发酵肉制品中降胆固醇乳酸菌的分离及鉴定
Ｎｏ．８．２００７
在肉制品发酵中，乳酸菌起到至关重要的作用。但并不是所有的乳酸菌都适合作为肉制品的发酵剂。通过对发酵肉制品中乳酸菌的分离、筛选和鉴定的研究，应用于肉制品的生产中，将克服传统肉制品发酵启动慢、发酵时间长的缺点，使肉制品生产发酵时间大大缩短，降低发酵肉制品生产的成本，并改善发酵肉制品感观品质等，使发酵菌种具有产品加工快速、安全和标准化的特点［１］。
然而肉制品中胆固醇含量较高，人们摄入较高的胆固醇会严重影响人类的健康。近年来，国内外
微生态学家发现乳酸菌与胆固醇的降解有一定的关系，大量的体内外研究也证实了某些乳酸菌具有降低血清胆固醇含量的功效［２－４］。本文将从发酵肉制品中分离的４株乳酸菌接种于体外含高胆固醇的培养基中，研究各菌对胆固醇的降解情况，从而选出具有降胆固醇作用的菌株，经鉴定为植物乳杆菌，为开发低胆固醇的发酵肉制品奠定了基础。
１材料和方法１．１
试验材料
发酵肉制品中降胆固醇乳酸菌的
分离及鉴定
于长青，张丽娜
（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆１６３３１９）
摘要：以传统发酵肉制品为原料，通过ＭＲＳ培养基分离、纯化得到１００余株乳酸菌。经筛选得到符合发酵肉制品生产要求的乳酸菌４株，又从中筛选出１株具有降低胆固醇作用的植物乳杆菌，其降胆固醇能力达到２４．６％，可将其作为发酵剂应用于低胆固醇类的发酵肉制品中。关键词：发酵肉制品；降胆固醇；植物乳杆菌中图分类号：ＴＳ２５１；ＴＳ２０１．３
文献标识码：Ａ
文章编号：１００５－９９８９（２００７）０８－００４５－０４
收稿日期：２００７－０１－１８
基金项目：黑龙江省科技厅攻关项目（ＧＢ０４Ｂ４０４－０４）；大庆市科技局攻关项目。
作者简介：于长青（１９６９－），男，副教授，博士研究生，主要从事畜产品加工和功能性食品的研究与开发工作。
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｒｏｍ
ｆｅｒｍｅｎｔｅｄｍｅａｔｐｒｏｄｕｃｔｓ
ＹＵＣｈａｎｇ－ｑｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＬｉ－ｎａ
（ＦｏｏｄｓｔｕｆｆＣｏｌｌｅｇｅ，ＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＡｕｇｕｓｔＦｉｒｓｔＬａｎｄＲｅｃｌａｍａｔｉｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｑｉｎｇ１６３３１９）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｍｏｒｅｔｈａｎ１００ｓｔｒａｉｎｓｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｆｒｏｍｆｅｒｍｅｎｔｅｄｍｅａｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＭＲＳｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ．４ｓｔｒａｉｎｓｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｗｈｉｃｈｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｉｎｍｅａｔｆｅｒ－ｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｆｉｎａｌｌｙ，１ｓｔｒａｉｎｓｏｆｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇｉｓｓｃｒｅｅｎｅｄ，ｗｈｉｃｈｈａｓｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｄｅｇｒａｄ－ｉｎｇ．Ｉｔｓｆａｃｕｌｔｙｏｆｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇｉｓ２４．６％，ｉｔｉｓｕｓｅｄａｓｓｔａｒｔｅｒｃｕｌｔｕｒｅｉｎｍｅａｔｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｆｅｒｍｅｎｔｅｄｍｅａｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ；ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
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１．１．１分离样品腊肠、腊肉、自然风干香肠：黑龙江八一农垦大学食品学院畜产品加工研究室。１．１．２
培养基
ＭＲＳ培养基：蛋白胨ｌ０ｇ，牛肉膏ｌ０ｇ，
酵母提取物５ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４２ｇ，柠檬酸二铵２ｇ，乙酸钠
５ｇ，葡萄糖２０ｇ，吐温８０ｌｍＬ，ＭｇＳＯ４?７Ｈ２Ｏ０．５ｇ，ＭｎＳＯ４０．２５ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ值６．２～６．４，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ。固体培养基在液体培养基的基础上添加
１．８％的琼脂。
耐盐性试验培养基：ＭＲＳ液体培养基分别添加
２％、４％和６％的ＮａＣｌ。
耐硝性试验培养基：ＭＲＳ液体培养基分别添加
５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇＮａＮＯ２。
产黏液培养基［５］：ＭＲＳ同体培养基，以５％的蔗糖代替葡萄糖。
抑菌试验培养基：ＬＢ培养基：胰蛋白胨１０ｇ，酵母提取物５ｇ，ＮａＣｌ５ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ值７．０。
高胆固醇ＭＲＳＯ－ＣＨＯＬ培养基：以１０００ｍＬ的液体培养基计，含１．０ｍｇ／ｍＬ胆固醇胶束溶液制备［６－８］：准确称量胆固醇０．１ｇ放入小烧杯中，加入０．２ｇ牛胆盐、
０．１ｇ蔗糖酯、１ｍＬ吐温８０搅拌均匀，再移取５ｍＬ的冰乙酸加热溶解，把溶解液用超声波处理１５ｍｉｎ后，快速加入到配制好的液体培养基中，边加入边搅拌，使其形成均匀稳定的胶体溶液。
１．１．３乳酸纸层析试剂展开剂：水、苯甲醇、正丁
醇以１：５：５的量相混合，然后加１％的甲酸。显色剂：０．０４％的溴酚蓝酒精溶液，用０．ｌｍｏｌ／ＬＮａＯＨ调节ｐＨ到６．７０。１．１．４
主要仪器设备
ＸＳＰ－２ＣＡ型电子显微镜：上海
光学仪器一厂；ＤＲＰ－９０８２型电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司；ＢＣＮ－１３６０净化工作台、
ＨＥＱ－Ｄ型恒温振荡器：哈尔滨东联电子技术开发有限公司；Ｔ６新世纪型紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；ＹＸＱ－ＳＧ４６－２８０Ａ手提式压力蒸气消毒器：上海生银医疗仪器仪表有限公司。
１．２试验方法
１．２．１
乳酸菌分离纯化
取２０ｇ样品于１８０ｇ无菌蛋白
胨水（蛋白胨１ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ０．８５ｇ／Ｌ、吐温８０ｌｍＬ／Ｌ）振荡混匀，系列稀释，取上清液以ＭＲＳ＋３％ＣａＣＯ３做培养基倾倒平板，挑取产生溶钙圈的单菌落，划线分离纯化，纯菌进行革兰染色，选取革兰阳性和触酶阴性菌，用ＭＲＳ固体斜面培养基４℃保存。
１．２．２主要发酵特性试验［９］１．２．２．１产黏性试验采用产黏液培养基接种，３０℃培养２４ｈ，用接种针挑取菌落直接观察。
１．２．２．２
耐盐性试验
将分离的菌种接种到耐盐性试
验培养基中，３０℃培养２４ｈ，用分光光度计６５０ｎｍ测定
ＯＤ值，以ＭＲＳ培养基作空白对照，比较其生长情况。１．２．２．３
耐硝酸盐性试验
将分离的菌种接种到耐硝
性试验培养基中，３０℃培养２４ｈ，６５０ｎｍ测定ＯＤ值，比较其生长情况，以ＭＲＳ培养基作空白对照。
１．２．２．４蛋白质降解活性试验在ＭＲＳ固体培养基中
添加１５％脱脂乳粉，并制成无菌平板，取等量
（０．１ｍＬ，１０８ｃｆｕ／ｍＬ）被分离菌株的菌悬液均匀涂布于平板表面，３０℃培养４８ｈ观察培养结果，若牛奶中酪蛋白被分解时，菌落周围会出现透明圈，即为阳性，否则为阴性。
１．２．２．５脂肪分解活性试验在ＭＲＳ固体培养基中添
加１５％的猪油和中性红指示剂，制成无菌平板，取等量（０．１ｍＬ，１０８ｃｆｕ／ｍＬ）被分离菌株的菌悬液于平板表面涂布均匀，３０℃培养４８ｈ观察，若该菌株能分解脂肪产生脂肪酸，则在平板上出现红色透明斑点，即为阳性，否则为阴性。
１．２．２．６抑菌试验２０ｍＬ不加乙酸钠的ＭＲＳ固体培养
基融化后冷却到４５℃，与指示菌（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）新鲜培养物１００μＬ混匀后倒平板，凝固后用直径为７ｍｍ的无菌打孔器在平板上打孔，准确量取
４０μＬ的乳酸菌培养液加入小孔中，平板置于４℃冰箱扩散，然后放置３０℃恒温培养２４ｈ，观察小孔周围抑菌圈。
１．２．２．７乳酸纸层析试验取大小合适滤纸条，在距
底边３ｃｍ处划一条线，用干净的毛细玻璃管蘸取少量样液，每隔２～２．５ｃｍ点一个样（其中包括２％乳酸、空白培养液和含菌培养液样），每点一次样立即用电吹风吹干。将纸放入层析缸内，用展开剂使饱和一段时间，再添加展开剂并开始层析。一般上行２５ｃｍ即可，取出晾干或用电吹风吹干，喷显色剂，观察样品上是否出现黄色斑点，并与２％乳酸样比较，并计算
Ｒｆ值，以确定细菌培养液是否含有乳酸。１．２．３降胆固醇能力测试试验
１．２．３．１
培养液基质中胆固醇的测定方法［１０］
胆固
醇标准曲线的绘制：准确称取胆固醇１００．０ｍｇ，溶于无水乙醇中，并稀释至１００ｍＬ，再准确移取胆固醇溶液ｌ０ｍＬ，加入无水乙醇稀释至１００ｍＬ，充分混匀后的溶液即为胆固醇标准液。吸取胆固醇标准液０、
０．２ｍＬ、０．４ｍＬ、０．６ｍＬ、０．８ｍＬ、１．０ｍＬ、１．２ｍＬ，置于２５ｍＬ带塞比色管中。在各管中加入无水乙醇使总体积达２ｍＬ，再加入２ｍＬ硫酸铁铵显色剂，加入时要沿管壁缓慢加入，使两液间保持明显界面。加完以后再充分振摇混匀，促进呈色。将各管放置１０ｍｉｎ，待管内反应液冷却至室温，在３０￣６０ｍｉｎ内，于分光
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１．１ＭＲＳ
１．２ＭＲＳ
２．１ＭＲＳ
２．２ＭＲＳ
胆固醇降解率（％）图２不同乳酸菌菌株对胆固醇降解率
０．１０．２０．３０．４０．５
０．６０．７０．８０．５
１
１．５
００
ＯＤ值
图１胆固醇标准曲线
光度计５６０ｎｍ波长读取各管吸光度值，并绘制标准曲线。
取培养液０．２ｍＬ，放于离心试管中，向试管内加入无水乙醇４．８ｍＬ。置室温内１０ｍｉｎ后，以每３０００ｒ／
ｍｉｎ离心沉淀５ｍｉｎ。另取干净试管，用移液枪准确移取上清液２ｍＬ，再加入２ｍＬ硫酸铁铵显色剂溶液，立即摇匀后，冷却到室温，在３０￣６０ｍｉｎ内，于分光光度计５６０ｎｍ波长测定吸光度值。按测得的值，从标准曲线查得相应的胆固醇含量。
１．２．３．２不同菌种的胆固醇降解筛选试验方法［１１］
将同种属的供试菌活化扩大培养后，各转入５支液体试管培养基中，适宜温度培养４８ｈ后，采用平板计数法测各管的菌体细胞数。取相同的细胞数量级的液体管中菌种，按３％接种量接入到同时制备的含相同胆固醇胶束浓度的选择培养基中，在适宜的温度下厌氧培养一定时间后，再定性和定量地测定胆固醇含量，并与不接种空白组对照，比较各菌种的胆固醇降解率，进而选育出胆固醇降解能力强的菌株。
胆固醇降低率按照以下公式计算：胆固醇降低率（％）＝（Ｃ对照－Ｃｔ）／Ｃ对照×１００
式中：Ｃ对照──未接种乳酸菌的培养基中胆固醇
浓度；
Ｃｔ──培养ｔ时间后胆固醇浓度。
１．２．４菌种鉴定１．２．４．１
形态特征鉴定
（１）菌落形态：观察分离培养
基平板上菌落的形态（形状、色泽、大小等），并记录结果；（２）菌株形态：将所分离的菌株进行革兰染色，于１００倍油镜下观察菌体形态（大小、形态等），并记录观察结果［１２］。
１．２．４．２生理生化特征鉴定（１）菌株的特性生理特征
试验；（２）各种碳源发酵情况：通过菌株的糖醇发酵试验，来检验菌株对各种糖醇类碳源的利用情况，并记录结果。
２结果与分析
２．１
筛选菌株的主要发酵特性
筛选肉制品优良发酵菌株，应根据菌种的发酵
特性，结合产品特点对菌株进行筛选。根据肉制品发酵的基本要求，所筛选的菌株必须具备以下条件
［１３－１４］
：对食盐、亚硝酸盐具有良好的耐受性，在６％
食盐中能快速生长，在８０￣１５０ｍｇ／ｋｇ亚硝酸盐条件下能生长良好；对蛋白质、脂肪无明显、直接的分解作用；在５７￣７０℃范围内能灭活；无致病性。对１００余株分离株进行筛选菌株指标的测试后，得到４株发酵适应性和发酵特性优良的乳酸菌株。发酵特性见表１。
２．３胆固醇标准曲线
以胆固醇浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘
制标准曲线，见图１。标准曲线回归方程为ｙ＝０．６４３ｘ－
０．０２２７，Ｒ２＝０．９９７２。
从试验结果可以看出，此法测定结果呈现了较好的线性关系，用此种方法测定菌液胆固醇含量的变化是切实可行的。
２．４不同菌种的胆固醇降解率
对于供试的４株乳酸菌，以相同的３％接种量（菌
体浓度为１０８ｃｆｕ／ｍＬ）接种于液体ＭＲＳＯ－ＣＨＯＬ培养基中，３７℃恒温厌氧培养７２ｈ后，测得的胆固醇降解率
表１筛选的乳酸菌菌体形态和主要发酵特性
菌株特性１．１ＭＲＳ
１．２ＭＲＳ
２．１ＭＲＳ
２．２ＭＲＳ
来源风干肠腊肉
腊肠
腊肠
菌体形态短杆，Ｇ＋，成对出现
球，四联或成对排列Ｇ＋细短杆，Ｇ＋
球，四联或成对排列Ｇ＋产黏性－－－－耐盐性（６％）＋＋＋＋耐硝酸盐性
（１５０ｍｇ／ｋｇ）
＋＋＋＋蛋白质降解－－－－脂肪分解－－－－致死温度
（℃）
６０５５６５５５抑菌（大肠
杆菌）
＋
＋
＋
＋
表２
乳酸与发酵液纸层析的Ｒｆ值
层析样乳酸１．１ＭＲＳ１．２ＭＲＳ２．１ＭＲＳ２．２ＭＲＳＲｆ值０．６３８
０．６３６
０．６３６
０．６３６
０．６４０
胆固醇浓度（ｍｇ／ｍＬ）
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的平均值（结果如图２），可直接表明乳酸菌降解胆固醇的能力和程度。
从图２的结果显示，供试的乳酸菌菌株可有效降解培养基中的胆固醇，其降解率最高在７２ｈ，达
２４．６％。其中１．１ＭＲＳ降胆固醇能力最强。从图２可直观看出４种菌株中降胆固醇从高到低依次是１．１ＭＲＳ＞
２．１ＭＲＳ＞１．２ＭＲＳ＞２．２ＭＲＳ。２．５菌种鉴定
２．５．１
表形特性固体培养特性：３０℃培养２４ｈ，在
ＭＲＳ＋３％ＣａＣＯ３固体培养基上形成明显的透明圈，表面光滑湿润。液体培养特性：经过２４ｈ培养，细菌达到最大浑浊度后，菌体逐渐沉淀到培养基底部。
２．５．２菌株形态将１．１ＭＲＳ进行革兰染色，于１００倍油镜下观察菌体形态，见图３。
２．５．３
具体特征
根据１．１ＭＲＳ表型特征和生理生化
特征，参考《常见细菌系统鉴定手册》，鉴定１．１ＭＲＳ为植物乳杆菌，具体特征见表３。
３结论
３．１
从自然发酵的肉制品中分离、纯化得到１００余株
乳酸菌，通过测定它们的主要发酵特性，筛选得到符合发酵肉制品生产要求的乳酸菌４株。
３．２把筛选得到的４株乳酸菌接种于体外含高胆固醇
的培养基中，研究各菌对胆固醇的降解情况，从而选出了一株降胆固醇达２４．６％的菌株，经鉴定为植物乳杆菌。
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表３
１．１ＭＲＳ的具体特征
图３１．１ＭＲＳ镜检图
鉴定管１．１ＭＲＳ鉴定管１．１ＭＲＳ七叶苷＋纤维二糖＋蔗糖＋甘露糖－松三糖－鼠李糖＋半乳糖＋阿拉伯糖＋蜜二糖＋果糖＋乳糖＋甘露糖－木糖＋麦芽糖＋棉籽糖山梨醇
±－
山梨醇葡萄糖酸盐
＋＋
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