肝脏蛋白组学及其损伤变化,库夫细胞相应的功能变化
一、肝脏蛋白质组学
1 细胞整体水平上的蛋白组学分析
以肝为整体．对大鼠肝细胞进行全面的蛋白质分析。研究分别对大鼠和小鼠肝的整体蛋白质组进行检测和分析。为提高蛋白的检出率，应用pH值不同的胶条，在l3个二维凝胶每上共切取约5000个点，鉴定约3000个蛋白点，归纳为273种的基因产物。其中，60%大鼠肝蛋白为酶和酶的亚基，7%为结构蛋白，细胞因子约6%，14种热休克蛋白占5%，转运蛋白为3%，核糖体蛋白为l%，其余的各种蛋白为19%。
肝星形细胞在肝的生理、病理过程中发挥了重要的作用。针对星形细胞也进行蛋白质组学研究门，实验鉴定了153种肝星形细胞蛋白。分别对比体外培养的静止期细胞复苏9d后和对大鼠注射四氯化碳8周后的星形细胞，43种表达水平改变的蛋白质或多肽得到鉴定。其中27种蛋白在体内和体外表达均有改变，包括钙周期蛋白、calgizzarin、galectin—1等表达上调的蛋白和肝酯酶10、丝氨酸蛋白酶抑制子等表达下调的蛋白。其中6种蛋白在体内和体外激活后有不同的蛋白质表达。随后通过Northern blots的验证，确认在mRNA 的水平上，mRNA控制着复苏后的培养细胞的钙周期蛋白、calgizzarin galectin等的表达。
2 细胞器水平上的蛋白组学分析
整个细胞溶解后蛋白质的二维电泳的分析，结果大部分是细胞溶质性蛋白，与各种细胞器上蛋白并不相同，执行的功能也不相同。细胞器的特异蛋白，决定细胞器的功能状态。高等真核细胞的蛋白组成复杂，高丰度蛋白质常掩盖低丰度蛋白质，一些细胞器上的蛋白由于丰度较低，不易检出。因此，由此提出亚细胞结构的蛋白质组的研究。
线粒体是真核细胞内的能量代谢中心，参与多种重要的细胞生理、病理过程。对线粒体蛋白质进行相应的蛋白组学分析，在6张不同pH凝胶上的1800个点中，共鉴别192种基因产物，其中8种基因产物是在线粒体上首次发现。鉴定的蛋白质中，69%为酶或酶的亚基，具有广谱催化活性。结构蛋白占9%，热休克蛋白占4%，其余的各种蛋白占18%。平均每10-15个凝胶上的点对应1个基因产物。
高尔基体是真核细胞中内膜系统的组成之一。在细胞生命活动中起重要作用，据估计高尔基体中大约有1000—3000种蛋白质。对鼠肝蛋白进行蛋白组学分析，以了解高尔基体的蛋白组成状况。当细胞处于稳定状态时，高尔基氏体内大约50%蛋白质处于转运状态。使得判定哪些蛋白是高尔基氏体固有蛋白，哪些为生产出的蛋白发生困难。改进实验技术后，应用环己酰亚胺清除转运中的蛋白，获得高度富集高尔基体片段。蛋白合成被抑制后，虽转运动力学明显降低，分泌蛋白和跨膜蛋白通过高尔基体移动到最终目的地。这种预处理方法使转运中的蛋白脱离高尔基体，而富集的高尔基体则聚集在储存槽中。通过改进后的分离技术，富增高尔基体蛋白，经过三重氢核X一114提取后，再用阴离子交换色谱技术获得最好分离，在二维凝胶上得到了588个蛋白点，并用质谱分析了其中丰度最高的99种蛋白。其中47种蛋白得到鉴定，25种为高尔基体蛋白，5种为内质网蛋白，5种为另外的细胞器蛋白，5种为血清蛋白。6种为细胞溶质蛋白，6种细胞溶质蛋白与高尔基体有无相互作用尚不清楚。
二、蛋白质组学的研究方法
1 二维凝胶电泳
二维凝胶电泳(two—dimensional gel eleetrophoresis，2DE)是1975年由Klose和O’Farre在各自的实验室单独发明的。利用这项技术他们成功地分离了大肠杆菌(Escherichia
cob)溶菌液中的多种蛋白质。二维凝胶电泳的第一向为等电聚焦(iso—electric focusi~，IEr)，根据蛋白质分子的等电点(PI)的不同而将其分离；第二向为SDS—PAGE，根据分子量的大小而将其分离。最早采用的是载体两性电解质pH梯度进行等电聚焦，直到九十年代中期固相化pH梯度(immobilized pH gradient)等电聚焦技术的发明，二维凝胶电泳才成为了蛋白质组学研究的有力工具。由于其具有大规模地快速分析和鉴定蛋白质的能力以及具有较好的可重复性和可比性，Glokler和Angenendt相对于蛋白质微阵列(protein microarmy)把其称为蛋白质宏阵列(protein macroarray)。
使用二维凝胶电泳研究蛋白质组学的基本步骤是：蛋白质样品(溶液)的制备一通过2DE 上样分离一2D凝胶上蛋白质印迹点的计算机数字化处理一通过质谱技术(Ms)对所研究的蛋白质进行初步鉴定一搜索数据库获取相关信息后对蛋白质进行最终鉴定。
二维凝胶电泳的上样溶液可以是细胞裂解液，也可以是多种蛋白质的混合溶液。固向化pH 梯度凝胶L6．7 J在等电聚焦向的成功应用使二维凝胶实现了商业化和标准化，也使实验具有了较高的可重复性。蛋白质样品通过二维凝胶电泳，用考马斯亮蓝(Coomassie Blue stain)染色后可获得标准的肉眼可见的蛋白质图谱(protein map)；银染(medmed silver main)后可用于MS分析。
二维凝胶电泳技术的优点十分突出，归纳起来主要有：①二维凝胶电泳结合MS分析可以实现较大规模的蛋白质的分离和鉴定；②二维凝胶电泳特别适用于后修饰的蛋白质(如糖基化、磷酸化、脱氨等)的发现和鉴别。③二维凝胶电泳技术研究蛋白质组学的各个步骤可相互分离，相关工作可在不同的实验室完成。二维凝胶还是蛋白质的“纯化收集器”和蛋白质保存的“文件夹”。干凝胶上的蛋白质在室温下可保存数月甚至数年。长期保存在凝胶上的蛋白质用胰蛋白酶处理后同样可用于MS分析。这对于某些珍贵的样本如一些稀少的组织瘤样本的保存有十分重要的意义。④二维凝胶电泳技术相对廉价，MS分析和生物信息资源的搜寻可通过共享资源或有偿服务来实现。
二维凝胶电泳技术的不足也非常明显。其最大的不足是不可能对整个蛋白质组进行分析和研究。通过染色显示出来的蛋白质图谱只是一些高丰度的蛋白质。低丰度的蛋白质如受体、调节蛋白等很难反映出来。一些分子量比较极端的蛋白质(过大过小的蛋白质分子)以及碱性蛋白和疏水蛋白也不能进行分离和鉴定。典型的如膜蛋白，由于其高的疏水性和表达的低丰度，二维凝胶电泳技术很难应用到膜蛋白的研究中。其二，通过二维凝胶电泳分离的蛋白点(protein spot)不一定只代表一种蛋白质。据报道 8-1 0l，通过二维凝胶电泳获得的真核细胞的蛋白质图谱有20％的点包括了至少两种或两种以上的蛋白质，而原核细胞的蛋白质图谱甚至达到40％。其三．二维凝胶电泳的敏感性差，分离的蛋白质必须要有足够的丰度才能着色。
放射自显影和放射荧光显影在凝胶电泳图谱的标记上效果显著，该方法能使蛋白点的边缘更为清晰，并可直接用于质谱分析。蛋白质图谱的计算机处理技术近年来发展很快，相关的处理软件有：Melanie(Geneva Bioinformatics and Bio-Pad I．aboratories)，ImageMaste(Amersham—Pharmacia Biotech)，Phoretix 2D(Phoretix Internationa1)，Gellab(Scanalytics)，Kepler(Large Scale Pmteomics)，Z3(Compugen)，GD Impressionist (GeneData)．等。
二维凝胶电泳技术作为一种基础技术，其发展和应用在很大程度上依赖于其它新技术的发展。基于二维凝胶电泳技术的质谱技术(based一2DE MS，生物质谱技术)近年来发展迅速，在很大程度上克服了二维凝胶电泳技术的不足，拓宽了其应用范围。基于二维凝胶电泳技术的质谱技术也因此成为了当前蛋白质组学研究的有力工具。
2 生物质谱
质谱(Mass spectrometry，MS )作为一种分析技术从上世纪六十年代始应用于一些挥发性化学物质的结构研究。二维凝胶电泳技术自发明后没有得到广泛的应用的一个重要原因即是质谱技术的相对滞后，因为带电荷的蛋白质分子转入真空后通过电子激发容易失活。因此，传统的蛋白质分析方法主要为氨基酸组成分析、Edman降解反应的N末端测序、c末端酶解、C末端化学降解等。这些技术费时费力，灵敏度低，而且对蛋白质样品的含量和纯度都有很高的要求。1988年，karas和Hilenkamp发明了基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix —Assisted Laser Desorption Inonisation Time of Flight MassSpectrometry，MALDI 一TOF—MS )。同期，Fenn和 Wilm等发明了电喷雾电离质谱(Ekectrospmy Ionzation Mass Spectrome．try，ESI—MS)。这两种较温和的离子化方法在对大分子进行离子化时不会破坏大分子的结构，从而使蛋白质分子的质谱分析成为可能。
从细胞、组织或生物体液中提取的蛋白质样品经过二维凝胶电泳分离后，所分离的蛋白点用胰蛋白酶降解进行质谱分析，可得到该蛋白质的肽谱图(peptide—mass fingerprinting)。根据肽谱图对蛋白质数据库进行检索，即可识别和鉴定所检测的蛋白质。用生物质谱进行蛋白质分析具有很高的灵敏度和准确性。银染后获得的蛋白质图谱蛋白质点的检测浓度可低至fmol水平。如上所述，基于二维凝胶电泳技术的生物质谱技术是鉴定后修饰蛋白的最为有效的方法。但生物质谱技术同样有其局限性，质谱分析得到的质谱图的解析是一个相当费时费力的工作。其次，通过二维凝胶电泳获得的蛋白质图谱其蛋白点必须进行酶解，酶解的过程可能导致部分蛋白质和肽段的丢失。当银染的酶解肽段浓度过低时，质谱分析所得的信鼠可能不足以对蛋白质进行准确的鉴别和确定。同时，基于二维凝胶电泳技术的生物质谱技术自动化程度较低，很多过程都需要人工参与，蛋白质样品及其酶解片段容易受到来自人的皮肤和头发的角蛋白的污染，因而可能对分析的准确性产生严重干扰。1999年Gygi等发明了一种更为普遍的准确定量蛋白质的方法，即同位素编码亲和标记质谱(Isotope—Coded Affimity Taggs，ICAT)，可对蛋白质组进行整体和定量的分析，降低蛋白质混合浓液的复杂性并可富集低丰度的蛋白质。表面增强激光解吸电离时间飞行质谱技术(surfaced—enhanced laser desorpfion ionization／time—of—mght nELS$spectrometry，SEDI—TOF)已经广泛应用于人类癌症的早期诊断和早期治疗中。Solassol等的研究表明，SEDI—TOF技术和亲和层析技术的结合能显著地提高癌症早期诊断的准确度。机器人质谱(Robtics—MS)也是当前的一个研究热点，该项技术旨在把二维凝胶电泳、蛋白质图谱中蛋白点的消化、消化片段的质谱分析以及质谱图的解析整合到一起。这一自动化过程的实现将有效地减少蛋白质的污染，使分析结果更加准确可信。
3 蛋白质/抗体微阵列(蛋白质/抗体芯片)
蛋白质微阵列(protein microarray)有三个方面的含义：①基片的微型化；②点样的高密度化；3)通过该阵列可扫描和分析蛋白质和蛋白质，蛋白质和DNA、RNA、配体以及其它小分子物质问的相互作用。Lueking等 19J把作为探针的92个人的eDNA克隆片段的蛋白表达产物高密度地固定在聚偏氟乙烯膜(polybinlidenekifluride，PVDF)上，点样密度达600点／c，用单克隆抗体对其进行检测，作平行分析，证实假阳性的检出率较底，并能检测到lOpg的蛋白测试样品。Mendoza等 j在玻璃平板上设置了96个疏水的聚四氟乙烯掩膜(Teflon n啪k)，每个掩膜点144种样品，用常规的酶联免疫吸附(enzyme—linkedimmunosorbent assay，EUSA)检测，然后用CCD(eharge—coupleddevice)系统对反应的图象进行扫描分析。使蛋白质微阵列过渡到蛋白质芯片的突破性工作是普通的显微玻片基片的使用。玻片耐高温，能承受高离子强度的漂洗，荧光背景低而且便于检测分析，因而具有很强的实用性。Macbealh等_2l_首次把蛋白质点样在经过乙醛化处理的玻片上获得了成功。基片的选择以及基片的处理方法是蛋白质芯片制作的关键。目前常用的基片有凝胶、
塑料和玻片。
作为蛋白质芯片的基片必须满足三个方面的要求：首先，蛋白质分子能稳定地固定到基片上。蛋白质不同于DNA分子，有一个带负电荷的磷酸骨架容易和基片或经过化学修饰的基片交联。其次，基片要相对廉价，适于高通量点样，适于低荧光检测分析，并且具有较高的重复性。第三，要尽可能保证交联到基片上的蛋白质的活性。因为蛋白质被固定后，空间构象容易破坏，活性位点或活性结合位点容易丧失。Angenendt等一 J比较了11种不同基片和基片表面修饰方法(包括凝胶、塑料和玻片)在抗体芯片技术中的运用效果。作者发现，用聚赖氨酸和戊二醛修饰的玻片处理过程简单，容易使蛋白质通过静电作用或共价结合而吸附，信噪比高，变异系数小，其缺陷是可检测的极限浓度偏高(2000amol／spot)。聚丙烯酰胺凝胶基片经过PBS温育，其检测的灵敏度最高，极限浓度为1313amol／spot，适于低丰度蛋白的检测，但变异性大。塑料基片MaxiSorb(tramparent)和MaxiSorb(black)可检测的极限浓度分别为2000amol／spot、1500amol／spot，虽然有很高的灵敏度但变异最大稳定性最差。所有各种基片均可保存8周以上，但保存2周后分析效果最好。作者最终得出结论，各种基片及化学修饰方法并无明显的优劣之分，具体选用那种基片及化学修饰方法应视研究的具体目标而定。
蛋白质芯片的模式(protein mieroarray format)除了上面谈到的平板式外还有另外几种模式，Zhu等[25J在研究蛋白质磷酸化激酶时制作了一种微孔式芯片(Mierowel array)，芯片直径为1．4ram，深度为300um，可容纳300nl的反应体积。整个芯片制作在一个便携的弹性硅胶体二甲基硅氧烷聚合物( y．dimethylsiloxane，PDMS)中。Bernhard等 j在光纤末梢连接一个微孔芯片，制作了pH和02敏感传感器。在微孔芯片模式上发展起来的另外一种芯片模式是微型流体芯片(miemfluidiechips)。Cohen等【圳通过影印平板术(pgotolithograghie teeh—niques)研究蛋白激酶A时制作了这种芯片。该芯片利用电渗原理通过微型管道转移反应试剂可调控磷酸化反应过程，同时还可控制反应试剂的浓度，估算Miehaelis—Menten常数。因为生理生化反应都是在溶液中完成的，因此微型流体芯片有更为广泛的应用前景：噩白质芯片和质谱技术相结合造就了另外一种芯片模式，如表面增强激光解吸电离质谱芯片(SEEDIdrip)[ 。该技术把蛋F_l质样品的制备，生化反应和检测分析都集成在芯片上完成。片的发展模式有一个明显的趋势，愈来愈象一个微型实验室。
就目前来看，制约蛋白质芯片进一步发展的因素主要有：①抗体和蛋白质资源。抗体芯片面临的最大困难是很难获得大量特异性各异的纯净抗体。尽管有许多单克隆和多克隆抗体上市，但其高昂的价格令人望而却步。蛋白质芯片同样面临大量蛋白质的分离和纯化问题。现阶段常常用核糖体展示文库[凹】和噬菌体展示文库[∞j提供的seFvs片段替代，但变异性大。另一种替代品是寡核甘酸，但蛋白质样品中极微量的核酸酶都会使其降解。②基片及基片修饰的选择。如上所述，现在尚无一种理想的基片及基片修饰方法，抗体和蛋白质固定到基片后常常活性丧失或特异性和活性降低，scFvs片段也存在同样的问题。③蛋白质和抗体芯片的标记。尽管有各种直接或接的标记方法但蛋白质样品的标记始终是蛋白质芯片技术发展的一个瓶颈。④数据处理。这同样也是DNA芯片所面临的问题。蛋白质芷：片虽然还处在发展的早期阶段，但其在蛋白质组学研究方面的优势已十分明显。它具有高通量、高灵敏度、低上样量的显著特点，已广泛应用于蛋白质表达谱的分析、蛋白质功能及蛋白质一蛋白质相互作用的研究、临床疾病的诊断和疗效评价、药物新靶点的筛选和新药研制的各个领域
4 生物信息学
生物信息学(bioinformafics)是生物学与计算机科学及应用数学等学科相互交叉而形成的一门新兴学科。它通过对生物学实验数据的获取、加工、存储、检索与分析，进而达到提
取数据所蕴含的生物学意义的目的，它由数据库、计算机网络和应用软件三大部分构成。生物信息学主要包含三个方面的内容，即基因组信息学、蛋白质组信息学以及药物设计。生物信息学的任务是通过对已有基因组系列的分析，确定基因在染色体上的位置及其功能，了解基因表达的调控机理，对未知的蛋白质进行结构和功能的预测并根据特定的蛋白质进行药物设计E3 。生物信息学虽然以基因组信息学为核心，但其在蛋白质组学研究中的作用日显突出。通过二维凝胶电泳、生物质谱、蛋白质微阵列等方法所获得的大量数据最终都必须依赖生物信息学的方法和手段才能实现对蛋白质的种类、数量、结构和功能的最后确定。生物信息学在蛋白质组学研究中的另外一个重要应用和未知功能的新基因的研究有密切的关系。目前，基因组学发展迅速，新基因在不断发现，但许多新基因的功能却一无所知。有些基因和已知基因的同源性很低或没有同源性，不能通过和已知基因的比较来预知其功能。电泳、层析、质谱虽不失为可行的方法，但费时费力，对少数蛋白质的研究而言，有时并非高效价廉。凭借生物信息学的方法，我们可以对新基因的最终表达产物进行结构和功能的预测。预测虽有假阳性，但计算结果有助于蛋白质研究的实验设计。当基因组的数据足够翔实时，预测的精确度将大大增加。
4．1 蛋白质功能预测
蛋白质功能的预测主要有以下几种方法【33 J：①基于序列相似性比较。蛋白质进化的保守程度比DNA高，因此在DNA水平与已知基因无显著同源性的序列，可能在蛋白质序列库中找到有参考价值的同源序列(包括和功能密切相关的保守残基)。这一方法的理论基础是，进化产生的享有共同祖先的同源性蛋白家族具有相似的序列、结构和功能。通过和已知序列的比较，还可以预测未知蛋白质的性质，如等电点／分子量、疏水性、跨膜螺旋、卷曲螺旋及信号肽等。②基于系统发育谱(phylogenetic profiles)的比较。两个蛋白质享有相似的系统发育谱被认为存在功能连锁。根据系统发育谱可进行蛋白质聚类，当未知蛋白质与一个或几个功能已知的蛋白质归为一类时即可提供未知蛋白的功能信息。③基于结构域融合的方法。两个位于不同基因组的非同源性蛋白组分融合成一条单链时，其相互作用的区域更可能是在进化上产生歧化的热点。如从细菌到真菌的色氨酸合成酶的亚基。④基于mRNA表达类型的比较。分析建立在一种假设上，这种假设认为在条件相同的情况下，表达水平相关联的蛋白质功能上是相连锁的。毫无疑问，合理的基因组水平蛋白质功能预测当然是上述各种方法的综合运用。
4．2 蛋白质结构预测
根据同源系列的比对和某些关键的氨基酸残基的位置，以已知三维结构和二级结构的蛋白质为依据，通过人工神经网络、遗传算法等可预测蛋白质的二级结构和高级结构。单一序列二级结构预测的准确率可达到60％一80％，多序列比较可显著提高预测效能。目前，n螺旋预测的精确度较好，而p折叠次之，二者之外的无规则二级结构则明显不佳。蛋白质三级结构预测尚无有效的办法，研究发现序列差异较大的蛋白质也可折叠成相似的三维构象，但蛋白质的折叠过程并不十分明确。目前常用的是“同源模建”和“Treading”方法[ ，但效果并不理想，有待于进一步完善。以上对蛋白质组学研究的几种主要方法进行了较为全面的分析，指出了各自的优点及其局限性。其实，蛋白质组学的研究方法还有许多，比如1一D凝胶电泳、3一D凝胶电泳、层析及酵母双杂交系统等。酵母双杂交系统是Field和Song 等[35]建立起来的研究蛋白质相互作用的一个系统，这一系统是以真核细胞转录激活的结构和活性特点为基础的。利用这一系统已经证实并筛选出了许多具有相互作用的蛋白质及配体。应该说任何一种方法都不是孤立的，各种方法的综合运用才是蛋白质组学研究的唯一正确的方法。同样，基因组学、转录组学以及蛋白质组学的研究也是不可割裂的。基因组学的
研究为我们描绘了基因的结构及其表达图谱；转录组学的研究揭示了HnRNA的选择性拼结特点、转录起始点及启动子的位置。而蛋白质组学的研究所展示的蛋白质图谱将为我们进一步揭示各基因所编码的蛋白质的功能以及蛋白质的修饰、定位、活性、蛋白质间的相互作用等，进而从根本上解决生命的遗传和变异、生命的起源和演化等问题[36-38]。
三、蛋白质组学定量的技术与方法
3. 1 双相聚丙烯酰胺凝胶电泳(2 - DE)
1975 年,由O′Farrel 、Klose 和Schecle 分别建立了双相凝胶电泳技术[6 ] ,现在已可在一张凝胶板上同时分离几千个蛋白质点。双相凝胶电泳的第一相是等电聚焦( IEF) ,采用pH 梯度,根据蛋白质等电点的不同使之分离;第二相是SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS - PAGE) ,根据蛋白质分子量的大小进行分离,可采用垂直或水平两种方式,适合于分子量为10 - 150KDa 的蛋白质。
凝胶上电泳分离的蛋白质可通过不同的方法染色[7 ] ,有染色剂法、放射性检测方法以及荧光试剂染色法。考马斯亮蓝染色法可用于胶上或膜上蛋白质点的显色,显色重现性好,容易操作,但灵敏度较低;银染法广泛用于双相凝胶电泳分离后蛋白质点的显色,灵敏度较考马斯亮蓝染色法高两个数量级,最低检测限可达011ng ,但该法重现性较差,显色的浅性范围较窄;放射性检测方法灵敏度很高,但若不使用磷光成像分析技术,则耗时过长,有时长达几个星期,且其动态线性范围较窄;使用荧光试剂染色相对来说灵敏度较高,最低检测限为1 - 2ng ,线性范围宽,且可以实现不同蛋白表达的样品在同一块凝胶板上进行显色比较,克服了方法重现性差的弱点。荧光检测通常有三种方式: (1) 电泳前标记,即在IEF 之前,将荧光基团引入样品与蛋白质结合; (2) 电泳过程中标记,即在IEF 后,SDS - PAGE 前引入荧光基团; (3)电泳后标记。目前常采用的荧光标记检测方法是使用SYPROTM进行电泳后标记。但这种方法所需仪器设备比较昂贵。
显色后的凝胶通过平板扫描仪、CCD 相机、激光光密度仪、磷光或荧光成像仪等采集胶上蛋白质斑点,并将其数字化,通过比较不同样品(如正常与异常) 凝胶斑点的深浅程度可获得初步的定量信息。
现行的高分辨率的双相凝胶电泳技术在蛋白质组分离与定量分析鉴别方面具有十分强大的功能,但是有如下缺陷[8 ] :强酸性、强碱性的蛋白质,过大、过小的蛋白质,疏水性的蛋白质(如膜蛋白)以及一些低表达的蛋白质难以检测;重现性差,灵敏度不高,常用的染色方法线性范围窄;耗时长,劳动强度大,操作繁琐;难以实现标准化和自动化,不能适应高通量分析的要求。
3. 2 同位素稀释技术
同位素稀释技术[8 - 10 ] ( isotope dilution tech2nique) 比较准确可靠,它是在样品中加入包含稳定的重质同位素(2H、13C、15N、18O) 试剂,使其与被分析物结合而使之被标记,通过质谱检测以确定其蛋白质的表达水平。质谱分析过程中,肽的离子化效率随时间有一定的变动性,需采用内标法获得较为可靠的定量分析结果。通常是用富含某种重质同位素的试剂标记与被分析肽段相同的肽段作为其内标物,被分析肽段则与正常的同种试剂(即其中所有元素的含量皆为天然丰度) 结合。内标肽段与被分析肽段(组成为一个“分析对”) 除了两者在质量上相差几个单位,其他的物理、化学性质几乎完全相同,在标记后的诸多分离纯化过程中的行为很相似,两者能同时进入质谱的离子化器而被同时离子化,克服了质谱离子化效率变动的影响。由于质量数的差异使分析对最终在质谱图上表现为一对峰,峰的间距由内标物所含的重质同位素的个数所决定,很容易从质谱图中将其识别出来。同位素稀释技术
根据标记过程分为提取前标记方法(代谢标记方法) 、提取后标记方法及反转标记方法。3. 2. 1 代谢标记方法
代谢标记方法是指将一定量的相同种类但表达水平不同的两个细胞样品分别置于正常培养介质和富含某重质同位素(多用15N ,故下面以15N 为例进行讨论) 的相同介质中培养。在富含15N 的培养介质中生长繁殖的细胞内蛋白质中所含的氮原子为15N ,而在正常介质中生长繁殖的细胞,其组成蛋白质的氨基酸中多为正常的14N 原子。培养一定时期后,将两者混合,然后破细胞,提取相关部位的蛋白质,进行消化酶解,此时蛋白质被酶解成若干肽段,通过选择性亲和分离、色谱分离等过程,最后进行质谱分析。每一对分析肽段与内标肽段在得到的质谱图中表现为一对峰,峰的间距等于肽段中所含的氮原子的个数。通过比较质谱图中含有同位素标记内标物的一对峰的强度比可以判断原细胞体系中蛋白质表达水平的差异。由于“分析对”峰之间的距离与所含重质同位素原子的个数有关,所以被分析肽段越长,即质荷比越大,肽段中所含的氨基酸越多,相应所含的氮原子越多,以致峰的间距就会越大;而且,由分析过程可知,该方法只对氨基酸序列已知的肽段的分析是有效的。对于未知序列肽段,由于无法得知分析肽段中确切的氨基酸的数目和种类,难以确定其中所含氮原子的确切数目,故识别质谱图中一对分析对的峰比较困难。
Smith 研究组[11 ] 使用正常与富含15N 的细胞培养液分别对细菌D. radiodurans 细胞株和鼠的B16 黑色瘤细胞株两个样品体系进行代谢标记,并在标记样品的提取液中加入碘乙酰聚乙烯氧基生物素,使其对其中的半胱氨酸进行烷基化,酶解后用固定抗生物素蛋白(avidin) 的亲和色谱柱选择性分离生物素化的含有半胱氨酸的肽段以简化样品体系,最后通过毛细管反相液相色谱- 质谱技术进行分析检测,所得质谱图中可以清楚地看到若干对相应于分析对的对峰,以其所含的氮原子数为间距,并显示出良好的量的关系(图1) 。
Oda 研究组[12 ] 将酵母细胞分别于正常的与富含15N 的介质中培养,使其生长繁殖。一段时间后,将分别培养的细胞混合,通过反相液相色谱柱分离,收集到的组分进行SDS - PAGE 凝胶分离,然后胶上酶解,将酶解得到的肽段进行质谱分析,结果测知了S. 啤酒酵母中42 种高丰度蛋白在表达G1 cyclin CLN2 时显示出表达水平的差异。方法误差在10 %以内。该研究组继续用该方法研究酵母蛋白Ste20 的磷酸化修饰位点,结果只分析出未被磷酸修饰的肽段。
还有使用同位素排除的介质(即其中重质同位素的丰度远远低于其天然丰度) 来代替富含同位素的介质,也可以识别出蛋白质表达水平的变化。Tolic 研究组[13 ]使用该技术即样品与标准对照细胞分别培养于正常介质与重质同位素(如2H、13C、15N) 排除的介质中的方法来比较研究大肠杆菌中Cd 的强度响应,用傅立叶转换离子回旋共振质谱技术测量完整蛋白的分子量,结果比较了200 种不同蛋白质的表达水平。
代谢标记方法比较准确,但由于该方法是在细胞培养阶段标记同位素,所以不能直接用于组织样品的分析;富含同位素的介质可能会改变细胞生长中的某些过程,从而人为地改变蛋白质组的表达水平,即有时不能够真实地反映出细胞内蛋白质的表达情况;同位素试剂需要量较大,成本高;只能对已知序列的肽段进行定量分析,在对实际样品进行定量分析时,往往要求在定量分析前进行肽段结构鉴定,即氨基酸序列分析[8 ] 。
3. 2. 2 提取后标记方法
提取后标记方法,是指先将细胞或组织破碎,提取出相关的待分析部位后,再用同位素进行标记的方法。该方法通常是将相同种类但其中蛋白质表达水平不同的两个样品的细胞提取液,一份与含一定数目的重质同位素原子的试剂反应而被同位素标记作为内标物,另一份与正常的相同试剂(其中所有元素的含量皆为天然丰度) 作用作为被分析物。待反应完全后,将两者混合,消化酶解成若干肽段,然后选择分离出目标肽段,进行反相液相色谱分离,质谱鉴定,通过识别并比较所得质谱图中间距一定的分析对的峰的强度比来确定原样品某蛋白质
表达水平的差异,一般分析流程见图2。这种方法多用富含氘(2H) 原子的试剂。通常不含氘原子的试剂表示为d0 ,含氘原子的试剂用dn 表示,其中n 表示试剂中氘原子的个数。根据所使用的同位素试剂的不同,目前常用的方法有d0/ d3 、d0/ d4 、和d0/d8 三种。d0/ d3 与d0/ d4 法皆采用一种正常的酰基化试剂与分别含3 个、4 个氘原子的氘代酰基化试剂标记酶解后的多肽体系。该类试剂可与肽的N -端氨基发生稳定的酰基化反应,还可与肽中赖氨酸的ε- 氨基反应[14 ] 。所以当某肽段中不含赖氨酸时,分析物与内标物的质谱峰对分别相差3 和4 个质量单位,被分析肽段中每增加一个赖氨酸残基,该质谱峰对的差距就分别增加3 和4 个质量单位。
Regnier 研究组[14 ,15 ] 使用一种d0/ d3 试剂,N- 乙酰氧基琥珀酰亚胺与三氘代N - 乙酰氧基琥珀酰亚胺,进行蛋白质组学的定量分析研究。该试剂可与蛋白质或肽的N - 端氨基发生酰基化反应(图3) 。他们使用该同位素标记试剂,通过不同的亲和分离技术来选择性地分离目标肽段,并分别对其进行了质谱分析,结果检测出相差100倍的蛋白质表达水平。该研究组还比较了使用基质辅助激光解析(MALDI) 和电喷雾( ESI) 两种电离方式,结果显示使用ESI 的准确度和动态线性范围皆优于MALDI ,但MALDI 也具有ESI 无法相比的优点,即其可用于相对复杂的体系,尤其是当被分析的组分中含有超过50 种的肽段时的分析。Regnier 研究组[16 ,17 ]还提出了另一种同位素标记策略,即使用琥珀酸酐和氘代琥珀酸酐作为同位素标记试剂。这是一种d0/ d4 型同位素标记试剂,也是利用其与蛋白质或肽的N - 端氨基的酰基化反应,原理与d0/ d3 乙酰化反应类似。他们使用该试剂对酶解后的样品体系进行标记,再结合共价色谱技术以及固定金属亲和色谱技术选择性分离出目标肽段,经反相液相色谱分离-MALDI/ TOF 质谱技术进行定量分析。通过对标准肽段的标记和分析,考察了该标记试剂的标记特点和有效性,并进而用此法分析了大肠杆菌的细胞裂解液,定量检测出由于诱导剂IPTG的存在与否引起的蛋白PAD 表达水平的差异情况,结果良好。
Aebersold 研究组[18 ]提出一种使用d0/ d8 试剂的提取后标记方法,并对其标记条件[19 ]以及与之相应的质谱检测方法[20 ]进行了优化研究。他们使用的d0/ d8 试剂又称为ICAT ( Isotope - CodeAffinity Tag) 试剂。ICAT 试剂由生物素部分、含重质同位素的连接部分以及半胱氨酸活性烷基化反应部分三部分组成(图4) ,故该试剂不仅可以进行同位素标记,还可以实现对含半胱氨酸的肽段进行选择性分离,使分析过程大大简化而减少了过程误差。但是该方法由于ICAT 试剂的不易得到,且由于其含有较多的氘原子导致的分析物与内标物较大的色谱分离[11 ,21 ] 而使其应用受到限制。
利用酰基化反应对肽段进行标记,是利用肽段N - 端氨基的反应性质。利用肽段的C - 端羧基也可以对肽段进行同位素标记,Schnolzer[22 ]等在对蛋白质于富含18O 的水中酶解时,发现其C -端羧基可含有稳定结合的一个或两个18O 原子,他们对该实验事实进行了系统的研究,进而发现在一般的LC、ESI 和MALDI 条件下,氧原子与C - 端羧基碳原子的共价键是稳定的。Fenselau[23 ] 利用18O 标记对两种腺病毒进行了比较蛋白质组的研究,Takao 等其他几个研究组[24 - 27 ]也对利用18O标记- 质谱比较鉴定进行了不同角度的研究。
3. 2. 3 反转标记方法
Emil W. Fu 研究组[27 ]提出反转标记(inverse labeling) ,即进行两组实验,第一组为原标记实验(如上所述) ,第二组是以第一组为基础,将标记试剂反转使用,原来标记正常试剂的样品改用重质同位素试剂,而原来标记重质同位素试剂的样品现改用正常轻质同位素试剂。然后分别混合,质谱鉴定。这种研究思路最大的长处是大大增加了对不同样本中差异蛋白识别的确定性,加快了分析速度,且该方法对体系复杂程度的耐受性也大大增加
3. 2. 4 翻译后修饰作用的定量分析
翻译后修饰作用对细胞机制与功能调节起重要作用,因此,对某一翻译后修饰作用进行作用位点检测和定量分析是非常必要的。蛋白质中酪氨酸、丝氨酸和蛋氨酸等的磷酸作用是
重要的翻译后修饰作用之一。以往对磷酸化蛋白质的定量分析是采用HPLC 是分离[28 ] 磷酸化和未磷酸化的肽段,再用ESI - MS[29 - 31 ]进行分析并比较其丰度比。由于离子化效率不确定性的影响,只能得到一个非常粗略、不准确的定量结果。同位素标记的方法目前已应用于磷酸化作用的定量分析,一般是将蛋白质中结合的磷酸根通过β- 消除形成末端双键,然后通过Michael 亲电加成引入同位素试剂。同样可以采用代谢标记[32 ] 、提取后标记[33 - 36 ]以及反转标记几种方式,分析流程与前面讨论过的相应方法类似。
蛋白质中酪氨酸、丝氨酸和蛋氨酸等的糖基化作用也是一种非常重要的翻译后修饰作用。该作用除在细胞质中普遍存在外,细胞核内的氧位糖基化作用在转录控制中起十分重要的作用[36 ] 。Regnier 研究组[16 ]采用正常与氘代的N - 乙酰氧基琥珀酰亚胺标记样品体系,然后用外源凝集素(lectin) 柱亲和结合氧位糖基化的蛋白质和肽段,分离后的组分消化酶解后,经反相液相色谱柱分离,收集被分离组分,用MALDI - TOF 进行分析检测。他们用此方法对人的U937 细胞株的细胞核提取液中蛋白质的糖基化作用进行了定量分析。
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1 KC的基本特征
1. 1 KC的定位及形态 KC是体内最大的巨噬细胞群体,占单核/巨噬细胞系统总数的80% ~90%,占肝内非实质细胞的20%。KC来源于骨髓中的单个核细胞,定居在肝血窦的血管旁尤其是门脉区。KC体积较大,形态不规则,细胞外衣较厚,表面伸出许多板状或丝状伪足,并有许多微绒毛或皱襞,与识别和捕捉异物有关。KC胞内溶酶体数量较多,溶酶体内包含多种溶酶体酶,如组织蛋白酶B、酸性脂酶、溶菌酶等,胞质内可见各种吞饮小泡及吞噬小体。KC的质膜上有Toll样受体(toll like receptor, TLR)、内毒素(LPS)受体、清道夫受体、Fc受体、补体受体、半乳糖胺受体等,其中TLR-4作为LPS受体在LPS的识别及信号转导过程中具有重要作用。
1. 2 KC的功能 KC的基本功能是吞噬异物。KC是机体单核/巨噬细胞的重要组成部分,是最先接触来自胃肠道所吸收物质的细胞,具有强大的吞噬和吞饮能力,由于其所处的位置紧邻血管,因而很容易吞噬清除流经血液的内毒素、细胞碎片和微生物, KC也可以穿过Disse区和肝细胞直接接触并吞噬清除凋亡的肝细胞[1]。KC同时具有抗原提呈功能,与肝树突状细胞、肝窦内皮细胞和肝星形细胞共同构成了抗原提呈系统。肝脏是一个免疫器官,所含的淋巴细胞有两类,一是在初始免疫应答中发挥作用的淋巴细胞群体,主要包括NK细胞和NKT细胞,大约占肝脏淋巴细胞数量的30%,是免疫防御的第一道防线,主要针对病毒感染的细胞和肿瘤细胞进行杀伤清除。二是在适应性免疫应答中发挥作用的传统T细胞,主要包括CD8+T 和CD4+T细胞[2]。KC摄取抗原后分泌多种细胞因子,主要包括TNF-A、IL-12、IL-18和IL-10 等,它们主要经TLR信号通路中的TRIF和MyD88途径产生[1]。在这些因子中TNF-A被认为是内毒素发挥毒性效应最重要的物质,具有广谱的生理和病理效应,低水平的TNF-A是肝细胞生长分化与再生所必需的调节因子,高水平的TNF-A既可以诱导肝细胞凋亡,也可以导致肝细胞坏死。IL-12、IL-18和IL-10之间的平衡决定了NK和T细胞的活化,反过来T细胞和NK细胞产生的IFN-C也可有效的激活KC。
1. 3 KC的病理生理意义大量研究表明KC参与多种肝损伤疾病的形成[3],如酒精肝、非酒精性脂肪肝、药物性肝炎、肝切除或移植中的缺血再灌注损伤等。KC活化后可释放多
种活性细胞因子包括反应氧中间产物(ROI)、NO、TNF-A、IL-6、IL-1和IL-10等,其中ROI
在KC介导的肝细胞损伤中起重要作用, ROI可引发脂质过氧化反应,损伤生物膜系统及核酸和蛋白,最终导致肝细胞死亡。KC分泌的NO及其氧化物也在KC介导的肝功能变化中有一定作用。虽然NO有抑制血小板聚集、扩张血管的功能,但是NO可抑制肝细胞蛋白合成,抑制线粒体功能,进而损伤肝细胞。TNF-A可通过肝细胞膜上TNF受体介导肝细胞的损伤,还介导其他细胞因子的分泌如IL-6、IL-1、血小板活化因子、前列腺素、集落刺激因子等, TNF与这些因子一起可加重肝脏的损伤。另一种KC参与的重要肝脏病理改变是肝纤维化。肝纤维化是慢性肝病发展的重要阶段,病理学特征表现为汇管区和肝小叶内有大量纤维组织增生和沉积,如果病变继续发展则有可能进展为肝硬化甚至肝癌。KC能分泌与肝纤维化有关的细胞因子如TGF-B、血小板源性生长因子( PDGF)、血管紧张素ò、TNF-A和IL-1[4],这些因子通过刺激肝星形细胞(Hepatic stellite cel,l HSC)增殖并合成细胞外基质、趋化成纤维细胞、刺激间质细胞有丝分裂和诱导成纤维细胞合成胶原等机制促进肝纤维化的形成。因此,抑制KC分泌细胞因子将有助于抑制HSC的活化和肝纤维化的发展。
一、枯否细胞吞噬功能测定方法[7]
取接种于盖玻片的枯否细胞,每皿中加入1@108个聚苯乙烯乳珠,培养60 min后,盖玻片用PBS漂洗3次,3%甲醛或甲醇固定10 min,Giemsa染色,倒置显微镜下观察枯否细胞吞噬聚苯乙烯乳珠情况并计数。每片随机取5个视野,每个视野随机取20个枯否细胞进行计数,枯否细胞吞噬聚苯乙烯乳珠数的平均值代表该皿(片)枯否细胞的吞噬功能。
二、枯否细胞微丝的荧光染色方法[8]
取枯否细胞盖玻片,经2%甲醛固定和0.5%Tr-iton X-100抽提后,暗室中异硫氰酸荧光素鬼笔环肽Phalloidin-FITC染色,荧光显微镜(Olympus-BH2)下观察,柯达彩色胶卷照相,同一条件冲洗。
三、枯否细胞中肌动蛋白含量测定方法[9]
取接种于玻璃培养皿中枯否细胞,暗室中经Phalloidin-FITC染色后,甲醇提取其中Phalloidin-FITC,岛津RF5000型荧光光度仪测定甲醇提取液荧光强度,由标准曲线计算其中Phalloidin-FITC含量,5@104枯否细胞中Phalloidin-FITC量表示其肌动蛋白含量。
四、枯否细胞微管的免疫荧光染色和微管荧光灰度测定方法
枯否细胞盖片,按说明书方法,甲醇固定后,暗室中异硫氰酸荧光素抗A微管蛋白抗体(1B25)染色,荧光显微镜下观察。每片柯达彩色胶卷同一条件拍照两张,同一条件冲冼。每张任选5个细胞,MIAS-300图像分析系统计算细胞平均相对灰度,表示细胞内微管含量。
五、枯否细胞凋亡检测方法[10]
枯否细胞(2@106)经70%乙醇固定后,PI综合染液(PI 50 mg/L, RNA酶10 mg/L,Triton - 100 110%)/一步法0避光染色,FACSCalibur流式细胞检测。检测条件:15 mW氩离子激光,激发波长488nm。Cellqust软件程序自动获取104个细胞,计算亡率。
蛋白质组学答案终稿
1，基因组：一个细胞或病毒所包含的全部基因。 2，蛋白质组(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出。定义：蛋白质组是由一个细胞，一个组织或一个机体的基因组所表达的全部相应的蛋白质。是一个整体概念。 3，蛋白质组学：是一门以全面的蛋白质性质研究(如表达水平、转录修饰、相互作用等)为基础，在蛋白质水平对疾 病机理、细胞模式、功能联系等方面进行探索的科学，包括表达蛋白质组学，细胞谱蛋白质组学以 3，等电聚焦：分离两性分子，特别是分离蛋白质的一种技术。根据在一个电场的影响下这些两性分子在ph梯度上的分布情况进行分离 等电聚焦技术：在一个pH梯度和外加电场下，蛋白质有移向pH梯度中使其净电荷为零的点的倾向。（带正电荷移向阴极，带负电荷移向阳极）。IEF可以基于极微小的电荷差异而分离蛋白，具有高分辨率。4，负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果（图2-15），分辨力可达1.5nm左右 5，质谱（又叫质谱法）是一种与光谱并列的谱学方法，通常意义上是指广泛应用于各个学科领域中通过制备、分离、检测气相离子来鉴定化合物的一种专门技术。 质谱分析是一种测量离子荷质比（电荷-质量比）的分析方法，其基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带正电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。 7，分子离子峰：子受电子束轰击后失去一个电子而生成的离子M+成为分子离子。在质谱图中，由M+所形成的峰称为分子离子峰。 7.碎片离子峰当电子轰击的能量超过分子离子电离所需要的能量（50~70eV）时，可能使分子离子的化 学键进一步断裂，产生质量数较低的碎片，称为碎片离子。在质谱图上出现相应的峰，称为碎片离子峰。 碎片离子峰在质谱图上位于分子离子峰的左侧。研究最大丰度的离子断裂过程，能提供被分析化合物的结构信息。 8.软电离技术在质谱分析中，离子源是将分子离解成离子或解离成碎片，在这里分子失去电子， 生成带正电荷的分子离子。分子离子可进一步裂解，生成质量更小的碎片离子。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大，因此，对于不同的分子应选择不同的离解方法。通常称能给样品较大能量的电离方法为硬电离方法，而给样品较小能量的电离方法为软电离方法，后一种方法适用于易破裂或易电离的样品。 9.源内衰变技术（insource-decay，ISD）源内衰变发生在离子源区域内，时间为激光撞击之后几 百纳秒之内，是离子的“即可片段化”。这些片段离子通过衰减离子取出，能在线性飞行时间质谱中被发现，许多蛋白质和大的肽常在MOLDI-TOF-MS的离子源区域内变成肽离子片段。主要产生含N端的b型和含C端的y型片段离子，通过分析这些片段离子谱可鉴定蛋白质。 10.肽质量指纹图谱是指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。由于 每种蛋白质的氨基酸序列都不同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物质量数据也具特征性，这种特征就像指纹一样，所以称为指纹谱。肽质量指纹图谱可用于蛋白质的鉴定，用实验测得的PMF与蛋白数据库中的蛋白质理论PMF比对，就可以鉴定该蛋白质 肽序列标签是由一个多肽的部分氨基酸序列和该肽的质量以及该肽未测序部分的质量等组成。
干细胞研究进展综述
干细胞研究进展(综述) Advances in the research of stem cells（LR） 【摘要】：干细胞是人体及其各种组织细胞的最初来源,具有高度自我复制、高度增殖和多向分化的潜能。干细胞技术是生物技术领域最具有发展前景和后劲的前沿技术，其已成为世界高新技术的新亮点，势将导致一场医学和生物学革命。干细胞研究正在向现代生命科学和医学的各个领域交叉渗透,干细胞技术也从一种实验室概念逐渐转变成能够看得见的现实。干细胞研究作为一门新兴学科已成为生命科学中的热点。本文对近几年来国内外对干细胞的研究现况作一综述。 【关键词】：干细胞因子帕金森病神经干细胞糖尿病 ABSTRACT：Stem cells are the body and cells of various tissues of origin, has high self replication, high proliferation and multilineage differentiation potential. Stem cell technology is the field of biotechnology has the most development prospect and potential of cutting-edge technology, it has become a new bright spot in the world of high-tech, will lead to a revolution in medicine and biology. The research of stem cell is to modern life science and medical fields intersection, stem cell technology from a laboratory concept gradually transformed to be able to see the reality. Stem cell research as a new discipline has become the hotspot of life science. Based on the domestic and abroad in recent years on stem cell research summarizes. Keywords:Stem cell factor Parkinson disease Neural stem cells Diabetes mellitus 干细胞技术最显著的特征就是能再造一种全新的、正常的甚至更年轻的细胞、组织或器官。由此人们可以用自身或他人的干细胞和干细胞衍生组织、器官替代病变或衰老的组织、器官，并可以广泛涉及用于治疗传统医学方法难以医治的多种顽症。 干细胞研究是一门新兴的学科,干细胞生物学研究与应用几乎涉及所有的生命科学和生物 医学领域。 一、目前干细胞的主要研究热点
肝脏在蛋白质代谢中的作用
肝脏在蛋白质代谢中的作用 肝脏在蛋白质代谢中的作用 肝内蛋白质的代谢极为活跃，肝蛋白质的半寿期为10天，而肌肉蛋白质半寿期则为180天，可见肝内蛋白质的更新速度较快。肝脏除合成自身所需蛋白质外，还合成多种分泌蛋白质。如血浆蛋白中，除-珠蛋白外，白蛋白、凝血酶原、纤维蛋白原及血浆脂蛋白所含的多种载脂蛋白（Apo 肝内蛋白质的代谢极为活跃，肝蛋白质的半寿期为10天，而肌肉蛋白质半寿期则为180天，可见肝内蛋白质的更新速度较快。肝脏除合成自身所需蛋白质外，还合成多种分泌蛋白质。如血浆蛋白中，除γ-珠蛋白外，白蛋白、凝血酶原、纤维蛋白原及血浆脂蛋白所含的多种载脂蛋白（Apo A、Apo B、C、E）等均在肝脏合成。故肝功能严重损害时，常出现水肿及血液凝固机能障碍。肝脏合成白蛋白的能力很强。成人肝脏每日约合成12g白蛋白，占肝脏合成蛋白质总量的四分之一。白蛋白在肝内合成与其它分泌蛋白相似，首先以前身物形式合成，即前白蛋白原（preproalbumin），经剪切信号肽后转变为白蛋白原（proalturnin）。再进一步修饰加工，成为成熟的白蛋白（alturnin）。分子量69，000，由550个氨基酸残基组成。血浆白蛋白的半寿期为10天，
由于血浆中含量多而分子量小，在维持血浆胶体渗透压中起着重要作用。? 肝脏在血浆蛋白质分解代谢中亦起重要作用。肝细胞表面有特异性受体可识别某些血浆蛋白质（如铜兰蛋白、α1 抗胰蛋白酶等），经胞饮作用吞入肝细胞，被溶酶体水解酶降解。而蛋白所含氨基酸可在肝脏进行转氨基、脱氨基及脱羧基等反应进一步分解。肝脏中有关氨基酸分解代谢的酶含量丰富，体内大部分氨基酸，除支链氨基酸在肌肉中分解外，其余氨基酸特别是芳香族氨基酸主要在肝脏分解。故严重肝病时，血浆中支链氨基酸与芳香族氨基酸的比值下降。? 在蛋白质代谢中，肝脏还具有一个极为重要的功能：即将氨基酸代谢产生的有毒的氨通过鸟氨酸循环的特殊酶系 合成尿素以解氨毒。鸟氨酸循环不仅解除氨的毒性，而且由于尿素合成中消耗了产生呼吸性H+的CO2，故在维持机体酸碱平衡中具有重要作用。? 肝脏也是胺类物质解毒的重要器官，肠道细菌作用于氨基酸产生的芳香胺类等有毒物质，被吸收入血，主要在肝细胞中进行转化以减少其毒性。当肝功不全或门体侧支循环形成时，这些芳香胺可不经处理进入神经组织，进行β-羟化生成苯乙醇胺和β-羟酪胺。它们的结构类似于儿茶酚胺类神经递质，并能抑制后者的功能，属于“假神经递质”，与肝性脑病的发生有一定关系。
蛋白质组学研究方法选择及比较
蛋白质组学研究方法选择及比较 目前研究蛋白组学的主要方法有蛋白质芯片及质谱法，本文将从多方面对两种研究方法进行了解与比较； 蛋白质芯片（Protein Array） 将大量不同的蛋白质有序地排列、固定于固相载体表面，形成微阵列。利用蛋白质分子间特异性结合的原理，实现对生物蛋白质分子精准、快速、高通量的检测。 主要类型： ●夹心法芯片(Sandwich-based Array) ●标记法芯片(Label-based Array) ●定量芯片(Quantitative Array) ●半定量芯片(Semi-Quantitative Array) 质谱（Mass Spectrometry） 用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测，测出离子准确质量并确定离子的化合物组成，即通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 主要类型：
●二维电泳+质谱(2D/Mass Spectrometry, MS) ●表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization- time of flight, SELDI) ●同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) Protein Array or Mass Spectrometry？ 如何选择合适的研究方法？以下将从六个方面进行比较与推荐： 1.筛查蛋白组学表达差异 建议选择：RayBiotech（1000个因子的芯片）+质谱 a)不同的方法学有不同的特点：对于质谱，可以筛查到未知的蛋白，但是对于分子量大、 低丰度的蛋白质，质谱的灵敏度和准确性有一定的限制。 b)不同的方法能筛查到的目标不同：根据Proteome Analysis of Human Aqueous Humor 一文中报道，质谱筛查到的差异蛋白集中在小分子与代谢物。而用RayBiotech芯片筛查到的结果，多是集中在细胞因子、趋化、血管、生长等等。 c)质谱筛查到355个蛋白，而RayBiotech抗体芯片也筛查到328个蛋白，且用定量芯片 验证25个蛋白有差异，这些蛋白是质谱找不到的。目前RayBiotech夹心法抗体芯片已经可以检测到1000个蛋白，采用双抗夹心法，尤其是对于低丰度蛋白，有很好的灵敏度和特异性，很多的低丰度蛋白是抗体芯片可以检测出来，而质谱检测不到的，且样品不经过变性和前处理，保持天然状态的样品直接检测，对于蛋白的检测准确度高。 d)质谱的重复性一直是质谱工作者纠结的问题，不同操作者的结果，不同样品处理条件， 峰值的偏移等影响因素都会产生大的影响；RayBiotech的夹心法芯片重复性高。
蛋白质组学期末作业
蛋白质组学期末作业
1、一、常用的样品制备技术： 1、高丰度蛋白去除技术（抗体亲和法：通过抗原抗体反应原理，用针对样品中多种高丰度蛋白的单克隆或多克隆抗体来特异性去除样品中的高丰度蛋白；染料亲和法：通过高丰度蛋白与染料环结构之间复杂的静电、疏水及氢键相互作用去除样品中的高丰度蛋白，其特异性相对较低。） 2、自由流电泳技术（FFE）（FFE分离原理－IEF （等电聚焦）条件下：根据等电点的不同进行样品分离，主要用于分离蛋白质。ZE（区带电泳）条件下：根据样品表面电荷密度不同进行分离，主要用于分离细胞器。FFE的特点：1、是基于液体的样品分离/制备技术，与所有下游分离技术兼容；2、分离非常快； 3、液相分离保证初始样品具有很高的回收率； 4、采用连续模式，上样和分离连续同时进行； 5、分析对象广泛； 6、分离条件温和，适合活性生物材料的分离纯化。 二、2－DE技术，即双向电泳，是当前蛋白质组学研究中分辨率最高、信息量最大的分离技术。它的优点有：1. 可以将上千种不同的蛋白质分离开来，并得到每种蛋白质的等电点、表观
质膜的纯度鉴定方法 11、形态学方法（常规透射电镜、免疫电镜观察其切片，纯细胞膜成空的膜泡或片状结构）2免疫印迹法（常用抗体:抗caveolin、Na+--K+--ATPase、flotillin、5`-nucleotidase 等） 3、酶活测定法（测 AP、ADP、Na+-K+-ATPase、5`-nucleotidase的活性） 4、膜组分分析法（分析脂质与蛋白质的比例） 由于细胞器在细胞内结构上与许多其他亚细胞组分相关联，和细胞器组成的动态性，所以分离得到的细胞器很难达到100% 的纯度。所以，亚细胞组分的纯度问题和亚细胞组分生物学功能的深入挖掘是亚细胞蛋白质组研究所面临的挑战。现在已经有一些研究策略来解决这一难点问题，如Schirmer等提出的差减蛋白质组学方法来解决核膜的内质网污染问题；Andersen 等提出的蛋白质校正谱图分析法(protein correlation profiling，PCP)来分析可能定位
国内近期干细胞研究进展
干细胞研究进展消息 干细胞是人体及其各种组织细胞的最初来源, 具有高度自我复制、高度增殖和多向分化的潜能。干细胞研究正在向现代生命科学和医学的各个领域交叉渗透, 干细胞技术也从一种实验室概念逐渐转变成能够看得见的现实。干细胞研究已成为生命科学中的热点。介于此, 本刊将就干细胞的最新研究进展情况设立专栏, 为广大读者提供了解干细胞研究的平台。 干细胞专题近期国外干细胞研究进展 Geron抗癌药GRN163L选择性瞄准癌症干细胞据美国BussinessWire 1月10日报道称, 杰隆(Ge-ron)发表临床前研究数据显示, 其端粒酶抑制剂药物imetelstat (GRN163L)在小儿科神经肿瘤当中可选择性瞄准癌症干细胞, 这一发现为儿童肿瘤的临床试验提供了支持。该研究发表于2011年1月1日的Clinical Cancer Research杂志上。近年来有关端粒酶抑制的研究日益增多, 成为癌症治疗的一个热点方向, GRN163L是此类药物开发中最前沿的一个候选药物。2002年3月, Geron从Lynx Therapcutics获得了用GRN163和GRN163L两种化合物的核心专利。早期研究显示, GRN163对十四种不同癌症细胞均表现出有意义的端粒酶活性抑制作用, 它可以抑制黑色素瘤等细胞的生长。因脂质修饰物GRN163L更易进入细胞发挥端粒酶抑制作用, 后续临床前及临床试验均为GRN163L。2005年, FDA同意GRN163L在患慢性淋巴细胞白血病患者的临床实验。2007年, Geron公司开始GRN163L单独治疗多发性骨髓瘤的I期临床试验。2008年开始了GRN163L治疗乳腺癌的I期临床试验。同年12月, Geron发布了有关GRN163L治疗再发的和难治的多发性骨髓瘤的暂时性临床试验数据。2009年, Geron发布了Geron163L对抗癌症干细胞的实验活动, 包括非小型细胞肺癌、乳癌、胰脏炎、前列腺癌、小儿科神经肿瘤。公司发表Geron163L治疗乳癌的假定癌症干细胞与胰脏炎症系数据。数据显示, 在以Geron163L治疗后, 人类乳癌细胞MCF7的假定干细 胞数量与自我再生的能力大幅减弱。目前Geron163L正处于临床II期试验中。(来源: 生物谷2011-01-11)Cell Stem Cell: iPS细胞具更高基因畸变频率加州大学圣地亚哥分校医学院及斯克里普斯研究所的干细胞科学家领导的跨国研究团队, 记录了在人类胚胎干细胞(hESC)和诱导功能干细胞(iPSC)系中特殊的基因畸变, 研究结果在1月7日的Cell Stem Cell上发表。该公布的发现强调了需要对多能干细胞进行频繁的基因检测以保证其稳定性和临床安全性。该研究的第一作者, 加州大学圣地亚哥分校再生医学系的路易斯·劳伦特博士认为, 人类多能干细胞(hESC和iPSC)比其他类型细胞有更高的基因畸变频率。最令人吃惊的是, 与其他非多能干细胞样本相比较, 观察到hESC的基因扩增和iPSC的缺失方面出现的频率更高。人类多能干细胞在人体内具有发展成其他类型细胞的能力, 可成为细胞替换治疗的潜在来源。斯克里普斯研究员再生医学中心主任珍妮·罗伦教授谈到, 由于基因畸变常常与癌症相关联, 免受癌症相关的基因突变对于临床使用的细胞系来说至关重要。研究团队确认了在多能干细胞系中可能发生突变的基因区域。对于hESC而言, 可观察到的畸变大多是靠近多潜能相关基因区域的基因扩增; 对于iPSC而言, 扩增主要涉及细胞增殖基因及与肿瘤 抑制基因相关的缺失。传统的显微技术, 如染色体组型分析可能无法检测到这些变化。研究组使用一种高分辨率的分子技术, 称为“单核苷酸多态性(SNP)”, 能观察到人类基因组里一百多万个位点里的基因变化。 劳伦特说, 我们惊喜地发现在较短时间培养中的基因变化, 例如在体细胞重编程为多能干细胞的343过程以及在培养中细胞的分化过程。我们不知道这会有怎样的影响, 如果有的话, 这些基因畸变都会对基础研究或者临床应用的结果产生影响, 对此应当深究。劳伦特总结到, 该研究结果解释了有必要对多能干细胞培养进行经常性的基因监控, SNP分析仍不失为人类胚胎干细胞和多能干细胞日常监控的一部分, 但是这一结果提醒我们应当予以重视。(来源: 中国干细胞网2011-01-12)美用胚胎干细胞制造出血小板美国先进细胞技术公司的实验证明, 使用人类胚胎干细胞研制出的血小板可修复实验鼠的受损组织, 人类未来有望源源不断地
干细胞研究的历史、现状与未来
干细胞研究的历史、进展与未来 中国科学技术大学生命科学学院2004级胡文宝 干细胞是尚未分化发育的，能生成各种器官组织的全能细胞。它是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，即这些细胞可以通过细胞维持自身细胞群大小，同时又可以进一步分化成为各种不同的组织细胞，从而构成机体各种复杂的组织和器官。干细胞可以来自胚胎、胎儿或成体。根据其来源不同，干细胞可分胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞的分化和增殖构成动物发育的基础，即由单个受精卵发育成为具有各种组织器官的个体，成体干细胞的进一步分化则是成年动物体内组织和器官修复再生的基础。 干细胞研究的历史： 1959年，美国首次报道了通过体外受精（IVF）动物。 60年代，几个近亲种系的小鼠睾丸畸胎瘤的研究表明其来源于胚胎生殖细胞（embryonic germ cells, EG细胞）,此工作确立了胚胎癌细胞（embryonic carcinoma cells, EC细胞）是一种干细胞。 1968年，Edwards 和Bavister 在体外获得了第一个人卵子。 70年代，EC细胞注入小鼠胚泡产生杂合小鼠。培养的SC细胞作为胚胎发育的模型，虽然其染色体的数目属于异常。 1978年，第一个试管婴儿，Louise Brown 在英国诞生。 1981年，Evan, Kaufman 和Martin从小鼠胚泡内细胞群分离出小鼠ES细胞。他们建立了小鼠ES细胞体外培养条件。由这些细胞产生的细胞系有正常的二倍型，像原生殖细胞一样产生三个胚层的衍生物。将ES细胞注入上鼠，能诱导形成畸胎瘤。 1984—1988年，Anderews 等人从人睾丸畸胎瘤细胞系Tera-2中产生出多能的、可鉴定的（克隆化的）细胞，称之为胚胎癌细胞（embryonic carcinoma cells, EC细胞）。克隆的人EC细胞在视黄酸的作用下分化形成神经元样细胞和其他类型的细胞。 1989年，Pera 等分离了一个人EC细胞系，此细胞系能产生出三个胚层的组织。这些细胞是非整倍体的（比正常细胞染色体多或少），他们在体外的分化潜能是有限的。 1994年，通过体外授精和病人捐献的人胚泡处于2-原核期。胚泡内细胞群在培养中得以保存其周边有滋养层细胞聚集，ES样细胞位于中央。 1998年，Thomoson等从治疗不育症的夫妇捐献的正常人胚泡中分离得到内细胞群。细胞经培养可多次传代，保持正常核型，具有高水平的端粒酶活性，表达人ES细胞而灵长类ES细胞的特征。当将几种非克隆化细胞系的细胞注入免疫缺陷小鼠内后可形成畸胎瘤。畸胎瘤含有来源于原始胚层的多种细胞类型，这证明了人ES细胞的多能性。 2000年，由Pera、 Trounson 和 Bongso 领导的新加坡和澳大利亚科学家从治疗不育症的夫妇捐赠的胚泡内细胞群中分离得到人ES细胞，这些细胞体外增殖，保持正常的核型，自发分化形成来源于三个胚层的体细胞系。将其注入免疫缺陷小鼠错开内产生畸胎瘤。 2003，建立了人类皮肤细胞与兔子卵细胞种间融合的方法，为人胚胎干细胞研究提供了新的途径。 2004年，Massachusetts Advanced Cell Technology 报道克隆小鼠的干细胞可以通过形成细小血管的心肌细胞修复心衰小鼠的心肌损伤。这种克隆细胞比来源于骨髓的成体干细胞修复作用更快、更有效，可以取代40%的瘢痕组织和恢复心肌功能。这是首次显示克隆干细胞在活体动物体内修复受损组织。 干细胞研究的进展： 1.干细胞的来源 胚胎干细胞主要来源于胚胎组织，而用于治疗的应该是人的胚胎干胚胎干细胞，由于人
肝脏的生化功能
肝脏是机体最大的腺体，它在机体的代谢﹑胆汁生成﹑解毒﹑凝血﹑免疫﹑热量产生及水与电解质的调节中均起着非常重要的作用，是机体内的一个巨大的“化工厂”。 代谢功能： ①糖代谢：饮食中的淀粉和糖类消化后变成葡萄糖经肠道吸收，肝脏将它合成肝糖原贮存起来；当机体需要时，肝细胞又能把肝糖原分解为葡萄糖供机体利用。 ②蛋白质代谢：肝脏是人体白蛋白唯一的合成器官；γ球蛋以外的球蛋白﹑酶蛋白及血浆蛋白的生成﹑维持及调节都要肝脏参与；氨基酸代谢如脱氨基反应﹑尿素合成及氨的处理均在肝脏内进行。 ③脂肪代谢：脂肪的合成和释放﹑脂肪酸分解﹑酮体生成与氧化﹑胆固醇与磷脂的合成﹑脂蛋白合成和运输等均在肝脏内进行。 ④维生素代谢：许多维生素如A B C D和K的合成与储存均与肝脏密切相关。肝脏明显受损时会出现维生素代谢异常。 ⑤激素代谢：肝脏参与激素的灭活，当肝功长期损害时可出现性激素失调。 胆汁生成和排泄：胆红素的摄取﹑结合和排泄，胆汁酸的生成和排泄都由肝脏承担。肝细胞制造﹑分泌的胆汁，经胆管输送到胆囊，胆囊浓缩后排放入小肠，帮助脂肪的消化和吸收。 解毒作用：机体代谢过程中所产生的一些有害废物及外来的毒物﹑毒素、药物的代谢和分解产物均在肝脏解毒。 免疫功能：肝脏是最大的网状内皮细胞吞噬系统，它能通过吞噬﹑隔离和消除入侵和内生的各种抗原。 凝血功能：几乎所有的凝血因子都由肝脏制造，肝脏在机体凝血和抗凝两个系统的动态平衡中起着重要的调节作用。肝功破坏的严重程度常与凝血障碍的程度相平行，临床上常见有些肝硬化动物因肝功衰竭而致出血甚至死亡。 其它：肝脏参与肌体血容量的调节﹑热量的产生和水、电解质的调节。如肝脏损害时对钠﹑钾﹑铁﹑磷﹑等电解质调节失衡，常见的是水钠在体内潴留，引起水肿、腹水等。 代谢功能： 1、肝脏参与糖代谢过程。对糖的贮存，分布和调节具有重要意义。在正常情况下，血液中葡萄糖的浓度是恒定的，空腹时血糖的浓度为每100毫升血液中含80-100毫克。饭后，食物在胃肠道内分解成葡萄糖，一部分直接入血液循环供人体利用，大部分经肝细胞合成肝糖元，贮存于肝脏。当饥饿、劳动、发热时，血糖浓度下降，此时肝细胞又能把肝糖元分解成葡萄糖，进入血液循环，提高血糖的浓度，维持血糖的正常乎衡。肝脏可以通过一系列的化学变化，将多余的蛋白质，脂肪转变为糖元。在机体营养状况好肝糖元贮备丰富时，可以保护肝脏免受损害。
线粒体蛋白质组学的研究进展(一)
线粒体蛋白质组学的研究进展(一) 【摘要】线粒体是真核细胞重要的细胞器，随着蛋白质组技术的发展和完善，一些新方法也被应用于线粒体蛋白质的研究，线粒体蛋白质组研究虽然已取得了一些成果，但线粒体蛋白质组数据库中的数据仍较匮乏，并且还有一些问题亟待解决和改善。 【关键词】线粒体；蛋白质组学 人类体细胞中除了红细胞，其他所有细胞均含有线粒体。线粒体是真核细胞重要的细胞器，它不仅是机体的能量代谢中心，而且还参与多种重要的细胞病理过程。线粒体拥有自己的DNA（mtDNA），可以进行转录、翻译蛋白质合成。线粒体含有500～2000种蛋白质，约占整个细胞蛋白质种类的5%~10%。线粒体的蛋白质参与机体许多生理、病理过程，如参与电子传递和ATP合成、三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等过程。线粒体蛋白质结构与功能的改变与人类许多疾病相关，如退行性疾病、心脏病、衰老和癌症。运用蛋白质组研究技术，从整体上研究这些蛋白质在生理及病理状态下的变化趋势及相互关系，可以为线粒体作用机制的探索提供新的有力的支持。 1线粒体的超微结构和功能 线粒体是机体细胞中重要的亚细胞器，它具有独特的超微结构和多种重要的生物学功能。线粒体由两层膜包被，外膜平滑，内膜向内折叠形成嵴，两层膜之间有腔，线粒体中央是基质。基质内含有与三羧酸循环所需的全部酶类，内膜上具有呼吸链酶系及ATP酶复合体。线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所，有细胞“动力工厂”之称。线粒体合成的ATP供给几乎所有的细胞生理过程：从骨骼肌和心肌的收缩，到细胞膜跨膜离子梯度的维持、甚至激素和神经递质的分泌等。另外，线粒体有自身的DNA和遗传体系，但线粒体基因组的基因数量有限，因此，线粒体只是一种半自主性的细胞器。线粒体的主要化学成分是蛋白质和脂类，其中蛋白质占线粒体干重的65%~70%，脂类占25%~30%。在肝细胞线粒体中外膜、内膜、膜间隙和基质四个功能区，各蛋白质的含量依次为：基质67%，内膜21%，外膜8%，膜间隙4%。内膜含有三类功能性蛋白：（1）呼吸链中进行氧化反应的酶。（2）ATP合成酶复合物。（3）一些特殊的运输蛋白，调节基质中代谢物的输出和输入。细胞线粒体的功能，不仅限于生物学功能。它们在氨基酸和血脂新陈代谢、血红素和铁硫群生物合成、细胞信号与细胞凋亡发挥关键作用。 2线粒体蛋白质组学概述 2.1蛋白质组学的概念蛋白质组学（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。 2.2蛋白质组学的研究内容蛋白质组学的研究内容主要有两个方面：即结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。结构蛋白质组学主要是蛋白质表达模式的研究，包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析、种类分析及数量确定。功能蛋白质组学主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质的功能及蛋白质间的相互作用。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为多种疾病机制的阐明及攻克，提供理论根据和解决途径。 2.3线粒体蛋白质组的分析对蛋白质组组成的分析鉴定是蛋白质组学中与基因组学相对应的主要内容。目前线粒体蛋白质组的分析工作主要有:（1）通过双向电泳等技术得到正常生理条件下的蛋白质的图谱，建立相应的数据库。（2）比较病理组织细胞蛋白质组发生的变化，如蛋白质表达量的变化,翻译后修饰的类型和程度,或者可能的条件下分析蛋白质在亚细胞水平上定位的改变等。 2.4线粒体蛋白质组研究技术线粒体蛋白质组研究常用的技术有：（1）用于蛋白质相互作用
蛋白质组学生物信息学分析介绍
生物信息学分析FAQ CHAPTER ONE ABOUT GENE ONTOLOGY ANNOTATION (3) 什么是GO？ (3) GO和KEGG注释之前，为什么要先进行序列比对（BLAST）？ (3) GO注释的意义？ (3) GO和GOslim的区别 (4) 为什么有些蛋白没有GO注释信息？ (4) 为什么GO Level 2的统计饼图里蛋白数目和差异蛋白总数不一致？ (4) 什么是差异蛋白的功能富集分析&WHY？ (4) GO注释结果文件解析 (5) Sheet TopBlastHits (5) Sheet protein2GO/protein2GOslim (5) Sheet BP/MF/CC (6) Sheet Level2_BP/Level2_MF/Level2_CC (6) CHAPTER TWO ABOUT KEGG PATHWAY ANNOTATION (7) WHY KEGG pathway annotation? (7) KEGG通路注释的方法&流程？ (7) KEGG通路注释的意义？ (7) 为什么有些蛋白没有KEGG通路注释信息？ (8) 什么是差异蛋白的通路富集分析&WHY？ (8) KEGG注释结果文件解析 (8) Sheet query2map (8) Sheet map2query (9) Sheet TopMapStat (9) CHAPTER THREE ABOUT FEATURE SELECTION & CLUSTERING (10) WHY Feature Selection? (10)
聚类分析（Clustering） (10) 聚类结果文件解析 (10) CHAPTER FOUR ABOUT PROTEIN-PROTEIN INTERACTION NETWORK (12) 蛋白质相互作用网络分析的意义 (12) 蛋白质相互作用 VS生物学通路？ (12) 蛋白质相互作用网络分析结果文件解析 (12)
蛋白质组学课程论文
蛋白质组学关键技术研究进展 摘要：蛋白质组学是对蛋白质特别是其结构和功能的大规模研究，是在90年代初期，由Marc Wikins 和学者们首先提出的新名词。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。本文综述了蛋白质组学的一些关键技术的应用研究进展。 关键词：蛋白质组学；蛋白质组技术；研究方法 蛋白质组学的概念[1]最早是在1995年提出的，它在本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。近年来，高通量蛋白质分离与鉴定技术，如双向电泳、生物质谱、蛋白质芯片、酵母双杂交系统、生物信息学等相继建立并日趋完善，加速了蛋白质组学的发展。 1蛋白质组学概述 随着人类基因组计划的完成和功能基因组时代的到来，蛋白质结构与功能研究越来越重要，蛋白质组学、生物信息学等相关学科已逐渐成为生命科学的前沿。 随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。尽管现在已有多个物种的基因组被测序，但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。 目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析(Serial analysis of gene expression, SAGE)等，都是从细胞中mRNA的角度来考虑的，其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实并不完全如此，从DNA、mRNA、蛋白质，存在三个层次的调控，即转录水平调控(Transcriptional control)，翻译水平调控(Translational control)，翻译后水平调控(Post-translational control)。从mRNA 角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。实验也证明，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相
肝干细胞与肝损伤的研究进展
wcjd@https://www.wendangku.net/doc/6612788550.html, 文献综述 REVIEW 肝干细胞与肝损伤的研究进展姚 鹏, 李绍祥 姚鹏, 李绍祥, 中国人民解放军北京军区总医院全军肝病中心 北京市 100700 通讯作者: 姚鹏, 100700, 北京市, 中国人民解放军北京军区总医院全军肝病中心. pyao1@https://www.wendangku.net/doc/6612788550.html, 收稿日期: 2008-01-30 修回日期: 2008-03-22 Advance in hepatic stem cells and liver injury Peng Yao, Shao-Xiang Li Peng Yao, Shao-Xiang Li, Center for Hepatology, Gen-eral Hospital of Chinese PLA Beijing Command, Beijing 100700, China Correspondence to: Peng Yao, Center for Hepatology, General Hospital of Chinese PLA Beijing Command, Bei-jing 100700, China. pyao1@https://www.wendangku.net/doc/6612788550.html, Received: 2008-01-30 Revised: 2008-03-22 Abstract The liver diseases remain major causes of death all over the world. Although orthotopic liver transplantation is an effective treatment f o r e n d-s t a g e l i v e r d i s e a s e s. H o w e v e r, shortage of healthy livers for transplantation worldwide have urgently limited the use of liver transplantation for acute and chronic liver diseases. Stem cells play an important role in the concert of liver regeneration. Hepatic stem cells have been shown experimentally to participate in liver proliferation. Furthermore, it has been postulated that hepatic stem cells are able to transdifferentiate into both hepatocytes and bole duct cells. These data indicate a possible role and therapeutic potential of hepatic stem cells in liver diseases. In this paper, we reviewed the application of stem cells in liver diseases. Key Words: Hepatic stem cells; Liver injury; Liver disease Yao P, Li SY. Advance in hepatic stem cells and liver injury. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(15): 1655-1660 摘要 肝脏疾病是影响人类健康的严重疾病, 目前尚没有令人满意的治疗措施, 肝移植技术由于供体的数量、昂贵的价格等因素使其应用受到限制. 近年来, 越来越多的研究对干细胞进行了探索, 研究表明, 肝干细胞在一定条件下可以分化为肝实质细胞, 并在肝损伤修复中起重要作用, 本文就干细胞在肝脏疾病中的应用研究作一综述. 关键词: 肝干细胞; 肝脏损伤; 肝脏疾病 姚鹏, 李绍祥. 肝干细胞与肝损伤的研究进展. 世界华人消化杂志 2008; 16(15): 1655-1660 https://www.wendangku.net/doc/6612788550.html,/1009-3079/16/1655.asp 0 引言 肝功能严重衰竭, 目前还没有特效的治疗措施, 尽管肝移植为肝衰竭患者提供了有效的治疗方法, 但是由于其费用高昂, 供体肝源有限, 从而使肝移植的广泛应用受到了限制. 最近几年关于肝再生机制和干细胞的可塑性研究发现, 在严重肝损伤的动物模型实验、供受者性别不同的人类肝移植、骨髓移植等研究中证实, 干细胞向肝细胞转化和参与了肝脏功能重建, 体外诱导分化研究也证实, 干细胞具有向肝细胞转化的潜能[1], 最近也有人在人体治疗实验中发现骨髓干细胞参与肝脏再生[2], 这些结果均提示干细胞可能在肝脏结构与功能重建中发挥治疗作用. 1 肝干细胞与肝 1.1 肝干细胞的定义干细胞是指具有无限或可被延长自我修复能力的细胞, 按分化能力而言分为: 原始干细胞, 具有多种分化能力[3], 可以自我更新, 并参与有机体的一生组织修复; 前体细胞, 存在于有机体某一组织器官内, 仅向有限的几种组织细胞分化; 成熟组织中的分化细胞, 不能自我修复, 不具有分化能力. 肝干细胞属于前体细胞, 来源于肝脏Herring(汇管区和终末小胆管的连接部分)狭隙和肝内胆管[4-5], 具有双向分化潜能, 能够分化为肝实质细胞和胆管上皮细胞[6-8]. 这种细胞具有特殊的形态特征: 形态较小、核质比率高, 具有卵圆形细胞核, 故又称卵圆细胞[9]. https://www.wendangku.net/doc/6612788550.html, ? ■背景资料 肝功能严重衰竭, 目前还没有特效 的治疗措施, 肝移 植技术由于供体 的数量、昂贵的 价格等因素使其 应用受到限制, 最 近的研究发现干 细胞可能在肝脏 结构与功能重建 中发挥治疗作用. ■同行评议者 许戈良, 教授, 安 徽省立医院肝胆 外科; 陈光, 教授, 吉林大学第一医 院消化器官外科
肝脏中糖类、脂肪和蛋白质的代谢情况
肝脏中糖类、脂肪和蛋白质的代谢情况 一、肝脏在糖代谢中的作用 肝脏是调节血糖浓度的主要器官。当饭后血糖浓度升高时，肝脏利用血糖合成糖原(肝糖原约占肝重的5%)。过多的糖则可在肝脏转变为脂肪以及加速磷酸戊糖循环等，从而降低血糖，维持血糖浓度的恒定。相反，当血糖浓度降低时，肝糖原分解及糖异生作用加强，生成葡萄糖送入血中，调节血糖浓度，使之不致过低。因此，严重肝病时，易出现空腹血糖降低，主要由于肝糖原贮存减少以及糖异生作用障碍的缘故。临床上，可通过耐量试验(主要是半乳糖耐量试验)及测定血中乳酸含量来观察肝脏糖原生成及糖异生是否正常。 肝脏和脂肪组织是人体内糖转变成脂肪的两个主要场所。肝脏内糖氧化分解主要不是供给肝脏能量，而是由糖转变为脂肪的重要途径。所合成脂肪不在肝内贮存，而是与肝细胞内磷脂、胆固醇及蛋白质等形成脂蛋白，并以脂蛋白形式送入血中，送到其它组织中利用或贮存。 肝脏也是糖异生的主要器官，可将甘油、乳糖及生糖氨基酸等转化为葡萄糖或糖原。在剧烈运动及饥饿时尤为显著，肝脏还能将果糖及半乳糖转化为葡萄糖，亦可作为血糖的补充来源。 糖在肝脏内的生理功能主要是保证肝细胞内核酸和蛋白质代谢，促进肝细胞的再生及肝功能的恢复。(1)通过磷酸戊糖循环生成磷酸戊糖，用于RNA的合成； (2)加强糖原生成作用，从而减弱糖异生作用，避免氨基酸的过多消耗，保证有足够的氨基酸用于合成蛋白质或其它含氮生理活性物质。 肝细胞中葡萄糖经磷酸戊糖通路，还为脂肪酸及胆固醇合成提供所必需的NADPH。通过糖醛酸代谢生成UDP?葡萄糖醛酸，参与肝脏生物转化作用。 二、肝脏在脂类代谢中的作用 肝脏在脂类的消化、吸收、分解、合成及运输等代谢过程中均起重要作用。 肝脏能分泌胆汁，其中的胆汁酸盐是胆固醇在肝脏的转化产物，能乳化脂类、可促进脂类的消化和吸收。 肝脏是氧化分解脂肪酸的主要场所，也是人体内生成酮体的主要场所。肝脏中活跃的β-氧化过程，释放出较多能量，以供肝脏自身需要。生成的酮体不能在肝脏氧化利用，而经血液运输到其它组织(心、肾、骨骼肌等)氧化利用，作为这些组织的良好的供能原料。 肝脏也是合成脂肪酸和脂肪的主要场所，还是人体中合成胆固醇最旺盛的器官。肝脏合成的胆固醇占全身合成胆固醇总量的80%以上，是血浆胆固醇的主要来源。此外，肝脏还合成并分泌卵磷脂?胆固醇酰基转移酶(LCAT)，促使胆固醇酯化。当肝脏严重损伤时，不仅胆固醇合成减少，血浆胆固醇酯的降低往往出现更早和更明显。 肝脏还是合成磷脂的重要器官。肝内磷脂的合成与甘油三酯的合成及转运有密切关系。磷脂合成障碍将会导致甘油三酯在肝内堆积，形成脂肪肝(fatty liver)。其原因一方面由于磷脂合成障碍，导致前β?脂蛋白合成障碍，使肝内脂肪不能顺利运出；另一方面是肝内脂肪合成增加。卵磷脂与脂肪生物合成有密切关系。卵磷脂合成过程的中间产物——甘油二酯有两条去路：即合成磷脂和合成脂肪，当磷脂合成障碍时，甘油二酯生成甘油三酯明显增多。
蛋白质组学期末复习题
蛋白质组学相关试题及答案 解释 1． Proteome(蛋白质组)：由一个细胞或者组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质，称为蛋白质组。 2. Proteomics(蛋白质组学)：指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴学科，即研究细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定。更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能. 3. Mass Spectrometer（质谱仪）：质谱仪是一个用来测量单个分子质量的仪器，但实际上质谱仪提供的是分子的质量与电荷比（m/z or m/e）。分离和检测不同同位素的仪器。即根据带电粒子在电磁场中能够偏转的原理，按物质原子、分子或分子碎片的质量差异进行分离和检测物质组成的一类仪器。质谱仪最重要的应用是分离同位素并测定它们的原子质量及相对丰度。 4. Proteome sample holographic preparation（蛋白组样品的全息制备）：（1）keep protein information （2）adapted to separation and identification methods （3）different samples,different extraction. 蛋白质样品制备是蛋白质组研究的第一步，也是最关键的一步。因为这一步会影响蛋白质产量、生物学活性、结构完整性。因此要用最小的力量使细胞达到最大破坏程度同时保持蛋白质的完整性。原则是，保持蛋白质的所有信息；选择合适的分离和鉴定方法；对于不同的样品要用不同的提取方法。 5. Post translational modification(蛋白质翻译后修饰) 肽链合成的结束，并不一定意味着具有正常生理功能的蛋白质分子已经生成。已知很多蛋白质在肽链合成后还需经过一定的加工（processing）或修饰，由几条肽链构成的蛋白质和带有辅基的蛋白质，其各个亚单位必须互相聚合才能成为完整的蛋白质分子。 6. De novo sequencing(从头测序) 从头测序为蛋白质组研究提供了一种不用借助于任何蛋白质序列数据库信息，直接解读串联质谱数据的方法。其基本算法主要由4个部分组成：质谱图的构建、