收一抗），摇床摇

洗3次，每次5min，转速80r/min。

7、随后将膜正面朝下置于盛有二抗的二抗孵育盒中（若二抗足够最好正面朝上），摇床震

荡孵育1h（80r/min），

8、二抗孵育完毕后，将膜正面朝下夹入盛有PBST的平皿中（注意及时回收二抗），摇床摇

洗3次，每次5min，转速80r/min。一二抗孵育时如一个槽内有两条膜，最好反面相对孵育，不建议3条及以上的膜在一个槽内孵育。注意一抗二抗的回收。

9、在摇洗二抗的同时，按照显影液试剂盒说明书配置显影液（于锡箔纸包裹的EP管中），

待摇洗完毕后即可显影，显影前备好无手指套PE手套一只、200微升移液枪一把、枪头一个、弯镊子一把、滤纸片若干条。显影时切记膜要正面朝上，且不可有气泡，为避免气泡产生，可用镊子夹住膜的一端，使膜与胶呈一定夹角缓慢放置。

10、孵育抗体前建议将膜的一条边轻触卫生纸或滤纸上以吸去膜上多余的缓冲液，避免

抗体被额外稀释，此外，特别注意不要让膜干了，否则会影响显影结果。

westernblot详细图解

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以

检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

Westernblot实验步骤及注意事项1(精)

Westernblot实验步骤及注意事项 Westernblot 实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。 3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。

4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜） 9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。 11．按步骤9洗涤。 12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。注意事项： western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参 考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) O 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚 细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒 进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。 O 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要 采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生

WB实验步骤

Western blotting实验步骤 1．蛋白质的样品制备： 取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。 将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20℃备用。 2 .测定蛋白浓度： 2.1 按50：1配置BCA工作液。 2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。 2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。 2.4 分别加PBS定容至20ul。 2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。 2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。 3 SDS-PAGE电泳： 3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续

平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。 3.2 预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。 3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。 3.4 加样：预电泳后依次加入标准品（Marker）和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。 3.5 电泳：加样完毕，选择80V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处（一般约20分钟），更换至100V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳（一般约为1小时20分钟）。 4．转膜： 4.1 切胶：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来，测量其长宽，并记录。 4.2 剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸（滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm，PVDF 膜长宽较凝胶大0.5~1mm），滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟，然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟，进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。 4.3 向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”（注意避免两边滤纸相互接触，以免发生短路）。从正极到负极按如下顺序排列：

westernblot实验详细步骤(1)

Western Blot实验技术一、制胶 SDS-PAGE分离胶配方表 1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分

2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。 3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。 二、上样 1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。 2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。 3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。 4、上样时从左到右依次上样。 5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。 6、要预留Marker的上样孔。 三、电泳 四、转膜

PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 （转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。） 1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。 3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。 三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白） 转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h

（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。 装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。 装置运行时需冰浴。） 五、封闭 在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。 封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。 1、将脱脂奶粉封闭液（1xTBST:脱脂奶粉=20mL：2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA 效果更好）倒好。 2、将PVDF膜取出放入封闭液中，盖子改好。 3、封膜一般常温1-2小时即可，也可4℃封闭过夜。 六、一抗 抗体反应主要采用间接法: 即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后，再加入标记的二抗进行杂交检测，标记二

Westernblot基本操作步骤

W e s t e r n b l o t基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm 培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS 到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制： ①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ 水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ水至1L。 ④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL 抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳

western blot操作注意事项

一．配胶 1．注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。 2．分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可 3．封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。 4．灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。 二．样品处理 1．培养的细胞（定性）： ⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 ⑵对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。 ⑶100℃，1min。 ⑷用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。 ⑸用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP 管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。 ⑹待样品恢复到室温后上样。 2．培养的细胞（定量）： ⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 ⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。 ⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。 ⑷12000g离心，4℃，2min。 ⑸取少量上清进行定量。 ⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。 3．组织： ⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。 ⑵12000g离心，4℃，2min。 ⑶取少量上清进行定量。 ⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液

蛋白质印迹法westernblot

蛋白质印迹法 蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot 蛋白免疫印迹Western Blot 类似方法1 Southern Blot 杂交方法 类似方法2 Northern Blot 杂交方法 使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴

原理 与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。⑴ 分类 Western Blot 显色的方法主要有以下几种: i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色

最详细的WesternBlot过程步骤详解

最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解

最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解 Pleasure Group Office【T985AB-B866SYT-B182C-BS682T-STT18】

Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

westernblot详细图解详细版.docx

Western免疫印迹（Western Blot） 是将蛋白质转移到膜上，然后利用 抗体进行检测的方法。对已知表达 蛋白，可用相应抗体作为一抗进行 检测，对新基因的表达产物，可通 过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法 类似，但Western Blot采用的是聚 丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋 白质，“探针”是抗体，“显色”用标记 的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转 移到固相载体（例如硝酸纤维素薄 膜）上，固相载体以非共价键形式 吸附蛋白质，且能保持电泳分离的 多肽类型及其生物学活性不变。以 固相载体上的蛋白质或多肽作为抗 原，与对应的抗体起免疫反应，再 与酶或同位素标记的第二抗体起反 应，经过底物显色或放射自显影以 检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；

SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺0.1 ml；H2021.0 μl。 二、蛋白样品制备 1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取 （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS （0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） （6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提

WB操作步骤-自己整理

Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法） 人工肝实验室学习姚瑶 （一）目的蛋白提取： （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。 2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。 共洗三次，每次十分钟。 3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。 4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做） 5、4℃，12000转离心10min。 6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。 （2）组织中总蛋白的提取： 1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。

2、配平后，4℃，14000转离心10min。 3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定： 1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。 2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。 3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。 4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。 5、37℃水浴30min。 6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。 7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。 （三）SDS-PAGE电泳： （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样： 1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。

WB实验步骤

蛋白电泳（制胶、SDS-PAGE电泳） 实验材料： SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer（还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水 实验仪器、耗材： 蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用） 配制溶液： ●配制10%APS溶液：-20度保存 0.5g APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25ml蒸馏水 ●配制200 ml电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS（ph8.3,10×） 20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水 ●配制1 ml loading buffer： 200 ul 5×loading buffer +800 ul蒸馏水 实验步骤： 一．制胶： 1.参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。 2.根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。 3.配制10%分离胶： 将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。 加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。 配制SDS-PAGE分离胶

4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。静置40分钟 至1小时。 5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。 6.配制5%浓缩胶： 7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。 注意：灌胶速度要快，防止凝胶。 8.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20分钟，等待浓缩胶聚合。 9.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。 二．SDS-PAGE电泳: 1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。 2. 制备样品： 1）蛋白样品： 根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。 蛋白提取液+ 5×上样缓冲液+ 蒸馏水，上样量为40-60ug。 制备的样品，煮沸5分钟，12,000 rpm离心5分钟，取上清，上样。

Western_Blot操作步骤

Western Blot操作步骤 一、 Western blot 实验步骤概述 1. 组织取材：组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA)，PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃ 4. 加入PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g(约15,000转)15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度)，并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳(浓缩胶20mA，分离胶35mA) 12. 电转膜仪转膜(100mA 40分钟) 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 二、 Western具体实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation):可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用北京博奥森生物技术公司生产的WIP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。 2.电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制:SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用博奥森生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。

Western blot 实验技巧精要

Western blot 实验技巧精要 Western blot 方法在SCI 文章中出现的频率非常高，漂亮的WB 电泳图可以给文章增色不少。但是WB 实验的步骤琐碎，细节颇多，要想得到令人满意的结果还是需要花费很多时间和精力去摸索实验技巧的。 一、样品准备部分 我们不应该太过重视WB 电泳部分的操作技巧，样品准备才是整个WB 实验中最重要的一个环节（没有之一）。否则WB 电泳技术再高也无法得到好的结果。小编认为以下3 点值得大家重点关注： 1. 注意孵育、终止时间 如果想得到漂亮的梯度条带，无论是不同处理时间的样品，还是不同给药浓度的样品，在处理过程中都一定要严格按照设计的时间来孵育和终止，尤其是对于磷酸化蛋白，哪怕1 秒也不要提前或耽搁。 2. 抑制蛋白降解 这是样品制备中最需要注意的部分。抑制样品蛋白降解的方法主要有两种： (1) 使用蛋白酶抑制剂 罗氏公司（Roche）的蛋白酶抑制剂Cocktail 片剂，效果不错。再与PMSF 共同使用，可以很好地抑制蛋白降解。 (2) 全程低温操作 提前预冷PBS、裂解液甚至枪头等，从收集细胞开始一直到煮样的全过程都应该尽可能的保持在冰上操作。除了使用冰盒，大多数操作都是在4℃冷房中进行的，虽然有点麻烦和辛苦，但是效果非常好。 3. 裂解液用量 将收集好的细胞加入裂解液进行裂解在操作上是非常简单的，所以这一步的重要性很容易被大家忽视。裂解液的用量直接决定了细胞裂解程度以及裂解后的蛋白浓度。如果加入的裂解液不足，蛋白浓度太高，会造成与上样缓冲液反应不充分，电泳后会出现多条条带，条带形状也不好。做磷酸化蛋白检测时为了在每个胶孔中尽可能多上样，所以用体积较少的裂解液制备了浓度很高的蛋白，结果就得不偿失了（见下图）。

wb注意事项

Western blot 注意事项 1.当进行接触滤纸、凝胶和膜的操作时，应戴手套。手上的油脂会阻断转移 2提蛋白一定要过硬，不能吝惜蛋白酶抑制剂 3测定蛋白浓度一定要选好方法 4. 最重要的，wb的成功最大程度的依赖于sds-page 5．最好有预染marker 6．底物显色的这一步也非常关键 7.蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜（湿式转膜） 常见问题： 1、两快玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平? 1) 玻璃没有洗干净，应该要洗得非常干净！ 2) 过硫酸铵和TEMED的加量不合适，加量相对较多，凝胶凝固过快也会胶不平，最多按照分子克隆加倍。 3) 加完试剂以后没有很好的摇匀，导致有些部位的聚合剂浓度过高，聚合相对较快造成胶不平。4) 稍微注意手法，均匀加入。5) 灌胶后应该用水或者正丁醇压胶面。6) 边缘胶是不容易聚合完全的，灌完胶后要立即加无水正丁醇覆盖，浓度越低的胶越不要使用双蒸水压顶，另外还可以在压顶试剂如正丁醇中添加少许AP来增加边缘胶的凝聚强度。7) 温度也是影响胶聚合的重要因素，可能为了让胶更快的凝固而把胶放到50度的温箱，由于受热不均匀，也会造成胶聚合不均匀。 2、胶为什么总是漏？1）每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件。2）避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损很重要，尤其是下面和胶条接触的地方。3）关键是找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了。4）胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。5）下面的胶条注意不要老化，如果有裂纹的话用保鲜膜垫在上面，也可以有效防止漏胶，或者反过来用6）玻璃在使用过程中容易造成小的缺口，从而导致封条无法完全密封，装好架子后，在玻璃底边上抹上一层薄薄的凡士林就好了，两边多点（容易从两边漏）这样就不会漏了，就算是用了很久的很多小缺口的玻璃都没有问题，然后转移到电泳槽的时候，去掉封条，把底上的凡士林擦干。（注意，一定要擦干净，尤其是少量进入了两隔玻璃之间空腔的，因为凡士林不导电，会影响电泳的效果。）7）可以在海绵垫下再垫一些纸，使得它与玻璃贴的更紧密。或者在玻璃底部用琼脂糖封上。8）因为两块玻板没有放的完全对齐，底部不在同一个平面，所以封条封不严，重新对齐后就不漏了。以后每次只要在水平的桌面上仔细对齐两块玻板，再夹紧。用手感觉一下确定在同一平面上后，放到灌胶架并压在封条上，卡紧。注意两边均匀用力，一般不会再漏。9）先把两块玻片放在夹子上，不要加紧，放到架子上，使两块玻片的底部对齐，夹紧两块玻片，然后取下再在其下面垫上垫片，这样一般就不会漏胶了。 3、条带跑得比正常的窄？1）可能因为胶凝的不均匀，聚合的不是很好，灌胶的时候尽量混匀. 2）可能与拔梳子有关，拔梳应该迅速，冲洗加样孔的时候要小心，以免把上样带扭曲；胶配好了用枪吹几下再灌胶，还有就是要等指示剂跑到两层胶交界成一线时，再调高电压。3）可能是样品的问题，如果盐浓度较高，便会挤压其它条带，致使条带宽窄不一，由于同样的原因，样品在凝胶中的速度会很慢，造成条带走的较慢。4）常见的原因是：每孔上样量不均匀，应确保每孔中上样量一致。5）可能是系统的ph出了问题，有可能是电极缓冲液，也有可能是凝胶缓冲液，更新缓冲液。 4、为什么会有“微笑”和“倒微笑”这样的效果呢？1）"微笑"是因为灌胶的时候冷却不均匀，中间部分冷却不好，导致凝胶中的分子有不同的迁移率所致。这种情况在较厚的凝胶以及垂直电泳时常常发生。“倒微笑“也称“皱眉”现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的三明治底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象2）书上说出现“微笑”是因为整个胶冷凝的不均匀，中间部分和两端受热不一样而致成了“倒微笑”可能是因为两端的胶凝的不好，加APS和TEMED后应该混合均匀。3）样品中盐浓度过高？点样量太多或每孔点样量不均匀？电泳电压不稳定或

新手Western blot步骤及注意事项

WesternBlot操作步骤及注意事项 【原理】 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 【试剂及配制】 1、SDS-PAGE试剂：见试剂盒说明书。 2、电泳缓冲液 Tris（分子量121.14） 3.03g 甘氨酸（分子量75.07） 18.77g SDS 1g 蒸馏水定容至1000ml 溶解后室温保存，可配制成10X电泳缓冲液进行保存（Tris、甘氨酸、SDS用量X10倍，蒸馏水定容至1000ml）。电泳缓冲液使用2~3次后推荐更换。 3、转膜缓冲液 湿转法 48mmol/L Tris 2.375g 39mmol/L甘氨酸11.25g 0.0375%SDS 0.375g 加少部分蒸馏水溶解 20%甲醇200ml 蒸馏水定容至1000ml 溶解后室温保存，可配制成10X转膜缓冲液（不含甲醇）进行保存（Tris、甘氨酸、SDS用量X5倍，蒸馏水定容至500ml，或按10倍用量定容至1000ml等；用时取100ml，加入200ml 甲醇再加蒸馏水稀释至1000ml）。使用转膜缓冲液时注意室内通风。转膜缓冲液用于转膜一次后，建议更换新转移缓冲液，旧转移缓冲液可用于转膜前浸泡物品。 4、TBS缓冲液 1mol/LTris·HCl（pH7.5）10ml NaCl 8.8g 蒸馏水定容至1000ml 配制后室温保存，可配制成10XTBS缓冲液，使用时稀释10倍。 5、TBST缓冲液（洗膜液） 20%Tween20 1.65ml TBS 700ml 混匀后即可使用，现配现用，因含Tris缓冲液，其PH易受空气中二氧化碳影响，此外注意使用时不要直接接触到皮肤，其有致癌作用。

Western blot实验步骤及注意事项(精)

Western blot实验步骤及注意事项 一. 实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA 缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF （每克组织30μl ，10 mg/ml PMSF），利用Polytron 进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF （每克组织30μl ，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford 比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳（浓缩胶20mA ，分离胶35mA ） 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录

western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用 5ml 移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm 滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。 3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。 4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml 水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween 缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜）

WesternBlot实验详解(--)

Western Blot 实验详解 、实验材料 Western Blot 相关试剂： 甘氨酸，最后加入 200ml 甲醇。4 C 保存。 文档收集自网络，仅用于个人学习 30%储备胶：丙烯酰胺 Acr 29.0g 、亚甲双丙烯酰胺（Bis ） 1.0g ，混匀后加入去离子水 37 C 溶解，定容至100ml 。4C 避光保存。 文档收集自网络，仅用于个人学习 10%AP （过硫酸铵）：称取1gAP ，加入10ml 去离子水搅拌。分装，-20C 保存。 Western BIot 相关仪器： 电泳仪；转移仪；摇转仪。 二、实验原理 经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体 （例如硝酸纤维素薄膜） 上，固相载体 以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载 体上的蛋白质或多肽作为抗原， 与对应的抗体起免疫反应， 再与酶或同位素标记的第二抗体 起反应， 经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 该 技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 文档收集自网络，仅用于个人学习 2X Sample Buffer : 1ml Glycerol （甘油）；0.5ml Beta mercaptoethanol （B -巯基乙醇）；3ml 10%SDS; 1。25ml 4 X Upper buffer; 4.25ml dH 2O; Add bromop he nol blue （溴酚蓝）to color 。 文档收集自网络，仅用于个人学习 10X 电泳缓冲液（pH 8.3 ）:在1L 大烧杯中加入800ml 去离子水，称取 Tris 30.2g 、甘氨酸 188g ，混匀，加入100ml 10%SDS ，定容至1L 。（注：SDS 在68C 水浴中溶解）。工作液：1 X 电泳缓冲液 去离子水稀释 室温保存。 文档收集自网络，仅用于个人学习 1.5M Tris-HCl （pH8.8） : Tris 181。7g 去离子水溶解，用浓盐酸调至 pH8.8，定容至1L 室温 保存。 文档收集自网络，仅用于个人学习 1M Tris-HCl （pH6.8） : Tris 121.1g 去离子水溶解，用浓盐酸调至 pH7.5，定容至1L 存。 文档收集自网络，仅用于个人学习 10X TS （洗膜液）：在 800ml 去离子水，加入 NacI 90g ， 1M Tris-HCl （pH7.5） 100ml ， 水定容至1L 。工作液：1 X TS 室温保存。文档收集自网络，仅用于个人学习 1M Tris-HCl （pH7.5） ： Tris 121.1g 去离子水溶解，用浓盐酸调至 存。 文档收集自网络，仅用于个人学习 10%SDS :称取十二烷基磺酸钠（SDS ）10g,加入约80ml 去离子水， 调 pH 至 7.2，定容至 100ml 。 文档收集自网络，仅用于个人学习 1X Transfer Buffer : 在 1L 大烧杯中加入 800ml 去离子水，加入 pH7.5 ，定容至 1L 室温保 去离子 室温保 68 C 加热溶解。用10%HCI 3.03g Trisgrams ， 14.43g