HIV整合酶在大肠杆菌中的表达纯化及其应用

收稿日期2006-02-16修改日期2006-04-03

* 基金项目卫生部艾滋病防治应用性研究项目WA2002-02-01

作者简介刘连兴1980-山东省籍博士研究生研究方向为微生物学

** 通讯作者. Corresponding author. Tel: 010-********, 67871166-1050, 130********; E-mail, yshao@https://www.wendangku.net/doc/646319557.html,, liuyongsd@https://www.wendangku.net/doc/646319557.html,

郝彦玲袁国亮陈

刘邵一鸣

1中国科学院武汉病毒研究所湖北武汉 2. 中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心北京 3.

院研究生院北京100049浙江澳亚生物工程研究院有限公司310018

Expression and purification of HIV Integrase in

Application in HIV Diagnosis

YUAN Guo-liang4XU Bin4CHEN Pei

FU Jing-jing LIU Yong2**SHAO YI-ming1,2**

(1. Wuhan Institute of Virology,Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071, China; 2. National Center for AIDS/STD

HIV-1 integrase P31 of RL42 strain, a B subtype isolate, was expressed in pThioHisB vector(Invitrogen). The recombinant protein represented about 30% of total cellular proteins.

IEX. The purity of P31 protein reached more than 95%. Purified P31 antigen displayed fairly good sensitivity and specificity when prepared into immunoblot strips and tested with HIV reference sera. This work

HIV-1Integrase

采用pThioHisB系统表达HIV-1整合酶目的蛋白的表达量达到菌体蛋白的

体洗涤和离子交换层析用纯化后的

清时表现了很好的灵敏度和特异性本研究为进一步开发血清学诊断试剂盒奠定了基础

1整合酶1纯化

中图分类号R511文献标识码1

deficiency virus

染性疾病快速准确的

制艾滋病具有非常重要的意义免疫印迹试验因

其良好的特异性至今仍然被认为是筛查确证

感染的金标准我国目前

试剂主要是第一代免疫印迹试剂盒用全病毒裂解

物作为抗原存在条带位置不固定对操作人员经

验要求高无法实现自动化检测等问题

试剂盒生产工艺复杂生产规模小成本高因此

开发基于基因工程抗原的新一代免疫印迹试剂成

为发展趋势

(Integrase , IN)

码的蛋白质由

其功能是将逆转录病毒的

合到宿主细胞的基因组中

清中针对整合酶P31的抗体有很高的检出率仅次于穿膜蛋白GP41的抗体

[5]因此 P31抗原是新一代HIV 确认试剂的重要原料之一

本文将整合酶基因在大肠杆菌中高效表达并摸索了一条简单高效的纯化工艺路线在此基础上把P31抗原制备成条带免疫印迹试纸条随机抽取了多份HIV 阳性及阴性血清样品对P31抗原的检测灵敏度和特异性进行考察

1 材料与方法

1.1 实验材料

质粒pPOL 含有HIV-1 B’亚型流行株RL42的pol 基因全长序列由本室构建大肠杆菌表达载体pThioHisB 购自Invitrogen

公司大肠杆菌菌株BL21-CodonPlus 购自Stratagene

公司

限制性内切酶和其它工具酶为宝生物工程大连有限公司产品引物合成及基因测序由上海博亚公司完成凝胶填料DEAE Sepharose FF 低分子量蛋白Marker

均为安玛西亚公司产品

HIV-1阳性血清由本室保存参考血清购自中国药品生物制品检定所辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG

为北京中山公司产品 1.2 表达质粒的构建

以质粒p POL 为模板以引物P1和引物P2扩增编码整合酶P31的基因扩增产物经Bam

H 和

Nde 酶切后回收与经过相同酶切的载体pThio HisB 连接连接产物转化大肠杆菌BL21-CodonPlus 挑取阳性克隆酶切鉴定后测序验证引物

P1

5’-GGAATTCCATATGTTTCTAGATGGAATAGAT AAAGCTC-3’ 下划线表示Nde I 酶切位点引物P25’-CGGGATCCATTACTAATCTTC ATCCTGTCTA

CCTGC-3’ 下划线表示Bam H I 酶切位点 1.3 重组蛋白的诱导表达和鉴定

用鉴定正确的重组质粒pTH-P31转化大肠杆菌菌株

BL21-CodonPlus 挑取单菌落接种于含50μg/mL 氨苄青霉素的LB

培养基中

37培养过夜按1:20接种到新鲜培养基中30培养到OD 600约0.6时加IPTG 至终浓度1mmol/L 诱导约10h 后取

样SDS-PAGE 检测目的蛋白表达情况设未诱导的重组克隆作为阴性对照对表达产物做免疫印迹Western Blot 验证 [6]一抗HIV-1阳性血清按1:500稀释二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG 按1:2000

稀释 1.4 包涵体的洗涤溶解和目的蛋白的硫酸铵沉淀

离心收集诱导后的菌体悬于破碎缓冲液中高

压匀浆破碎

离心后沉淀用洗涤缓冲液洗涤两遍

洗涤好的包涵体用溶解液均匀悬起4放置

1h 离心后取上清依次加不同浓度的硫酸铵选取较纯的沉淀组分用结合缓冲液溶解SDS-PAGE 检测每步目的蛋白在上清和沉淀中的分布情况 1.5 目的蛋白的层析纯化

根据对目的蛋白的等电点分析选用DEAE Sepharose Fast Flow

填料装柱于XK16/20层析柱中柱高为10cm 3倍体积的平衡缓冲液平衡流速为

1mL/min 把处理好的蛋白样品上样平衡缓冲液平衡至基线走平其后用洗脱缓冲液线性梯度洗脱收集各穿透峰和洗脱峰SDS-PAGE

检测确定目的蛋白的分离情况 1.6 纯化的重组P31蛋白抗原在HIV 抗体检测中的

应用

纯化的重组蛋白利用狭缝电转印技术专利申请号 200410089432.0制备成抗原条带即条带免

疫印迹试纸条

用参考品血清检测依次按

1:41:401:1601:640

稀释然后再随即抽取7份HIV-1阳性临床血清标本和1份HIV-1阴性临床血清标本进行检测

2 结果

2.1 表达质粒的构建

经过扩增得到P31基因片段长864 bp 扩增产物双酶切定向克隆入载体pThiohisB 构建成重组质粒pTH-P31转化E . col i BL21-CodonPlus 得到表达P31

蛋白的工程菌株

重组质粒经酶切鉴定与预期相符测序结果表明插入的目的基因序列和读码框正确见图

1

图1 重组质粒pTH-P31的酶切鉴定

Fig.1 Restriction map of recombinant plasmid pTH-P31

M, DNA Marker DL15000

1, pTH-P31digest with Bam H + Nde

2.2 重组蛋白的诱导表达和鉴定

将获得的工程菌株进行诱导表达SDS-PAGE 检测发现一条分子量约为32kDa 的蛋白带

与预期

刘连兴, 等. HIV 整合酶在大肠杆菌中的表达纯化及其应用 415

的一致图2其表达量约为菌体总蛋白的30%经Western-blot 验证表达蛋白与HIV-1阳性血清发生较强的特异性反应图

3

图2 P31抗原蛋白在大肠杆菌中的表达

Fig.2 Expression of P31 antigen protein in E coli

M, Protein molecular weight marker 1, Uninduced pTH-P31 transformant

2, pTH-P31 transformant induced with IPTG

图3 P31抗原蛋白的Western blot 检测

Fig.3 Western blot analysis of P31 antigen protein

M. Prestained protein molecular weight marker 1, Negative control, 2. pTH-P31 transformant induced with IPTG

2.3 包涵体的洗涤溶解和目的蛋白的硫酸铵沉淀

菌体破碎后SDS-PAGE 电泳检测上清和沉淀中的目的蛋白结果表明绝大部分目的蛋白以包涵体的形式存在包涵体洗涤和硫酸铵

沉淀能去除大部分杂蛋白图

4

图4 包涵体洗涤和硫酸铵沉淀结果

Fig.4 Results of inclusion body washing and (NH 4)2SO 4

precipitation

M, Protein marker; 1, P31 antigen protein inclusion body; 2, Pellet of 5% (NH 4)2SO 4; 3, Pellet of 10% (NH 4)2SO 4; 4, Pellet of 15% (NH 4)2SO 4.

2.4 目的蛋白的层析纯化

样品经过DEAE-Sepharose FF 离子层析纯化SDS-PAGE

对穿透峰和洗脱峰分析表明目的蛋白在最先出现的洗脱峰中纯度超过了95%结果如图5所示

图5 P31蛋白离子交换层析纯化结果

Fig.5 Results of ion-exchange chromatography purification of

P31 protein

M, Protein molecular weight marker, 1, Pellet of 10% (NH 4)2SO 4; 2, Purified P31 protein.

2.5 纯化的重组P31蛋白抗原在HIV 抗体检测中的

应用

图6 条带免疫印迹检测结果

Fig.6 Strip immunoblot assay with recombinant P31 protein

1Negative serum samples; 2-8, Positive serum samples; 9, 1: 640 diluted positive serum Sample; 10, 1: 160 diluted positive serum Sample; 11, 1: 40 diluted positive serum Sample; 12, 1: 4 diluted positive serum Sample.

416 中 国 病 毒 学 第21卷

用重组蛋白制备条带免疫印迹试纸条利用HIV 阳性和阴性血清检测结果显示HIV-1阳性血清稀释640

倍仍能形成清晰的反应条带对隋机取样的7份HIV 阳性临床血清样本无漏现象与HIV 阴性血清无交叉反应如图6

3 讨论

检测HIV 特异性抗体的存在是目前判定HIV 感

染的主要方法

基于免疫印迹原理的HIV 抗体确认

试剂是判定HIV 感染的最终标准

因而

研制具有

更高灵敏度和特异性的HIV 抗体确认试剂是艾滋病防治工作的需要使用基因工程抗原代替传统的全病毒裂解抗原是HIV 抗体确认试剂的发展趋势鉴于抗P31抗体的检出率在临床血清学检测中仅次于抗gp41抗体的捡出率

[5]

而且P31抗原与HIV-2型感染

者血清存在交叉反应[7,8]研制高质量的P31抗原蛋白对发展新一代HIV 抗体确认试剂具有重要意义

国际各组织制订的HIV 抗体免疫印迹试验的阳性判定标准虽不尽相同但美国FDA. WHO.泛美卫生组织均认为P31应作为一条重要的阳性判定条带我们选择在中国广泛流行的HIV-1 B’亚型毒株

RL42

利用大肠杆菌BL21-CodonPlus 对P31抗原蛋

白进行表达为获得高表达的工程菌株我们比较

了具有不同特点的三个原核表达载体

PET43.1

PBV220和

pThioHisB

其中用pThioHisB 构建的

pTH-P31质粒表达量最高HIV 抗原P31以包涵体形式在宿主菌中表达的经多次探索我们优化了包涵体处理方法使大部分杂蛋白在层析步骤前被去除处理后的样品经过一次离子层析重组蛋白纯度可达到95%

以上纯化后的目的蛋白在检测不同

稀释度的参考品血清和随即抽取的8份临床血清样

品时表现出很高的灵敏性和特异性

本研究结果可用于研制新一代国产HIV 抗体确

认试剂盒

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Uniquely Immunodominant, Cross-Reacting Site in the Human Immunodeficiency Virus Endonuclease Protein [J]. J Virol, 1991, 65: 4543-4546.

HIV整合酶在大肠杆菌中的表达纯化及其应用

作者：刘连兴， 郝彦玲， 袁国亮， 许斌， 陈佩， 傅晶晶， 刘勇， 邵一鸣， LIU Lian-xing， HAO Yan-ling ， YUAN Guo-liang， XU Bin， CHEN Pei， FU Jing-jing， LIU Yong， SHAO YI-ming

作者单位：刘连兴,LIU Lian-xing(中国科学院武汉病毒研究所,湖北武汉,430071;中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心,北京,100050;中国科学院研究生院,北京 100049)， 郝彦玲,陈佩,傅晶晶,刘勇,HAO Yan-

ling,CHEN Pei,FU Jing-jing,LIU Yong(中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心,北京,100050)，

袁国亮,许斌,YUAN Guo-liang,XU Bin(浙江澳亚生物工程研究院有限公司,浙江杭州,310018)， 邵一鸣,SHAO

YI-ming(中国科学院武汉病毒研究所,湖北武汉,430071;中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心,北

京,100050)

刊名：

中国病毒学

英文刊名：VIROLOGICA SINICA

年，卷(期)：2006，21(5)

引用次数：0次

参考文献(8条)

1.邢玉兰Development in Diagnosis of AIDS pathogeny 2001

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1.期刊论文程绍辉.马晓慧.何红秋.刘斌.陈慰祖.王存新.CHENG Shao-hui.MA Xiao-hui.HE Hong-qiu.LIU Bin.CHEN Wei-zu.WANG Cun-xin HIV-1整合酶蛋白的可溶性表达及功能研究-中国生物工程杂志2006,26(1)

HIV-1整合酶是HIV病毒复制中一个重要的酶,也是治疗艾滋病药物的一个重要靶点.为了开展以整合酶蛋白为靶点的抑制剂筛选,构建HIV-1整合酶重组质粒,在原核细胞中进行可溶性表达和功能研究.通过重叠PCR技术引入F185K和C280S突变于HIV-1 B亚型标准株的整合酶cDNA片段中,PCR扩增片段克隆到pET-28a(+)表达载体中,构建重组质粒,在E coli中进行整合酶基因表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,亲和层析纯化蛋白,酶联免疫吸附实验方法测定整合酶的生物学活性.结果构建的重组质粒获得高效稳定的可溶性表达,ELISA实验证实该蛋白具有整合酶的3'切割DNA和5'链转移的活性.HIV-1整合酶蛋白的可溶性表达和活性研究为建立以整合酶为靶点的抗HIV药物筛选平台打下了基础.

2.期刊论文郭志敏.陈鸿珊.王琳多羟基芳香族化合物对HIV-1整合酶的抑制作用-药学学报2002,37(4)

目的研究HIV-1整合酶抑制剂,为艾滋病的治疗提供新作用靶位的抗HIV药物.方法用HIV-1整合酶ELISA法检测3种萘醌类化合物,10种白藜芦醇及其衍生物和7种吡喃香豆素类化合物对整合酶的抑制作用.结果双羟基-1,4-萘醌(NQ-2)对HIV-1整合酶有抑制活性,IC50为78.5 μmol*L-1,发现萘醌类新化合物NQ-3对HIV-1整合酶的抑制作用优于NQ-2,IC50为37.2

μmol*L-1.用分步测定法发现NQ-2主要抑制HIV-1整合酶的链转移活性,而NQ-3则对装配和链转移都有较强的抑制.结论萘醌类化合物(NQ-2,3)对HIV-1整合酶有抑制作用,NQ-3为新化合物值得进一步研究.

3.期刊论文宋伟.陈慰祖.张小轶.王存新用分子对接方法预测HIV-1整合酶与金精三羧酸抑制剂的相互作用-化学物理学报2003,16(4) 用分子对接方法(Docking)研究了HIV-1整合酶与其抑制剂金精三羧酸的结合过程.为弄清金属离子在结合中所起的作用,选择含有一个Mg+2或不含Mg+2的两种不同的整合酶受体分别与金精三羧酸对接.结果表明, Mg+2对稳定配体与受体的结合起了重要作用. 金精三羧酸配体与含有一个金属Mg+2的整合酶受体对接,最优结合自由能为-45.19 kJ/mol. 当Mg+2失去后,整合酶的活性中心构象将发生变化,使金精三羧酸抑制剂与整合酶的结合自由能(-2

4.35 kJ/mol)明显增加. 预测了未知的HIV-1整合酶与其抑制剂金精三羧酸的复合物结构, 并可对基于结构的抗HIV-1整合酶的药物设计提供重要信息.

4.学位论文刘春莉用分子模拟方法研究HIV-1整合酶与抑制剂及病毒DNA的相互作用2005

从20世纪90年代开始，随着各种理论计算方法和分子模拟技术发展，药物设计进入了一个崭新的阶段，即合理药物设计的阶段。其内容的核心是，针对酶、受体、离子通道以及核酸等潜在的药物设计靶点，并参考其它内源性配体或天然产物底物的化学结构特征设计出合理的药物分子，以发现选择性作用于某种靶点的新药；其方法的核心是对受体-配体相互作用的研究。合理药物设计已成为国际上十分活跃的科学研究领域。本论文以人体免疫缺陷病毒(HIV-1)整合酶为研究对象，用分子对接方法、分子动力学(MD)模拟方法和结合自由能计算方法研究其与已知抑制剂的结合模式、结合强度、耐药性质，以及与病毒DNA可能的结合位点，为寻找具有更好活性的抗HIV药物提供帮助。

论文主要包括以下三个方面的工作：用分子模拟方法研究HIV-1整合酶与咖啡酰基类抑制剂的相互作用；用分子对接方法研究HIV-1整合酶与病毒DNA的相互作用；HIV-1整合酶对其抑制剂S-1360的耐药性研究。

X-ray和NMR实验已经给出了HIV-1整合酶三个结构域的结构，这为基于受体结构的药物设计提供了条件。用分子对接和分子动力学(MD)模拟方法研究了一类咖啡酰基和没食子酰基类HIV-1整合酶抑制剂与整合酶之间的相互作用模式，结果表明该类抑制剂分子上的两个侧链基团(咖啡酰基或没食子酰基)与整合酶的DDE基序之间的相互作用对抑制整合酶活性起到关键作用。当侧链基团为没食子酰基时，可以提高该类抑制剂与整合酶的结合能力。采用线性相互作用能方法(LIE)计算了该类抑制剂与整合酶之间的结合自由能，预测值与实验值相吻合，均方根偏差(RMSD)为1.39kJ/mol，以上结果可为基于结构的HIV-1整合酶抑制剂设计提供有用的信息。

HIV-1整合酶是HIV-1病毒复制过程中不可缺少的一种酶，它负责将病毒DNA整合到宿主DNA上。因此从原子水平上研究整合酶四聚体与病毒DNA相互作用位点的结构信息，并对整合酶四聚体-DNA复合物结合模式进行合理的预测，对于理解整合酶的催化机理，进而进行基于结构的整合酶抑制剂设计具有重要的意义。迄今为止，HIV-1整合酶四聚体与病毒和宿主DNA的结合模式尚不十分清楚。通过同源模建的方法搭建了完整的HIV-1整合酶四聚体结构，将其与27bp病毒DNA进行分子对接，发现其结合位点在二聚体中两个单体的C端和N端形成的凹槽中。病毒DNA与整合酶四聚体的作用模式可能是与其中一个整合酶二聚体的C端区、N端区以及另一个二聚体的核心区发生相互作用的，3’端加工的病毒DNA和完整的DNA与整合酶相互作用可能没有太大的差异。研究结果与已有的光耦联和点突变实验得到的关于整合酶-DNA相互作用的信息相吻合。

在目前的抗HIV治疗中需要克服的一个关键问题是HIV对抑制剂产生耐药性突变的问题。采用分子模拟手段，从原子水平上理解HIV-1整合酶对其抑制剂S-1360的耐药性突变机制，对有针对性地设计抑制剂而降低整合酶的耐药性或通过联合用药的方法来减少其耐药性都具有非常重要的指导意义。通过模建定点突变的HIV-1整合酶，采用分子对接的方法将S-1360与不同阶段的整合酶突变体进行分子对接，研究其结合模式和结合强度，取得了与实验相吻合的结果。结果表明，HIV-1整合酶催化核心区在抑制剂S-1360存在下产生耐药性突变，改变局部构象，可通过降低靶酶与抑制剂之间的结合强度或通过改变其作用位点、作用模式的途径来降低抑制剂的抑制效率。

白的表达、纯化及复性研究-中华微生物学和免疫学杂志2007,27(10)

目的 对HIV-1整合酶蛋白进行原核表达、纯化以及复性研究.方法 从HIV-1 HXB2中PCR扩增出全长的整合酶基因,连入原核表达载体pET-30a中,得到pET-30a整合酶表达质粒.再将质粒转人大肠杆菌BL21中诱导表达,经镍柱纯化后得到整合酶蛋白.纯化后蛋白在FoldIt复性液中进行稀释复性确定最佳复性液,然后蛋白在此条件下复性并用反相柱回收,最后通过对复性蛋白抽干及再溶分析复性蛋白的物理稳定性.结果 HIV-1整合酶蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总量的10%.经镍柱纯化后蛋白的总浓度为0.9 mg/ml.蛋白的最佳复性液是:Tris-Cl 55 mmol/L,NaCl 264 mmol/L,KCl 11 mmol/L,Gu-HCl 550 mmol/L,EDTA 1.1 mmol/L,以及附加成分中的GSH、GSSG.复性后蛋白抽干后再溶,溶液清亮透明,SDS-PAGE可见有寡聚体状态的蛋白.结论 成功构建了pET-30a整合酶表达质粒.纯化后蛋白的浓度较高.确定了最佳的蛋白复性液.并且初步检测了复性蛋白的物理稳定性.这为蛋白体外活性研究和AIDS药物研究打下了基础.

6.期刊论文何红秋.程绍辉.刘斌.陈慰祖.王存新.HE Hong-qiu.CHENG Shao-hui.LIU Bin.CHEN Wei-zu.WANG Cun-xin用荧光方法检测

HIV-1整合酶的体外活性-光散射学报2009,21(2)

HIV-1整合酶是抗艾滋病药物研究的一个重要靶点.整合酶催化两步反应使病毒cDNA整合到宿主细胞基因组中,该反应过程可以在体外利用重组蛋白和DNA底物实现.本研究构建了HIV-1整合酶表达载体,在大肠杆菌中诱导表达,亲和纯化得到重组整合酶蛋白,利用荧光染料标记DNA底物分子和荧光标记抗体,通过荧光信号检测整合酶对DNA的切割和连接两步反应,达到检测整合酶体外活性的效果.该方法具有灵敏度高、特异性好等优点,便于开展以整合酶为靶点的药物筛选等工作.

7.期刊论文王丽东.王存新.WANG. Li-Dong.WANG. Cun-Xin金属离子对HIV-1整合酶与硫氮硫扎平抑制剂作用模式影响的分子模拟研究

-化学学报2008,66(7)

HIV-1整合酶(IN)通过依赖金属离子的两步反应将病毒DNA整合入宿主细胞中.结合于HIV-1上的金属离子个数的变化直接影响整合酶与抑制剂之间的结合.用同源模建方法搭建了每条单链核心区具有两个Mg2+的(2Mg-IN-Core)和具有一个Mg2+的HIV-1 IN二聚体核心区模型(1Mg-IN-Core).通过分子对接分别得到它们与硫氮硫扎平类化合物能量较低的复合物结构,并对对接结果进行了比较.研究发现:当整合酶中结合的Mg2+个数改变时,它与抑制剂的结合模式也会发生很大的变化;抑制剂能够特异且稳定地与2Mg-IN-Core模型的活性位点结合;同时与ASP64和GLU152螯合的那个Mg2+离子对于硫氮硫扎平抑制剂与整合酶上的结合有很大的影响.对2Mg-IN-Core模型与抑制剂的复合物平均结构进行了2000 ps的分子动力学模拟.分析发现同时与ASP64及ASP116螯合的Mg2+与IN蛋白形成了四个稳定的螯合键;同时与ASP64及GLU152螫合的Mg2+可与IN结合,也可与抑制剂形成稳定的配位键,这个Mg2+对IN与硫氮硫扎平抑制剂之间的结合有较大影响.

8.学位论文肖森波HIV-1整合酶核心域与蒽醌类分子相互作用分子动力学模拟研究2007

HIV-1整合酶是HIV-1病毒生命周期十分重要的关键酶，该酶抑制剂的研究是近年来抗HIV-1病毒研究的热点。HIV-1整合酶核心域行使该酶最重要的功能，对其进行研究是寻找该酶抑制剂十分有效的途径。通过分子对接和分子动力学模拟寻找靶蛋白抑制物是当前药物开发的新兴方法，这种方法具有高效、环保等优点，已经越来越被广泛采用。

在本文中，首先使用分子对接程序DOCK5.4对各个葸醌类和HIV-1整合酶核心域进行刚性分子对接计算；然后使用AMBER软件依据分子对接结果分别建立各个葸醌类分子与HIV-1整合酶核心域分子动力学模拟体系并进行分子动力学模拟计算；对模拟计算结果使用MM/PBSA(GBSA)方法求取各个体系的结合自由能，并分析两分子之间不同相互作用对结合自由能的贡献；使用MM/GBSA方法计算HIV-1整合酶核心域结合位点各个残基对结合自由能的贡献，分析各个葸醌类分子与HIV-1整合酶核心域的结合模式。同时对HIV-1整合酶核心域和已知抑制剂5CITEP在相同条件下进行分子动力学模拟计算和分析，为各个葸醌类分子与HIV-l整合酶核心域的结合亲和性提供参考。

通过对计算结果进行分析发现：

1．在所研究的12种葸醌类分子中，alizarin和emodin两个分子与HIV-1整合酶核心域结合自由能较高，不能很好结合；anthraquinone分子和purplJrin 1-methyl ether分子与HIV-1整合酶核心域结合自由能较低，与HIV-1整合酶核心域结合亲和性较强。

2．各个葸醌类分子与已知抑制剂5CITEP和HIV-1整合酶核心域结合自由能进行比较，计算结果依次为：anthraquinone<5CITEP

isoprerlylemodin

3． HIV-1整合酶核心域主要以疏水相互作用与各个葸醌类分子进行结合，蒽醌类分子上的羟基对结合有一定的阻碍作用。

4．构成HIV-1整合酶核心域结合位点的残基群在其与蒽醌类分子结合过程中起到十分重要的作用，特别是ILE 86、ILE 96、ASN 100、GLN7等。

根据模拟计算结果，Anthraquinone分子和Purpurin 1-methyl ether分子与HIV-1整合酶核心域结合亲和性较高，可能对HIV-1整合酶有一定的作用，可以通过实验进一步验证。

9.期刊论文张小轶.何红秋.刘斌.王存新.ZHANG Xiao-Yi.HE Hong-Qiu.LIU Bin.WANG Cun-Xin用分子模拟方法研究HIV-1整合酶突变体

的耐药性机理-生物化学与生物物理进展2009,36(5)

二酮酸类化合物(DKAs)是目前最有前景的HIV-1整合酶(integrase,IN)抑制剂.为了解DKAs引起的多种耐药株共有的耐药性机理,选择3种S-1360引起的IN耐药突变体,用分子对接和分子动力学模拟,研究了野生型和突变型IN与S-1360的结合模式,基于该结合模式探讨了3种耐药突变体所共有的耐药性机理.结果表明:在突变体中,S-1360结合到耐药突变IN核心区中的位置靠近功能loop 3区却远离与DNA结合的关键残基,结合位置不同导致S-1360的抑制作用部分丧失;残基138到166区域的柔性对IN发挥生物学功能很重要,S-1360能与DNA结合的关键残基N155及K159形成氢键,这2个氢键作用降低了该区域的柔性,突变体中无类似氢键,因而该区域柔性增高;在突变体中,S-1360的苯环远离病毒DNA结合区,不能阻止病毒DNA末端暴露给宿主DNA;T66I突变导敛残基Ⅰ的长侧链占据IN的活性口袋,阻止抑制剂以与野生型中相同的方式结合到活性中心,这均是产生抗药性的重要原因.这些模拟结果与实验结果吻合,可为抗IN的抑制剂设计和改造提供帮助.

10.期刊论文刘春莉.李春华.陈慰祖.王存新.LIU Chun-Li.LI Chun-Hua.CHEN Wei-Zu.WANG Cun-Xin用分子模拟方法研究HIV-1整合酶

与咖啡酰基类抑制剂的相互作用-物理化学学报2005,21(11)

用分子对接和分子动力学(MD)模拟方法研究了一类咖啡酰基和没食子酰基类HIV-1整合酶抑制剂与整合酶之间的相互作用模式,结果表明该类抑制剂分子上的两个侧链基团(咖啡酰基或没食子酰基)与整合酶的DDE基序之间的相互作用对抑制整合酶活性起到关键作用.当侧链基团为没食子酰基时,可以提高该类抑制剂与整合酶的结合能力.采用线性相互作用能方法(LIE)计算了该类抑制剂与整合酶之间的结合自由能,预测值与实验值相吻合,均方根偏差RMSD为1.39 kJ·mol-1,以上结果可为基于结构的HIV-1整合酶抑制剂设计提供有用的信息.

本文链接：https://www.wendangku.net/doc/646319557.html,/Periodical_zgbdx200605001.aspx

下载时间：2010年5月6日