白僵菌感染桑天牛幼虫致病过程的显微观察
蚕 业 科 学 CAN Y E KEXUE 2009;35(2)
收稿日期:2009-02-20
资助项目:河北省自然科学基金项目(编号C2007000486)。作者简介:王晓红(1982-),女,河北,博士研究生。
Tel:151********,E 2mail:gl w xiaohong@https://www.wendangku.net/doc/6e6367328.html,
通讯作者:黄大庄,教授,博士生导师。
Tel:0312********,E 2mail:huangdazhuang1983@https://www.wendangku.net/doc/6e6367328.html,
白僵菌感染桑天牛幼虫致病过程的显微观察
王晓红
1,2
黄大庄1 杨忠岐2 李会平1 郑建伟
1
(1河北农业大学,河北保定 071000; 2中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所,北京 100091)
摘 要 为了探讨白僵菌(B eauveria bassian )与寄主桑天牛(A priona ger m ari )间的相互作用方式及关系,采用扫描电镜观察了白僵菌分生孢子在桑天牛幼虫体表的侵染及穿透过程。结果表明,白僵菌分生孢子接种后8h 就可以附着于桑天牛幼虫体壁,12h 时可见孢子萌发产生芽管和附着胞,16h 即可穿透幼虫体壁;桑天牛幼虫体壁不同结构区影响白僵菌分生孢子萌发速度、附着胞形成以及芽管长度,与幼虫体壁的其它结构区相比,在幼虫体表节间膜处的白僵菌分生孢子萌发早,生长更快,并且孢子不会从幼虫体表的气孔侵入;已死亡虫体的表皮、气门均发生畸变。关键词 白僵菌;桑天牛幼虫;侵染过程;扫描电镜
中图分类号 Q949.32;S888.72+9 文献标识码 A 文章编号 0257-4799(2009)02-0374-05
M i croscopi c Observati ons of I nfecti on Process of B eauveria bassian
on the Cuti cle of Apriona germ a ri Larvae
WANG Xiao 2Hong
1,2 HUANG Da 2Zhuang 13 Y ANG Zhong 2Q i
2
L I Hui 2Ping 1 ZHE NG J ian 2W ei
1
(1H e b e i A g ri c u ltu ra l U n i ve rs ity,B a od ing H e b e i 071000,C h ina; 2R e s e a rc h Ins titu te of Fo re s t Ec o l og y,
Environm e n t a nd P ro te c tion,C h i ne s e A c a d em y of Fo re s try,B e iji ng 100091,C h ina )
A b s tra c t The infe c tion a nd p e ne tra tion p roc e s s of Ap ri ona g e r m a ri b y e n tom op a thog e n ic fung i
B e a uve ria b a s s i a n w a s s tud ie d us i ng s c a nn i ng e le c tron m ic ros c op y .It w a s found tha t c on id i a of B e a uve ria.b a s s ia n a t 2ta c he d to the c u ti c le of Ap riona g e r m a ri l a rva e a fte r 8h,a nd the g e r m tub e a nd ap p re s s o ri a w e re fo r m e d a f 2te r 12h,p e ne tra te d th roug h the c u ti c l e a fte r 16h.S u rfa c e top og rap hy of the hos t ha d influe nc e on infe c ti on sp e e d,ap p re s s o ria p rod uc ti on a nd the l e ng th of g e r m tub e.Ap ri ona g e r m a ri c on i d ia on s e gm a c o ria g e r m i 2na te d e a rlie r a nd g rew fa s te r tha n thos e on o the r p a rts of the c u tic le.M o re ove r,c on id ia c ou l d no t p e ne tra te th roug h sp ira c le s on la rva l c u tic le.B o th the c u ti c l e a nd sp ira c le of d e a d A.g e r m a ri la rva e w e re m a lfo r m e d.Ke y w o rd s B e a uve ria b a s s i a n;Ap riona g e r m a ri la rva e;Infe c tion p roc e s s;S c a nn ing e le c tron m i c ros c op y
桑天牛(A priona ger m ari )为蛀干害虫,在我国
分布广泛,对桑树、林木、果树危害严重,尤其近年来危害不断加重,已严重威胁到我国蚕桑业及经济林产业和林业的发展。因此,有效地防治桑天牛危害对于确保我国蚕桑业、林业及经济林产业的顺利发
展具有重要意义。球孢白僵菌(B eauveria bassiana ,
简称白僵菌)是一种虫生寄生真菌,该菌寄主范围广泛,可寄生鳞翅目、鞘翅目、同翅目、膜翅目等15个目149个科521个属707个种的昆虫及13种蜱螨虫类
[1]
,因而作为生物防治菌种之一早已在国外
用于防治多种农作物害虫[2]
。本课题组于2005年
从土壤中分离得到一株对桑天牛幼虫具有高毒力的
白僵菌Bb00菌株
[3]
,本研究以此菌株为材料,利用
扫描电镜观察了桑天牛幼虫体表不同结构区对白僵菌入侵的影响及白僵菌在桑天牛幼虫体表萌发、生长和穿透体壁的过程,以探讨寄主与病原菌
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间的相互作用方式及关系,为明确白僵菌的致病机制和更合理有效地利用该菌防治桑天牛提供科学依据。
1 材料与方法
111 供试昆虫与菌株
供试昆虫:野外捕捉桑天牛成虫,用1～2年生桑树的幼嫩枝条进行室内饲养,产卵后10d左右,剖取已孵化的桑天牛幼虫,人工接种到毛白杨(Pop2 ulus to m en tose)枝条中,以见蛀屑和虫粪排出确认成活,3个月后用于侵染过程的扫描电镜制样。
供试菌株:供试菌株是从分离纯化的9个菌株中筛选出来的对桑天牛幼虫具有高毒力的球孢白僵菌Bb00菌株。
112 病原菌孢子悬浮液的制备
察氏培养基中培养的白僵菌菌株Bb00完全产孢后,刮下分生孢子,用含011%吐温280的无菌水润湿,磁力搅拌器搅拌均匀,经血球计数板计数后,配成1×108mL-1的孢子悬浮液。
113 病原菌接种及取样方法
采用虫体直接浸蘸法,将大小一致的桑天牛幼虫直接在白僵菌孢子悬浮液中浸蘸30s左右,使孢子附着在虫体表面。将接种白僵菌分生孢子悬浮液的幼虫接到毛白杨枝条的人工刻槽中培养,分别于8、12、16、20、24、36h时取桑天牛幼虫和刚死亡的幼虫、僵硬的幼虫,以及可见白僵菌菌丝穿出桑天牛幼虫体壁的虫体用于制作扫描电镜样品。
114 扫面电镜样品的制备和观察
样品用215%戊二醛前固定过夜后再用锇酸后固定2h,用磷酸缓冲液冲洗1h,梯度乙醇由低浓度向高浓度逐级脱水,再用醋酸异戊酯置换乙醇,临界点干燥,粘台后喷金,在日立S23500N扫描电子显微镜下观察、拍照。
2 结果与分析
扫描电镜观察显示,桑天牛幼虫接种白僵菌后8h,白僵菌分生孢子就开始萌发并出现芽状突起,随后产生芽管;接种后12h,已有较多穿透幼虫体壁的行为发生,活跃穿透期为16～24h。在桑天牛幼虫体表不同结构区,白僵菌的入侵存在一定差异。分生孢子萌发后,绝大多数芽管末端很快膨大,形成附着结构———附着胞,附着胞紧紧固着在结构区的平缓区域,以便随后进行穿透桑天牛幼虫体壁(图12B)。少数芽管以原有直径延伸较长距离,并经几次弯折向幼虫体壁方向定向生长后,再刺入体壁(图12C,J)。
观察结果表明,白僵菌对桑天牛幼虫的致病过程包括分生孢子附着、萌发、穿透体壁以及菌丝的生长和增殖等过程。白僵菌的分生孢子与桑天牛幼虫表皮的接触和附着不是简单的物理接触,而是一种有机的生化作用过程,因此在电镜观察前经过在固定液中长时间浸泡和清水反复冲洗白僵菌分生孢子仍然不会脱落[4](图12A)。侵染12h后,白僵菌分生孢子吸水逐渐膨大,并可见孢子萌发迹象,孢子一端出现芽状突起(图12B,C)。侵染16h后,白僵菌孢子萌发伸出芽管,具有强烈的向桑天牛幼虫体壁方向生长的特性,芽管伸长过程如遇合适部位,前端产生附着胞向体壁穿透(图12D～F),在萌发和入侵过程中,还可见到白僵菌分生孢子所形成的芽管侵入点周缘的幼虫表皮呈凹陷状(图12G)。在侵染24h后,附着于桑天牛幼虫体表的大部分白僵菌分生孢子侵入体内(图12H,I),还观察到有部分白僵菌的芽管侵入桑天牛幼虫体壁之前先在体表平行生长,遇到合适的侵入部位再侵入(图12J),侵染36h 时,芽管即形成菌丝,在体表生长并寻找合适的侵入点侵入体内(图12K)。死亡的桑天牛虫体及初期僵虫在体表没有观察到菌丝及孢子的存在,但幼虫体壁不再光滑与伸展,而是出现扭曲、皱缩、畸形,体表附属物脱落(图12L～O)。白僵菌菌丝侵入桑天牛幼虫体腔后,吸收血液中的营养,大量繁殖菌丝,在此过程中突破血细胞的包围并消解血细胞,然后侵染幼虫体腔内的组织与器官,直至体腔内完全被菌丝所充满,桑天牛逐渐死亡,之后在虫体表面长出白色菌丝和分生孢子(图12O,P)。
此外,同一时间段感染白僵菌的桑天牛幼虫虫体,在体表节间膜处的分生孢子萌发最早,芽管和菌丝比体壁其它结构区的要长,说明白僵菌对昆虫表皮的侵入具有一定的选择性,节间膜为薄弱环节,是白僵菌侵入虫体的主要部位。电镜扫描发现,感染初期幼虫的气门大多数处于封闭状态,气门上未发现有孢子附着(图12Q);感染后期,气门上的刚毛消失,骨板皱缩不平,有泡状突起(图12R)。
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第2期王晓红等:白僵菌感染桑天牛幼虫致病过程的显微观察
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7
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A.接种8h后附着在桑天牛幼虫体表的球孢白僵菌分生孢子 B,C.接种12h后体壁及节间膜处分生
孢子产生附着胞及芽状突起 D,E.接种16h后体壁上分生孢子芽管向体表定向生长,部分侵入表皮内
F.接种16h后节间膜处分生孢子芽管伸长穿入表皮
G.接种16h后孢子侵入处表皮略显凹陷状
H,I.接种24h后体壁及节间膜处的大部分分生孢子侵入表皮内
J,K.接种后36h时芽管侵入体壁之前先在体表平行生长 L,M.刚死亡虫体体表及节间膜出现畸形
N.僵虫体壁极度皱缩 O.僵虫节间膜皱缩并有菌丝穿出 P.体表布满菌丝
Q.正常的气门 R.刚死亡幼虫的气门变得畸形
A.Conidia on cuticle of A.ger m ari larvae at8h B,C.Ger m ifor m p r otuberance and app ress orium
f or med on conidia on cuticle and se
g macoria at12
h post inoculat
i on D,E.Ger m tube of conidia oriented
t oward cuticle at16h post inoculati on F.Ger m tube el ongati on and penetrati on t oward the cuticle on seg macoria
at16h post inoculati on G.Dep ressed cuticle at the point of s pore penetrati on H,I.Penetrati on of most conidia
on cuticle and seg macoria int o the cuticle at24h post inoculati on J,K.Ger m tube parralled al ong with cuticle bef ore penetrati on, 36h postinoculati on L,M.Cuticle and seg macoria of dead A.ger m ari
larvae with malf or mati on N.Extre mely wrinkled and cri m p led cuticle of stiff larvae
O.W rinkled and cri m p led seg macoria with mycelium com ing out fr om coel om P.Cuticle covered with
mycelium Q.The nor mal s p iracle of A.ger m ari larvae
R.The malf or med s p iracle of dead A.ger m ari larvae
图1 白僵菌Bb00菌株感染桑天牛幼虫致病过程的显微观察
Fig.1 M icr oscop ic observati on of infecti on p r ocess of B.bassiana Bb00on A.ger m ari
3 讨论
Butt等[5,6]通过研究比较绿僵菌(M etarhizium anisopliae)对蚜虫(A phididae)和跳甲(A ltica s p1)的入侵行为发现,寄主表皮对绿僵菌萌发行为和致病性有重要影响,寄主专化性由表皮水平决定。本实验以桑天牛幼虫为材料,采用扫描电镜观察了球孢白僵菌Bb00菌株在桑天牛幼虫体表入侵的过程,发现幼虫体表结构对白僵菌附着胞的产生、芽管长度以及入侵行为有重要影响。白僵菌孢子在平缓的幼虫体壁区有的形成附着胞而有的则以粗度与菌丝相同的芽管侵入,侵入时其先端具有主动寻找适宜侵入点的特性,在不适宜的体表处就进行平行生长,待遇到合适的侵入点再产生侵入行为。还观察到幼虫体表节间膜是其侵入的薄弱区[7],节间膜处的孢子萌发早于体壁区,同一时间下芽管长度长于体壁区。说明白僵菌侵入桑天牛幼虫的表皮具有一定的选择性,这可能与不同部位的表皮结构差异有关,有关桑天牛幼虫的表皮结构的差异及其与白僵菌入侵之间的关系还有待进一步研究。通过本次实验观察,还发现气门虽然作为桑天牛幼虫体内与体外气体交换的重要通道,但是白僵菌的分生孢子却不能附着于桑天牛幼虫的气门上,也不能以此为侵入途径,这可能与气门的结构及质地有关,气门密布刚毛且骨化而不利于孢子的侵入,也可能与桑天牛幼虫在遇到外界侵染时的自我保护机制有关。
一般认为,虫生真菌穿透昆虫表皮是机械压力和酶降解联合作用的结果。昆虫表皮主要成分是蛋白质、几丁质和脂类,而产生各种胞外酶溶解寄主表皮是病原真菌侵入寄主体内的策略之一[8-10]。本实验观察到桑天牛幼虫表皮被白僵菌侵入部分略显凹陷状,表明了白僵菌在穿透过程中机械压力的存
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第2期王晓红等:白僵菌感染桑天牛幼虫致病过程的显微观察
在,同时也是由于白僵菌在入侵过程中分泌的各种
降解酶(如蛋白酶、几丁质酶、酯酶等)所致。染菌后期的桑天牛幼虫表皮可见气孔皱缩、畸形,透射电镜超薄切片中也发现穿透菌丝周围表皮组织被溶解(另文发表),均证实了白僵菌在入侵桑天牛幼虫过程中有酶的参与,并对寄主表皮产生了降解作用。
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中国蚕学会第八届三次常务理事会
暨专业委员会负责人会议在浙江省杭州市召开
2009年3月27日,中国蚕学会第八届三次常务理事会暨专业委员负责人会议在杭州市召开。原全国人大常委、农业与农村委员会副主任、中国农学会副会长舒惠国,商务部茧丝办王北鹰司长,农业部种植业管理司封槐松处长等出席了会议。中国蚕学会理事长鲁成教授代表中国蚕学会向代表们致欢迎辞,浙江省农业科学院孟智启副院长也代表会议承办单位向代表们表示了热烈欢迎。
开幕式上,舒惠国副会长、封槐松处长、鲁成理事长分别作了“东桑西移工程和桑蚕产品的新开发”、“我国蚕桑及蚕种生产经营面临严峻的形势”、“国家蚕桑产业技术体系建设与学会工作”的专题报告。中国蚕学会张国政秘书长代表学会办公室作了“关于中国蚕学会2008年工作总结和2009年工作计划”的报告。
来自全国20多个省(市、区)的代表在大会汇报了本省的蚕桑生产情况和面临的挑战。会议期间,各位代表就目前经济形势和蚕业发展现状进行了充分讨论后,达成以下共识。(1)蚕业形势严峻。2008年因金融风暴突袭全球经济,茧丝绸行业受到严重冲击,并且在全球金融危机蔓延、消费市场需求萎缩等多种因素的冲击下,当前我国茧丝绸行业面临的形势依然严峻。(2)须加强行业宏观指导。当前必须加强我国茧丝绸行业宏观指导,搞好茧丝供需平衡,引导行业平衡、健康、有序的发展,维护农、工、贸三方利益,例如结合丝绸市场行情变化,市场消费需求和茧丝绸行业的特点,合理安排生产规模,实行“订单农业”等。(3)加大行业扶持力度。国家和地方政府要扶持产业链中抗风险能力较弱的蚕种生产,加大蚕种场基础建设力度,提高蚕种生产技术水平和经济效益,并建立蚕种生产风险基金,以防受自然灾害和茧丝绸市场波动的影响,确保我国传统蚕丝业平稳健康地可持续发展。(4)增加科技投入。行业要围绕提高丝质产品质量、拉动内需和促进出口为重心,在丝绸产业的产前、产中和产后持续增加科技投入,维持国内外市场拥有平稳的真丝产品的消费量,最终维护丝绸产业的长久繁荣。(5)加快蚕业资源综合开发。以丝绸为主要终端产品的蚕业生产技术体系,对蚕业资源的利用度极低,主产品茧丝只占桑园年产干物质量3%,加强蚕沙、桑枝条、蚕蛹、桑叶、桑葚等蚕桑资源的综合利用,提高单位面积桑园经济收入,分散蚕农在桑园投入中的风险性,在蚕茧价格大幅度波动时亦能使蚕农获得稳定收入,从而保证蚕丝业的稳定与发展。
?林泽华?
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