细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题.

细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题

摘要：本文对细菌内毒素检查方法的建立、限值的确定、方法学验证及常见问题进行了介绍。在建立细菌内毒素检查法之前，应尽可能多的收集有关该药品的基本信息，例如：有关样品的溶解性信息，推荐的稀释液，在水中的溶解度，以及最适溶剂；样品的pH范围；分子量大小；产品规格、体积或重量；拟用于临床的用法和用量等等。以便选择合适的样品处理方法和内毒素检查方法，对于早期研发阶段的药物，应选择合适的赋形剂，以有利于细菌内毒素检查中对样品的稀释处理。此外，在确定内毒素限值时还应尽可能采用最大人拟用剂量，为临床安全性和有效性研究中增加剂量留出空间。

一、细菌内毒素检查方法建立的主要步骤

对某一新化合物建立细菌内毒素检查方法时，首先应根据人体最大日给药剂量和给药途径，计算和确定样品的内毒素限值，选择合适的鲎试剂，根据临床规格，计算最大有效稀释倍数，稀释产品，并在低于最大稀释倍数的浓度下进行检查。可以采用凝胶法，也可以采用终点法或动态法。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。

1、细菌内毒素限值的确定

一个药品在投放市场前，它是否满足内毒素限值的要求？样品的内毒素含量具体是多少？这些问题不但关注用药安全，还应该最大限度的提供有关内毒素含量的准确信息，为药品生产过程中质量控制提供警戒信息。尽管细菌内毒素检查方法的建立是一个科学方法的研究过程，但其最终目的还是要为控制药品质量服务。因此，在方法建立时，不但要阐明限值的合理性，考虑技术可能达到的限值，同时还要满足相关药品管理法规的要求。

研究人员在建立方法的早期，一般会按照临床建议的最大人用剂量确定一个非正式的限值，这个限值可以根据实验室可以达到的最低检测水平，把限值订的相对比较严格，但往往由于早期的临床剂量会比最终上市的临床剂量高几倍，所以严格的限值，可能会使得正式生产时很多产品不能通过检查，从而造成不必要的浪费；因此参按照法规允许的最高水平，酌情确定样品的限值。

样品内毒素限值的确定一般与临床人体最大给药剂量有关，剂量越大，单位重量或体积的内毒素限值越低。一般按以下公式计算：内毒素限值L=K/M。式中内毒素限值L是以EU/ml、EU/mg或EU/u表示；K为按规定的给药途径，人体每公斤体重每小时最大可耐受的内毒素剂量，以EU/（kg.h）表示，注射剂K=5EU/（kg.h），其中放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg.h），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg.h）。一般我国人群平均体重按60kg计算，人体对细菌内毒素的最大耐受量为300EU/h；另我国人体的平均体表面积按1.55m2计算，人体每平方米的最大耐受剂量为(300EU/h)/ 1.55m2 =（193EU/h）/ m2 。 M为人体每公斤体重每小时接受的最大给药剂量，以ml/（kg.h）、mg/（kg.h）或u/（kg.h）表示。

内毒素限值计算举例（一）：A注射剂的人体最大用量为每小时1.5g，每公斤每小时体重的剂量为1.5g/60kg=0.025g/kg=25mg/kg，内毒素限值L=K/M=(5EU/kg)/( 25mg/kg ) =

0.2EU/mg。在细菌内毒素检查法中，细菌内毒素标准品和鲎试剂常常以EU/ml表示，所以在具体实验中样品的内毒素的限量可以转换为EU/ml的表示方法，可使实验操作计算更为方便。假定产品A的浓度为100mg/ml（或原料药经溶解后的浓度为100mg/ml）, 那么，将产品A的限值从EU/mg转变为EU/ml时，内毒素限值L= 0.2 EU/mg 100 mg/ml = 20 EU/ml。内毒素限值计算举例（二）：B注射剂的临床最大用药剂量为1g/m2，规格为50mg/ml，内毒素限值L=（193 EU/ m2）/（1g/m2）=193 EU/g=0.193 EU/mg，转换为EU/ml 表示时，L = 0.193 EU/mg50 mg/ml=9.65EU/ml。

大输液品种的限值一般定为0.5EU/ml，灭菌注射用水则定为0.25EU/ml。内毒素限值没有考

虑到几个药物联合用药问题，但一般情况下，药品中内毒素的含量远低于限值，并且药品生产厂家的内控标准严于注册标准，所以药典内毒素限值也被称为最大允许内毒素浓度（Maximum allowable endotoxin concentration）。

2、样品最大有效稀释倍数或最小有效浓度的计算

最大有效稀释倍数(MVD)是指在所选择的鲎试剂灵敏度条件下，对产品进行最大倍数的稀释，仍能够进行内毒素限值的检测，此时所允许稀释的最大倍数。 MVD的计算公式为：当被规定的内毒素的限值以体积表示时， MVD=内毒素限值L（EU/ml ）/鲎试剂灵敏度（λ）；当内毒素的限值以重量或药品的生物活性(EU/mg或EU/u)表示时， MVD=内毒素限值L（EU/mg 或 EU/u）×供试品溶液的浓度C/ 鲎试剂灵敏度(λ)。在凝胶法中，λ=鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），在浊度法或显色法中, λ=所使用标准曲线上最低点的内毒素浓度（EU/ml）。最小有效浓度（MVC）是指在所选择的鲎试剂灵敏度条件下，将产品稀释到一定浓度，仍能够进行内毒素限值的检测，此时所允许的最小浓度。计算MVC的一般公式为：MVC=鲎试剂灵敏度（λ）/内毒素限值（L）。对所选定的鲎试剂灵敏度来讲，MVC是一个绝对值；而MVD 对特定的产品浓度是特异的，浓度变化时，MVD也会随之发生变化。

3、方法学验证试验的预试验

确定了样品的内毒素限值，考察了样品的溶解性，并且选定了一定灵敏度的鲎试剂，此时便可以考虑进行预试验。尽管法规中并不要求进行预试验，但在细菌内毒素检查法的建立过程中，一般需要进行预试验。预试验的主要目的是确定不出现干扰的第一个样品稀释度，也就是不干扰浓度（non-interfering concentration, NIC），为后续的验证试验选择适当的样品稀释度（或浓度）。

不管采用凝胶法还是光度法，预试验都是对一系列样品的稀释液进行试验，在每一个稀释浓度，都有一组添加内毒素的样品和一组不添加内毒素的样品，添加内毒素的浓度保持不变，而样品浓度会逐级稀释，但最终样品的稀释倍数不得超过MVD。可以采用直接把内毒素添加到样品溶液中，添加内毒素的体积宜小，以免导致样品溶液被稀释，一般添加体积等于或小于样品体积的10%为宜；也可以采用下述方法添加内毒素，就是将两倍于终浓度的内毒素溶液与两倍于终浓度的样品溶液等体积混合，内毒素和样品溶液间相互稀释，得到两者所需终浓度的混合液。添加内毒素的浓度，凝胶法为2λ；终点显色法为4λ（这里的λ表示标准曲线上的最低点，也就是方法的检测限）。动态显色法则有3种选择添加内毒素浓度的方法，可以选择标准曲线的中点浓度，也可以与终点比色法一样，选择4λ。此外，当样品稀释液中，内毒素的限值小于或等于1.0EU/ml时，添加内毒素的浓度可定为0.1-0.5EU/ml之间，当样品稀释液中，内毒素的限值大于或等于1.0EU/ml时，添加内毒素的浓度可定为

1.0-5.0EU/ml之间。

对于凝胶法的结果判断，不添加内毒素的样品不应该凝集，如果发生凝集说明含有内毒素或内毒素样物质；添加有内毒素的样品应该出现凝集，若没有发生凝集表明样品凝集反应被抑制。光度法的结果判断标准为，测得的添加内毒素的量应该在已知添加量的±50%范围内，超出范围（多或少）表明存在增强或抑制作用。

通过预试验结果可以确定验证试验中样品的稀释度或浓度，其选择的基本原则包括：经稀释后的样品含内毒素的量应尽可能少，比其内毒素限值至少少4倍，最好检测不到内毒素。要求验证试验选择的稀释度至少要比NIC大1-2倍，但不可超过MVD。若样品需要多支合并进行验证试验，此时试验不可采用原来的MVD，因为假定合并样品中有一瓶存在污染，其它瓶没有污染，污染瓶含有的内毒素就会被其它没有污染瓶样品所稀释，并低于MVD，从而检测不到污染的样品。因此，采用合并样品进行试验时，MVD应降低，这种情况下的MVD等于原来的MVD除以合并样品的数量。

例如：假定鲎试剂的标示灵敏度λ为0.125EU/ml，样品的MVD为100（倍）。

预试验结果表明样品在1：8倍稀释时，具有抑制作用，不干扰浓度（NIC）为1:16，可选择用于验证试验的稀释度或浓度为最低不小于1:32，可以选择1:64。

4、方法学验证试验（增强/抑制试验）

验证试验在细菌内毒素方法学的建立过程中具有十分重要的作用，主要目的是确证检测内毒素的方法是否受样品的干扰。验证试验的特点是样品浓度保持不变，添加内毒素的浓度逐渐降低。在建立细菌内毒素检查方法中，验证试验前，要去除样品可能含有的内毒素，以确保建立方法的准确可靠。凝胶法的验证试验是通过在细菌内毒素检查用水和样品溶液中平行进行鲎试剂标示灵敏度的复核试验完成，试验中要求样品平行4管，设立样品阴性对照管，也同样平行4管。尽管要求添加内毒素标准平行管数量各国不完全一致，可以2管，也可以4管，但鉴于目前国内的具体情况，在2005年版药典附录的细菌内毒素检查法中规定是平行4管。细菌内毒素检查用水和样品溶液中的反应终点浓度的对数平均值（内毒素含量）必须在鲎试剂标示灵敏度的2倍范围以内，在样品溶液和细菌内毒素检查用水中的反应终点浓度的对数平均值也应相互在2倍范围之内（2λ~0.5λ）。光度法的验证试验中，要求阴性对照所含有的内毒素必须明显低于标准内毒素曲线中的最小浓度，阳性对照的内毒素回收率，在扣除样品可能含有的内源性内毒素后，必须在已知添加内毒素量的50%～200%之间，添加和未添加内毒素的样品管数量至少要平行2管。

二、细菌内毒素检查方法建立时注意事项及常见问题

1、在方法建立的过程中，对方法的验证非常重要

一个全面可靠的细菌内毒素检查法的方法学验证试验一般应注意：首先要了解产品的溶解度，按照适当的临床用量确定合适的内毒素限值，并确证产品对方法是否存在干扰，如果在样品处理过程中运用了激烈的处理条件或溶剂，还应证明所采用方法不会破坏或减少样品中细菌内毒素含量。其次应考察样品批与批之间的差异是否会引起方法学变异。此外，还应注意实验中涉及到的试验器材对方法学的影响，如：器皿的控制、鲎试剂标示灵敏度（或光度法检测用鲎试剂的检测限）等。最后，要确保仪器的运行状态和对实验过程的准确记录。总之，只有验证了整个实验的每一个环节，才能保证方法学的可靠和成功。方法学验证终究是为药品生产质量服务的，验证本身也是一个动态的过程，是随着生产工艺、环境和检验条件改变而变化的。方法学验证实验记录，要抓住要点，将试验关键步骤记录详细，避免验证资料照抄药典附录，罗列一大堆规定，最终没有明确的方法及可操作性。

2、内毒素限值的确定十分关键

在细菌内毒素检查方法的建立中，计算内毒素限值L、MVD和MVC时，需要注意最大人用剂量、产品规格、鲎试剂的灵敏度等重要的参数，因为计算错误会导致后续的所有努力均告失败。常见的问题有：（1）临床用药剂量确定不正确，仅用常规用药剂量，未考虑临床可能的人体最大用药剂量和给药途径，在限值计算公式L=K/M中，由于对K值及M值的定义模糊，使K值及M值赋值不准确，最终导致限值计算错误。例如，某注射剂临床成人每次静脉滴注给药40～80mg，婴儿（三个月以上）静脉滴注给药每次10～20mg。按成人（体重60kg）剂量计算限值为3.75EU/mg，而婴儿体重仅为5kg左右，计算限值约为1.25EU/mg，如果不考虑临床每公斤体重最大用药剂量，细菌内毒素限值就会出现较大的差别。（2）有的申报品种细菌内毒素限值不是根据临床用量计算出来，而是根据同品种热原检查的剂量推算出来的，造成限值错误。（3）有的品种细菌内毒素限值从国外药典抄来，没有考虑该品种国内上市的临床使用剂量及中国人与国外人均体重等的差异，也造成限值确定不正确。（4）错误的计算日给药剂量（一日内多次给药）。（5）在品种规格（浓度）发生变化时，计算MVD 没有进行调整。（6）建立方法时所用的最大给药剂量已经超出了临床所用剂量等。

3、在进行干扰试验预试验时不干扰浓度的确定方法不正确

对预试验的目的不理解，直接选用一个灵敏度的鲎试剂对应的MVD或MVC进行试验，如无干扰则以该浓度为不干扰浓度，有的甚至直接选用高灵敏度的鲎试剂对应的浓度作为不干扰浓度，未找到真正的不干扰浓度，使干扰试验失去意义。也有的申报单位仅选择1～2个样品浓度进行试验，同样使试验缺乏完整性。

4、供试品阳性溶液配制浓度（方法）不对

在使用简便方法配制供试品阳性溶液时，应将供试品溶液与细菌内毒素标准品溶液等量混合、稀释。如：配制含4倍稀释供试品溶液的细菌内毒素标准品溶液，应使用2倍稀释供试品溶液和4λ细菌内毒素标准品溶液等量混合、稀释。常见有的配制过程中直接使用4倍稀释供试品溶液或2λ细菌内毒素标准品溶液浓度等量混合，造成配制的供试品阳性溶液中细菌内毒素标准品或供试品浓度低一倍。

5、仅使用一个厂家的鲎试剂或一个批号的样品进行干扰试验，没有足够的代表性

2005年版药典明确规定细菌内毒素检查进行干扰试验时，应同时使用两个以上厂家生产的鲎试剂对至少三个批号的样品进行试验，但有的申报单位仅用一个厂家的鲎试剂或仅对一个批号的样品进行试验。因为大部分注册药品其生产工艺、所使用的敷料等均不是很稳定，不同厂家生产的鲎试剂其抗干扰能力也不尽相同，因此仅用一个厂家的鲎试剂或仅对一个批号的样品进行干扰试验，没有足够的代表性，确定的不干扰浓度可能在后续的试验中不准确。

6、错误认为一定要按最大有效稀释倍数（MVD）或最小有效浓度（MVC）进行试验

实际上，有的样品浓度很高也不干扰鲎试剂与内毒素的凝集反应，这种情况下，只要样品内毒素含量合格，可以在MVD范围之内，即小于MVD的倍数下进行试验。又如对样品进行检查

时，也可以先用原液（预试验时原液无干扰）进行试验，如果内毒素检查也能合格，则不必进行稀释，这样做的直接好处是可以节约成本和时间，减少污染环节。如果一个样品在小于MVD的情况下试验时样品阳性管有干扰，或样品管为阳性，则可按MVD进行相对应的稀释后重新试验。如：某注射液，说明书中临床静脉给药最大剂量为7mg/h，制剂规格为10mg/ml，计算内毒素限值为420EU/ml，所采用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，计算MVD＝1680倍。显然内毒素限值确定不正确（人体对细菌内毒素的最大耐受量为300EU/h ），已超过了人体对细菌内毒素的最大耐受量；另外选择最大有效稀释倍数的稀释液进行试验，每次实验时要对样品进行1680倍的稀释，会使实验变得繁琐，不利于操作。

7、应严格执行中国药典2005年版细菌内毒素检查的有关规定

药典规定：（1）当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项品种建立内毒素检查法时，需进行干扰试验；（2）当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，需重新进行干扰试验。这就要求在提供的申报资料中应提供相关的方法学验证资料，以证明方法的可行性及有无干扰的存在。只有严格按照有关要求进行了干扰试验，并证明该条件下无干扰，才能建立新的检查方法。有些错误的认为国内或国外已有生产的品种，方法学验证就可以不做，以至有些新药、仿制药未进行系统的干扰试验。

细菌内毒素检查

细菌内毒素检查 1、实验原理 2、实验试剂 3、试验器具 4、检查方法概述 5、供试品溶液的制备 6、内毒素限值的确定 7、最大有效稀释倍数（MVD）的确定 8、鲎试剂灵敏度复核 9、干扰试验 10、供试品的细菌内毒素检查 1、实验原理：利用鲎试剂与微量内毒素产生凝聚反应的现象，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。 2、实验试剂： ①鲎试剂：从海洋无脊椎动物“鲎”的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥精制的生物制剂。 鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效浓度表示，即鲎试剂的灵敏度，单位为EU/ml。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 ②细菌内毒素国家标准品：系自大肠埃希菌提取精制得到的内毒素，用于标定细菌内毒素工作标准品和标定，仲裁鲎试剂灵敏度。 ③细菌内毒素工作标准品：系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 ④细菌内毒素检查用水：指内毒素含量少于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005 EU/ml （用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。 3、实验器具：刻度吸管、凝聚管（10×75mm）、三角瓶、小试管（10×100mm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。 耐热器皿常用干热灭菌法（250℃，30分钟以上）去除，塑料用具应选用无内毒素并且对试验无干扰的器械（目前多为无热源的一次性用品）。 4、检验方法概述 ①凝胶法：限量法、半限量法 ②光度测定法：浊度法（终点浊度法和动态浊度法）、显色基质法（终点浊度法和动态浊度法） 凝胶法：最简单、经济、应用广泛、中国药典的“仲裁”方法，对干扰相对不敏感，较光度测定法不灵敏。 5、供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸取制成供试品溶液。 一般要求供试品溶液的PH值在6.0～8.0的范围内。 可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节PH值。 6、内毒素限值的确定 一般按公式：L≡K／M 式中： L为供试品的细菌内毒素限量，以EU／ml，EU／mg、或EU／U（活性单位）表示。

中国药典2010年版《细菌内毒素检查法》

中国药典2010年版《细菌内毒素检查法》 ——凝胶法 凝胶法 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc). λc=1g-1(∑X/4)

式中 X为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。 Es= 1g-1(∑Xs/4) Et= 1g-1(∑Xt/4) 式中，Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（1g）。当Es在0.5λ—2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es—2Es (包括0.5Es 和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。 表1 凝胶法干扰试验溶液的制备

细菌内毒素检查标准操作规程

细菌内毒素检查标准操作规程 1 简述 1.1 本规范适用于中国药典2005年版附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。当 测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.2 供试品细菌毒素限值的确定。 （一）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值； （二）尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值： L=K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/h表示。其中注射剂，K=5EU/kg/h；放射性药品注射剂，K=2.5EU/kg/h；鞘内用注射剂， K=0.2EU/kg/h。 M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人 均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。 1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定 供试品的最大有效稀释倍数（MV D）按下式计算： MV D=C?L/λ L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml；当L的单位以EU/mg或EU/U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg/ml 或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MV D取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C: λ/L。

内毒素法

细菌内毒素检查法标准操作规程 1 目的 建立细菌内毒素检查法的标准操作规程。规范细菌内毒素检验操作，确保检验数据的准确性。 2 范围 适用于细菌内毒素的检验操作。 3 职责 3.1 质量控制部检验人员对具体操作负责； 3.2 质量保证部负责监督本规程的执行。 4 定义 无 5 内容 5.1 概述与原理 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。 基本原理：鲎试剂是鲎血液细胞提取物的冻干品，主要包含4种成分，分别是C 因子、B因子、凝固酶原和凝固蛋白原。细菌内毒素检查法主要依靠细菌内毒素可以活化其中的C因子，使鲎试剂发生一系列的酶联反应，最终形成凝胶或使凝固酶活化某些外加的显色集团（显色法）的原理，来检测细菌内毒素的量。 细菌内毒素的活性单位有两种表达方式，即EU和IU。美国、中国和日本扥国家使用EU，欧洲地区使用IU。在活性量值上，1EU=1IU，计算是可以互换。 5.2 仪器与用具 5.2.1 电子天平、电热干燥箱、时钟、水浴锅、温度计、试管架、漩涡器、剪刀、无菌封口膜、无热原吸头、试管、砂轮、移液枪，75%乙醇、木棉等。 5.2.2 细菌内毒素标准品 细菌内毒素标准品按级别分为国际标准品、国家标准品和工作标准品。其中，国际标准品是由WHO制备，在世界范围内进行效价的协作标定，主要用于世界各国标定各自国家的标准品之用，细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价。在细菌内毒素检查试验中，应使用细菌内毒素国家标准或细菌内毒素工作标准品。 5.2.3 细菌内毒素检查用水：内毒素含量小于0.015EU/mL（凝胶法），且对内毒素试验无干扰作用。 5.2.4 鲎试剂：一批新的鲎试剂在首次使用时要先进行灵敏度复核，结果符合药典规定后，方可用于后续试验。制备或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂试验。

细菌内毒素检查法---------------操作规程

******有限公司 标准操作规程 目的 建立细菌内毒素检查操作规程，保证检测结果的准确性。 适用范围 所有原料、成品的细菌内毒素检查。 责任人 QC检验员 内容 1 简述 1.1 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。 1.2 细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法。供试品检测时可使用其中任何一种方法。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.3 本规范适用于凝胶法检查。凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 1.4 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示 1.5 细菌内毒素国家标准品(NSE)系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 1.6 细菌内毒素工作标准品(WSE)系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 1.7 凝胶法细菌内毒素检查用水(BET水)系指内毒素含量小于0.015Eu/ml灭菌注射用水。光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005Eu/ml。 1.8 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素

******有限公司 标准操作规程 的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 1.9 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和生产工艺或试验环境有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。 1.10 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。 2实验材料及用具 2.1 天平供试品称量用，感量为0.1mg以下。 2.2 电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能维持250℃以上至少一小时。 2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器，应能在37土1℃保持一小时。 2.4 水银温度计或酒精温度计，精度在1℃以下。 2.5 旋涡混合器 2.6 鲎试剂(应具有国家主管部门的批准文号)及细菌内毒素检查用水(符合规定)。2.7 细菌内毒素国家标准品(NSE)，细菌内毒素工作标准品(WSE)，除另有规定外应由中国药品生物制品检定所统一发放。 2.8 实验用具移液管(或刻度吸管，定量移液器)、凝集管(103 75mm)、三角瓶、小试管(163100mm)、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮所用玻璃器皿须经250℃干烤至少1小时。塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。 2.9 试剂 75%乙醇、蒸馏水、5%重铬酸钾硫酸洗液。 3 操作方法 3.1 试验准备 3.1.1 洗液的配制配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。 3.1.2 玻璃器皿的洗涤将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗液中浸泡4小时，取出将洗液滤干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中。

细菌内毒素检查操作规程

GMP管理文件 一、引用标准：中华人民共和国S药典（2005年版）一部。 二、目的：本标准规定了细菌内毒素检查法标准操作规程。 三、适用范围：适用于细菌内素毒素的检查。 四、责任者：质检人员。 五、正文： 1、简述本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以供试吕中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。 细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 细菌内毒素工作标准系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量含量小于

0.015EU/ml的灭菌注射用水。光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250℃干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的PH值在6.0～8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，何使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节PH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 最大有效稀释倍数（MVD）的确定最大有效稀释倍数是指在试验中供试品被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD： MVD＝Cl/λ C为供品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有

中华人民共和国国家标准细菌内毒素检测方法

医用输液、输血、注射器具细菌内毒素检验方法 中华人民共和国国家标准 GB/T14233.2—93 1993-03-16发布 一、定义及适用范围:本法系列用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应 的机理，以判断供试品中内毒素限量是否符合规定的一种方法。 用以代替家兔法对供试品进行热原初试。本法仅适用于一次性使用输液器、输血器。其他产品可参照使用。 二、主要设备:超净工作台、电热干燥箱、恒温水浴。 三、试剂 1、细菌内毒素国家标准品：用于仲裁鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。 2、细菌内毒素工作标准品：用于标定鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。 3、鲎试剂：灵敏度为0.25EU/ml，规格为0.5ml。 4、无热原水：内毒素含量小于0.05EU/ml。 四、试验前准备 1、器具除热原:与试验液接触的所有器具均应除热原。玻璃器具置电热干燥箱内250℃干烤至少60min；塑料器具置30%双氧水中浸泡 4h，再用无热原水冲洗后于60℃烘干备用。 2、鲎试剂灵敏度测定 （1）试验前应核对使用批号鲎试剂的灵敏度，应符合规定。 （2）灵敏度测定：根据标示的灵敏度范围，将细菌内毒素工作 标准品用无热原水以1→2等比稀释，选择能出现阳性和阴性结果的4个连续稀释液。取同一批号鲎试剂若干支，分别按标示量

加入无热原水溶解为鲎试剂溶解液。取10mm×75mm试管若干 支，分别加入0.1ml鲎试剂溶解液，加入内毒素稀释液0.1ml，每一稀释液平行操作4管，轻轻振动试管混匀内容物，封闭管 口，置37±1℃恒温水浴中保温60±2min观察结果。最高浓度的4管应均为阳性，最低浓度的4管应为阴性。 五、试验方法 1、供试品数量 :同一批号至少3个单位供试品。 2、浸提介质:无热原水。 3、供试液制备:在无菌条件下，每套输液器内腔注入10ml，输血器内腔注入15ml浸提介质，反复荡洗5次后两端密封，置37±1℃恒温箱中保温2h，取出后将供试液汇集至一无热原具塞玻璃容器内。供试液贮存应不超过2h。 4、试验步骤:将鲎试剂和细菌内毒素工作标准品分别按标示量加入无热原水溶解。细菌内毒素工作标准品逐次稀释至0.5Eu/ml，供作阳性对热。取10mm×75mm试管6支，其中供试品管2支各加入0.1ml 内毒素工作标准品稀释液，阴性对照管2支各加入0.1ml无热原水，阳性对照管2支各加入0.1ml内毒素工作标准品稀释液，再逐一加入0.1ml鲎试剂溶解液。轻轻混匀试管内容物，封闭管口，垂直放入37±1℃水浴中保温60±2min，轻轻取出，观察结果。 5、结果判定 1)、将试管缓慢倒转180°，管内容物呈坚实凝胶者为阳性，记录为（+），不呈凝胶状或虽呈凝胶状但不能保持完整者为阴性，记录为（-）。

细菌内毒素检查验证方案

纪律作风整顿
细菌内毒素检查验证方案
文件编号：VP-QC-2015-06
起 草 人： 审 核 人： 批 准 人： 批准日期：
年月日
.1

1 概述
纪律作风整顿
目录
1 2 验证目的及范围
1 3 验证小组人员组成及职责
1 4 验证依据
2 5 验证前准备
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纪律作风整顿
2 6 验证的实施
2 7 偏差处理
5 8 验证数据及评估
9 验证报告及评审
10 再验证及周期
5 5
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纪律作风整顿
5 11 验证文件及归档
5 12 附件
5
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纪律作风整顿
1 概述 细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌内毒
素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查报告两种发放，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度
法和显色基质法，供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。公司自行 制备的注射用水需进行细菌内毒素的检查，本方案将采用凝胶法进行试验。
2 验证目的和方法 本验证方案适用于注射用水的细菌内毒素的检查，通过对鲎试剂灵敏度复核试验、 干扰试验及凝胶限度试验，建立该产品的细菌内毒素检查方法，并对其有效性进行评 价，确保检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。 3.验证小组人员组成及职责：
3.1 验证小组由以下部门人员组成：质量部、QC、生产部。
3.2 验证小组组成及职责列表
组成 QC
质量部 生产部
职责
1. 负责起草验证方案的起草 2. 负责本方案的培训 3. 仪器仪表校验确认 4. 负责验证的实施 5. 负责数据的收集和整理 6. 负责数据分析 7. 负责完成验证报告
1. 负责验证方案、验证报告的审核与批准 2. 负责验证现场的监督审查
1. 负责保障设备、器具的完好 2. 负责动力系统的保障
4 验证依据
《中华人民共和国药典》2015 版 1143 细菌内毒素检查法
5.验证前准备
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细菌内毒素定量检测临床意义

细菌内毒素定量检测的临床意义 1.细菌内毒素的本质 细菌内毒素为革蓝氏阴性菌及某些阴性菌样微生物，如立克次体、螺旋体、衣原体细胞壁外膜中的一种脂多糖（Lipoplydscharide, LPS）成分，它往往在细菌生长时释放或细菌死亡时裂解出来。 2.细菌内毒素在机体内反应及临床表现 微量的细菌内毒素进入机体后即可引起机体内发热、血管扩张、血管通透性增加、中性粒细胞增多、补体激活、机体血压下降等一系列病理、生理反应，严重时可导致弥漫性血管内凝血（DIC）及多器官功能衰竭直至休克、死亡。细菌内毒素(内毒素)作为革蓝氏阴性菌细胞壁最外层中的脂多糖(LPS)，当严重细菌感染以及脓毒血症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的浓度升高，而自身免疫过敏和病毒感染时内毒素水平不会升高，但局部有限的细菌感染，轻微的感染不会导致其升高。内毒素水平的升高一般出现在严重休克，全身性炎症反应综合症(SIRS)和多多脏器功能紊乱综合症(MODS)，无细菌性感染患者中水平通常低于那些有细菌性病灶的患者，而从肠道释放因子或细菌移位可能引起诱导。 3.细菌内毒素水平检测在临床上应用 体液细菌内毒素水平检测是诊断和监测细菌性(尤其是革蓝氏阴性菌)疾病感染的一个重要参数，通过内毒素水平的定量快速检测可以预示： (1)作为一个急性重要参数用来鉴别诊断细菌性和非细菌性感染和炎症。(2)监测有感染危险的患者(如外科术后和器官移植后免疫抑制期以及多处创伤后)以及需要重症监护患者，用来探测细菌感染的全身影响或检测脓毒性并发症。(3)评价严重炎性疾病临床进程及预后，如腹膜炎、脓毒症、SIRS和MODS。4.体液内毒素水平测定的临床意义 体液内毒素水平是严重细菌性炎症(尤其是革蓝氏阴性菌)的一个重要的特异性指，而且也是脓毒症和炎症活动有关的多脏器衰竭的可靠指标。内毒

细菌内毒素检测方法验证

细菌内毒素检测方法验证方案 起草人 起草日期 审核人 审核日期 批准人 批准日期

目的-------------------------------------------------------------------------范围-------------------------------------------------------------------------责任人----------------------------------------------------------------------内容------------------------------------------------------------------------- 1.实验材料及用具------------------------------------------------------- 2 实验准备---------------------------------------------------------------- 3.具体验证步骤----------------------------------------------------------3.1. 鲎试剂灵敏度复核------------------------------------------------3.2..干扰实验-------------------------------------------------------------- 3.3.供试品细菌内毒素检查-------------------------------------------- 4.验证结论--------------------------------------------------------------附： 表1.鲎试剂灵敏度复核记录 表2.干扰试验记录 表3.细菌内毒素检查记录

细菌内毒素检查方法

细菌内毒素检查方法综述 【关键词】细菌内毒素检查法；,,,机理；,,,预实验；,,,特殊值 细菌内毒素检查是静脉、鞘内给药药物以及放射性药物等质量检查的一个重要方面。以前，细菌内毒素检查用家兔热原法进行，自从1980年《美国药典》第20版收载了细菌内毒素实验以来，《英国药典》《欧洲药典》《日本药局方》《中国药典》等相继收载了该方法。1995年《美国药典》第23版已收载了471种药品进行细菌内毒素检查，而《中国药典》1995年版也收载了12种药品进行细菌内毒素检查［1］，2000版更收载有47种药品利用此方法进行热原检查。细菌内毒素检查法已逐渐代替家兔热原检查法，显示出其在检查热原方面的重要性。本文对细菌内毒素检查法作一综述。 1 方法、机理及影响因素 1.1 应用的方法目前，美国药品食品管理局（FDA）承认3种鲎试剂检测细菌内毒素含量的方法，即凝胶（gelclot）法、生色（chromogenic）法和动态浊度（keniticturbidimetry）法［2］。近年来较新的方法有水箭电泳免疫法（测残余蛋白）、酶联免疫吸附法（测残余酶）。后者所需鲎试剂仅相当于凝胶法的1/100，且灵敏度更高，抗干扰能力更好。《中国药典》1995年版只采用凝胶法。凝胶法是将等体积的供试品溶液和新配制的鲎试剂（TAL）溶液在试管中混匀，一般各0.1 ml，（37±1）℃反应（60±2）min。如果被检测的溶液不含干扰凝集反应的因素，且其含有内素素浓度等于或大于所用鲎试剂的灵敏度（λ）时，就会在试管中显示阳性反应，即形成凝胶；否则呈阴性反应，即呈澄明溶液或轻度混浊，视内毒素的浓度而定［1］。该反应极其灵敏，凝胶形成速率与内毒素浓度成正比，并受温度、反应物中Ca2 /Mg2 离子浓度和pH等因素的影响［3］。同样，《中国药典》2000年版也只采用凝胶法。淘金者https://www.wendangku.net/doc/6515292046.html, 1.2 凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理见图1。 图1 凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理（略） 2 影响细菌内毒素检查的因素 2.1 检品的干扰pH值、离子浓度以及某些干扰成分，都会影响到检查结果的准确性，得到所谓“假阳性”或“假阴性”结果。只有证实检品对凝集反应无干扰之后，检查的结果才是可信的。判断检品是否有干扰要做检品的干扰实验。

药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法

药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法

1143 细菌内毒素检查法 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。 本试验操作过程应防止内毒素的污染。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公

细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题.

细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题 摘要：本文对细菌内毒素检查方法的建立、限值的确定、方法学验证及常见问题进行了介绍。在建立细菌内毒素检查法之前，应尽可能多的收集有关该药品的基本信息，例如：有关样品的溶解性信息，推荐的稀释液，在水中的溶解度，以及最适溶剂；样品的pH范围；分子量大小；产品规格、体积或重量；拟用于临床的用法和用量等等。以便选择合适的样品处理方法和内毒素检查方法，对于早期研发阶段的药物，应选择合适的赋形剂，以有利于细菌内毒素检查中对样品的稀释处理。此外，在确定内毒素限值时还应尽可能采用最大人拟用剂量，为临床安全性和有效性研究中增加剂量留出空间。 一、细菌内毒素检查方法建立的主要步骤 对某一新化合物建立细菌内毒素检查方法时，首先应根据人体最大日给药剂量和给药途径，计算和确定样品的内毒素限值，选择合适的鲎试剂，根据临床规格，计算最大有效稀释倍数，稀释产品，并在低于最大稀释倍数的浓度下进行检查。可以采用凝胶法，也可以采用终点法或动态法。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。 1、细菌内毒素限值的确定 一个药品在投放市场前，它是否满足内毒素限值的要求？样品的内毒素含量具体是多少？这些问题不但关注用药安全，还应该最大限度的提供有关内毒素含量的准确信息，为药品生产过程中质量控制提供警戒信息。尽管细菌内毒素检查方法的建立是一个科学方法的研究过程，但其最终目的还是要为控制药品质量服务。因此，在方法建立时，不但要阐明限值的合理性，考虑技术可能达到的限值，同时还要满足相关药品管理法规的要求。 研究人员在建立方法的早期，一般会按照临床建议的最大人用剂量确定一个非正式的限值，这个限值可以根据实验室可以达到的最低检测水平，把限值订的相对比较严格，但往往由于早期的临床剂量会比最终上市的临床剂量高几倍，所以严格的限值，可能会使得正式生产时很多产品不能通过检查，从而造成不必要的浪费；因此参按照法规允许的最高水平，酌情确定样品的限值。 样品内毒素限值的确定一般与临床人体最大给药剂量有关，剂量越大，单位重量或体积的内毒素限值越低。一般按以下公式计算：内毒素限值L=K/M。式中内毒素限值L是以EU/ml、EU/mg或EU/u表示；K为按规定的给药途径，人体每公斤体重每小时最大可耐受的内毒素剂量，以EU/（kg.h）表示，注射剂K=5EU/（kg.h），其中放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg.h），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg.h）。一般我国人群平均体重按60kg计算，人体对细菌内毒素的最大耐受量为300EU/h；另我国人体的平均体表面积按1.55m2计算，人体每平方米的最大耐受剂量为(300EU/h)/ 1.55m2 =（193EU/h）/ m2 。 M为人体每公斤体重每小时接受的最大给药剂量，以ml/（kg.h）、mg/（kg.h）或u/（kg.h）表示。 内毒素限值计算举例（一）：A注射剂的人体最大用量为每小时1.5g，每公斤每小时体重的剂量为1.5g/60kg=0.025g/kg=25mg/kg，内毒素限值L=K/M=(5EU/kg)/( 25mg/kg ) = 0.2EU/mg。在细菌内毒素检查法中，细菌内毒素标准品和鲎试剂常常以EU/ml表示，所以在具体实验中样品的内毒素的限量可以转换为EU/ml的表示方法，可使实验操作计算更为方便。假定产品A的浓度为100mg/ml（或原料药经溶解后的浓度为100mg/ml）, 那么，将产品A的限值从EU/mg转变为EU/ml时，内毒素限值L= 0.2 EU/mg 100 mg/ml = 20 EU/ml。内毒素限值计算举例（二）：B注射剂的临床最大用药剂量为1g/m2，规格为50mg/ml，内毒素限值L=（193 EU/ m2）/（1g/m2）=193 EU/g=0.193 EU/mg，转换为EU/ml 表示时，L = 0.193 EU/mg50 mg/ml=9.65EU/ml。 大输液品种的限值一般定为0.5EU/ml，灭菌注射用水则定为0.25EU/ml。内毒素限值没有考

中国药典版《细菌内毒素检查法》.pdf

中国药典XXXX年版《细菌内毒素检查法》 ——凝胶法 凝胶法 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc). λc=1g-1(∑X/4)

式中 X为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。 Es= 1g-1(∑Xs/4) Et= 1g-1(∑Xt/4) 式中，Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（1g）。当Es在0.5λ—2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es—2Es (包括0.5Es 和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。 表1 凝胶法干扰试验溶液的制备

细菌内毒素检查验证方案

细菌内毒素检查验证方案文件编号：VP-QC-2015-06 起草人： 审核人： 批准人：

批准日期：年月日

目录 1 概述 1 2 验证目的及范围 1 3 验证小组人员组成及职责 1 4 验证依据 2 5 验证前准备 2 6 验证的实施 2 7 偏差处理 5 8 验证数据及评估 5 9验证报告及评审 5 10 再验证及周期 5 11 验证文件及归档 5 12 附件 5

1 概述 细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查报告两种发放，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法，供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。公司自行制备的注射用水需进行细菌内毒素的检查，本方案将采用凝胶法进行试验。 2 验证目的和方法 本验证方案适用于注射用水的细菌内毒素的检查，通过对鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验及凝胶限度试验，建立该产品的细菌内毒素检查方法，并对其有效性进行评价，确保检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。 3.验证小组人员组成及职责： 3.1验证小组由以下部门人员组成：质量部、QC、生产部。 3.2 验证小组组成及职责列表

4 验证依据 《中华人民共和国药典》2015版1143 细菌内毒素检查法 5.验证前准备 5.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。培训人员记录见附件1。 5.2 确认仪器仪表设施经过确认和校验，并填写确认记录。 6 验证的实施 6.1实验材料及用具 6.1.1电子天平 6.1.2. 电热干燥箱

细菌内毒素检查验证方案设计

细菌毒素检查验证方案文件编号：VP-QC-2015-06 起草人： 审核人： 批准人： 批准日期：年月日

目录 1 概述 1 2 验证目的及围 1 3 验证小组人员组成及职责 1 4 验证依据 2 5 验证前准备 2 6 验证的实施 2 7 偏差处理 5 8 验证数据及评估 5 9验证报告及评审 5 10 再验证及周期 5 11 验证文件及归档 5 12 附件 5

1 概述 细菌毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌毒素检查报告两种发放，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法，供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。公司自行制备的注射用水需进行细菌毒素的检查，本方案将采用凝胶法进行试验。 2 验证目的和方法 本验证方案适用于注射用水的细菌毒素的检查，通过对鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验及凝胶限度试验，建立该产品的细菌毒素检查方法，并对其有效性进行评价，确保检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。 3.验证小组人员组成及职责： 3.1验证小组由以下部门人员组成：质量部、QC、生产部。 3.2 验证小组组成及职责列表 4 验证依据 《中华人民国药典》2015版1143 细菌毒素检查法 5.验证前准备 5.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。培训人员记录见附件1。 5.2确认仪器仪表设施经过确认和校验，并填写确认记录。

6 验证的实施 6.1实验材料及用具 6.1.1电子天平 6.1.2. 电热干燥箱 6.1.3. 恒温恒湿箱 6.1.4.水银温度计 6.1.5. 旋涡混合器 6.1.6. 鲎试剂（具有国家主管部门的批准文号） 6.1. 7.细菌毒素工作标准品(由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品) 6.1.8.细菌毒素检查用水：应符合灭菌注射用水标准，其毒素含量小于0.015EU/ml，且 对毒素试验无干扰作用。 6.1.9. 实验用具:移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。 6.2实验准备 6.2.1玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器，放置入烤箱。

细菌内毒素检测方法验证方案说明

细菌内毒素检测方法验证方案 起草人__________ 起草日期________ 审核人__________ 审核日期________ 批准人__________ 批准日期________ 西安力邦制药有限公司

细菌内毒素检测方法验证方案 目的范围责任人内容1.实验材料及用具 2实验准备 3.具体验证步骤 3.1.鲎试剂灵敏度复核

3.2..干扰实验 33供试品细菌内毒素检查 4. 验证结 附: 表1.鲎试剂灵敏度复核记录 表2.干扰试验记录 表3.细菌内毒素检查记录 细菌内毒素检测方法验证方案 目的：为确保盐酸罗哌卡因一水合物细菌内毒素检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求，特制定此方案。 范围：盐酸罗哌卡因一水合物细菌内毒素检测方法 责任人：细菌内毒素检验员、QC主管 内容： 1.实验材料及用具

1.1.电子天平 12电热干燥箱 13恒温水浴箱 14水银温度计 1.5.旋涡混合器 16 鲎试剂（具有国家主管部门的批准文号） 1.7.细菌内毒素工作标准品（由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品） 1.8.细菌内毒素检查用水 1.9.实验用具：移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。 2实验准备 2.1.玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置入烤箱。 2.2.除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱 后，将烤箱调至250C，待烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤至少1小时。达到规定时间后，关断电源，待烤箱温度自然降至室 温。在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤

细菌内毒素检查标准操作规程

细菌内毒素检查标准操作规程

细菌内毒素检查标准操作规程 1 简述 1.1 本规范适用于中国药典附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。当 测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.2 供试品细菌毒素限值的确定。 （一）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值； （二）尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值： L=K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/h表示。其中注射剂，K=5EU/kg/h；放射性药品注射剂，K=2.5EU/kg/h；鞘内用注射剂， K=0.2EU/kg/h。 M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人 均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。 1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定 供试品的最大有效稀释倍数（MV D）按下式计算： MV D=C?L/λ L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml；当L的单位以EU/mg或EU/U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg/ml 或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MV D取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C: λ/L。 λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。 1.4 在使用新一批号的鲎试剂前，必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。 1.5 药典中已有规定的品种或有其它内毒素检验标准的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；其它未建立内毒素检查的品种需 先进行干扰实验，确定不干扰浓度后再进行内毒素检查。 1.6 细菌内毒素检查过程中的阴性对照、阳性对照和供试品对照必须同时进行，否则实验结果无效。 2 实验材料及用具 2.1 天平供试品称量用，精度为0.1mg以下。