细胞培养
细胞培养基本操作
一，清洗和消毒
胶塞的清洗
新老胶塞的清洗
1.2%NaOH 煮沸10-20分钟
2.用水冲洗后，用1%HCl 浸泡30分钟。
3.自来水冲洗，蒸馏水洗2-3次
4.一般冲洗：用洗衣粉清洗，自来水冲10遍，再用蒸馏水冲3遍。
塑料器皿的清洗
1.2%NaOH浸泡
2.用1%HCl 浸泡30分钟
3.自来水冲10遍，再用蒸馏水冲3遍
玻璃器皿的清洗
1.用试管刷和洗衣粉刷干净瓶子，用自来水冲10遍，确保将洗衣粉冲干净。
2.凉干后浸泡进酸缸，时间不得少于6小时。
3.捞酸后，用自来水冲10遍，再用蒸馏水冲3遍，烤干。
手术器械的清洗
1.实验完成后，洗衣粉将其清洗一遍，凉干。
2.使用之前高温消毒或用75%的酒精浸泡。
高压锅的使用
培养基DMEM，胰酶的配制
DMEM的配制：
胰酶的配制：
抗生素的配制：
1.青霉素（80万单位/瓶）+无菌双蒸馏水2ml
2.链霉素（100万单位/瓶+无菌双蒸馏水2ml
将上述2ml的青霉素和2ml的链霉素混合在加入36ml的双蒸馏水配制成储备液。混匀，分装，-20O C 保存。
使用时，配制成0.5ml青-链霉素储备液/100ml培养基
3.庆大霉素8万单位/支×2支2ml/支×=4ml，加入无菌的双蒸馏水36ml配制成储备液。
-20O C保存，使用时，100ml培养基加1滴，终浓度为0.5-1ml/100ml培养基。
二，细胞培养
细胞株的传代培养法
1.吸去原来培养瓶中的培养基
2.PBS轻轻冲洗一遍，吸去。
3.用0.025%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化细胞，见细胞收缩后，吸去胰蛋白酶，
加入新的培养基终止消化
4.用吸管小心地吸取培养基反复吹打，分装在每一个培养瓶中。
内皮细胞原代培养方法：
1.在动物的颈动脉放血处死，无菌条件下分离主动脉；
2.清除动脉外壁的筋膜和脂肪，用PPS冲洗两次，沿正中剪开，内膜朝下切于已经滴
加少量0.1%胰酶和0.02%EDTA的培养皿中，20消化10min。用细胞挂子轻轻刮取内膜上的内皮细胞，置入加有RPMI-1460培养液（含20%小牛血清，2×105U/L青霉素和200mg/L链霉素）的培养瓶中。
3.置于培养箱内培养，约4-5天保长满整瓶，即进行传代。
细胞解冻方法
1、先准备37-39度温水；
2、从液氮罐中取出细胞，迅速放进水中，振摇至复温。
3、用吸管吸进培养瓶中，加进培养基，6小时后可换液，24小时可传代。
细胞冻存方法
1、选对数生长期的细胞，在收集细胞的24小时前换液一次；
2、吸除旧的培养液，消化，再加入旧的培养液终止消化；
3、合并细胞于一只试管中，用塞子塞好，离心2分钟，去掉上清液；
4、在细胞中加入90%血清（约18滴）和10%DMSO（约2滴），或用50%的血清，40%的
培养基，10%的DMSO；
5、放入冻存管中，与40C（10分钟）——-200C（2小时）——-40 0C（2小时）；
6、最后放入液氮罐中，登记。
细胞转染步骤
1、转染前24小时细胞快速传代，将细胞传至24孔板中，细胞数为1~3╳105/孔，24小时
后长至90%以上；
2、取0.8~1.0μg DNA到无血清/抗生素的F12/DMEM中，总体积50μl；
3、取1~3μLF到无血清/抗生素的F12/DMEM中，总体积50μl（混合5分钟，不要延长时
间）；
4、1和2混合，室温放置20分钟；
5、放置的最后的3分钟，吸去24孔板的培养基，用PB洗一遍，加入500μl不含血清和
抗生素的F12/DMEM；
6、将4加入到转染的24孔板中；
7、370C 5%CO2 温育6小时，弃去原培养基，加入新鲜的培养基；
8、恢复24—48小时后加抗生素进行筛选。注（2、3、4要用进口）
Fura-2操作步骤
一、细胞部分
1、用胰酶消化细胞，加入2ml原液终止消化；
2、负载：加10%BSA 20μl和2μl Fura –2
3、孵育25分钟，每隔8分钟吹一次；
4、50离心1分钟，控干液体，加入2ml测定液HBSS；
二、上机操作部分
1、POWER，开Xe lamp；
2、待屏幕出现READY，CHANGE +[10]↙+[1] ↙+[1] ↙
3、START/STOP（先后各一次即可）；
4、待屏幕出现READY，再一次CHANGE +[10]↙+[1] ↙+[2] ↙
5、出现READY后，按PAGE调Y轴基线至-3.39，调至8，调至128
6、按STRAT
三、存盘操作
1、DATA PROC +[2]；
2、将当前屏幕中文文件存入23号文件，输入23↙
3、DISK OPER+[1] ↙+[1] ↙
4、[1]=21↙[2]=（磁盘自编文件号）↙
5、重复3，操作[1]=22↙[2]=（磁盘自编文件号）↙
6、重复3，操作[1]=23或24↙[2]=（磁盘自编文件号）↙
7、DATA PROC +[4] ↙+ 23↙
四、调出文件操作
1、DISK OPER + [1] ↙+[2] ↙
2、[1]=（原22号文件）↙，[2]=（存入内存的空文件）；
3、DISK OPER + [1] ↙+[2] ↙
4、[1]=（原23号文件）↙，[2]=（存入内存的另一个空文件）；
基因转染技术
基因转染的概念
将目的基因导入体细胞，使其在细胞中得到表达，并产生相应功能的技术。基因转染的种类
磷酸钙法电击法脂质体法显微注射法逆转录病毒介导法其他稳定表达转染瞬时表达转染
基因转染的步骤
1.目的基因（DNA）的准备
包括环状的质粒DNA或片段DNA的制备
要求：纯度高，1.8 2.目的基因导入细胞（脂质体转染法为例） 例A：DOTAP脂质体转染法 1，取将要转染的DNA2.5μg，用无血清、无抗生素的DMEM/E12培养基稀释成50UL。 2，取70UL F12于聚苯乙烯管（即冻存管），加进30UL的DOTAP小心吹吸混合，室温静置1-2min。 3，将1加入，与2小心吹吸混合，室温静置15min。 4，弃去原细胞培养液，小心加入5ml F12培养基（含10%新生牛血清和相应浓度的抗生素），将3均匀加入，轻轻晃匀。 5，继续培养6小时，吸去旧培养液，加入新培养液（含10%新生牛血清和相应浓度的抗生素）。 6，恢复生长2天后，加入G418进行筛选培养，保持每2-4天换一次培养液。 7，约1-2周后可以见到具有G418抗性的细胞克隆。继续培养，当细胞克隆生长到1/4-1/2低倍视野时，挑取数个克隆，转入其他培养瓶继续作G814维持培 养。 例B：Superfect脂质体转染法 1，取2μg DNA，用无血清、无抗生素DMEM-F12稀释到100μl。 2，取10μl superfect到上述混合液中，轻轻吹吸5-6次，混匀。 3，室温放置5-10min。 4，放置的最后3min，吸去原有的培养基，用PBS洗一遍。 5，加入600μl DMEM-F12（含10%新生牛血清和相应浓度的抗生素）到上述转染混合液中，轻轻吹吸3-4次，混匀。 6，将上述混合液加入到3.5cm直径的平皿中。 7，37℃5%CO2温育2-3小时，弃去原培养基，用PBS洗3-4次，加入新鲜的培养基（含10%新生牛血清和相应浓度的抗生素）。 8，恢复生长2天后，加入G418进行筛选培养：保持2-4天换一次培养液。 9，约1-2周后可以见到具有G418抗性的细胞克隆。继续培养，当细胞克隆生长到1/4-1/2低倍视野时，挑去数个细胞克隆，转入其他培养瓶继续作G418维持培养。！！！注意 1，高纯度目的基因的制备，质粒可用QIAGEN公司的去内毒素质粒大量提取Kit， 片段可用QIAGEN公司的片段DNA回收Kit或让上海生工公司合成。 2，转染前细胞要快速连续传代（两次以上），末次传代后20-24小时进行转染，此时细胞融合度应为30-50%（生长迅速的细胞）或70-80%（生长缓慢的细胞）。 3，盛放和吸取脂质体的塑料用品都要用进口的聚苯乙烯材料。防止转染时器皿吸附脂质体。 4，用完脂质体后，要将瓶口封紧，否则会氧化失效。 5，脂质体和DNA混合时，绝对不能有蛋白质存在。 6，血清最好选用进口的胎牛血清，如Hyclone和Gibco BRL公司。也可选用杭州四季清公司的胎牛血清或新生牛血清。 7，G418筛选期间，应注意换掖，保持每2-4天换一次培养液。 8，G418筛选和维持的剂量应在转染前做预实验确定。一般来说，维持剂量应为10-14天内正好能杀死全部细胞的剂量，而筛选剂量则应是该剂量的1倍左右。 9，细胞克隆的挑取，可用有限稀释法或克隆环法。 10，瞬时表达转染，在转染恢复生长24-72小时后，不做筛选，之间进行检测实验。 免疫印迹 原理 将蛋白质抗原样品变性，SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳后，转印到膜上，利用抗原与抗体结合的特异性，与相应的一抗孵育，用二抗放大一抗检测到的信号，并显示检测信号，从而判断膜上有无待测的蛋白质抗原的存在及量的多少。同时应用蛋白质分子量Marker，还可以判断待测定蛋白质抗原的分子量。 试剂和材料 1.SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳试剂（略） 2.2×上样缓冲液（100mmol/L Tris-Cl; 200mmol/L DTT; 4% SDS; 0.2% 溴酚蓝；20%甘油）， β-巯基乙醇。 3.电转缓冲液（Tris 3.03g; 甘氨酸1 4.4g，200ml甲醇/1000ml） 4.PBS（130.0mmol/L NaCl，2.5mmol/L KCl，10.0mmol/L Na2HPO4，1.5mmol/L KH2PO4， pH7.4） 5.1%和5%的脱脂奶粉（PBS）溶液（w/v） 6.PBST（含5%o Tween20的PBS，v/v） 7.生物素标记的蛋白质分子量Marker，一抗，二抗，化学发光试剂kit 8.硝酸纤维素膜，Whatman 3M滤纸 仪器 电泳仪、小型垂直电泳槽和转移槽（BIO-RAD公司，USA） 操作步骤 1.配制电泳分离胶和浓缩胶（SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳）。 2.取一定量的蛋白质样品，与等体积的2×上样缓冲液混合，另取3μl生物素标记的蛋白 质分子量Marker与等体积的2×上样缓冲液混合。 3.各管混合液加入5%-10%的β-巯基乙醇，煮沸变性5min。 4.上样。 5.电泳：浓缩胶中/电压120V，电泳15min，分离胶/电压200V电泳30-40min。 6.卸下分离胶，用电转BUFFER，平衡洗3次每次10min 7.将PVDF膜 配制胶分离胶与积层配方： 成分：10%分离胶（10ml）8%分离胶（10ml）5%积层胶（5ml） 去离子水（ml） 4 4.6 3.4 30%丙烯酰胺溶液 3.3 2.7 0.83 1.5mol/LTris (ph8.8) 2.5 2.5 1.0mol/LTris(ph6.8) 0.63 10%SDS 0.1 0.1 0.05 10%过硫酸铵0.1 0.1 0.05 TEMED 0.004 0.006 0.005 注意：先配分离胶，加至齿线下1cm，上层加DW封闭，画线标记，放置30min(气温低可置37℃30min)；再配积层胶。待分离胶凝固后，倒弃上层水，加积层胶，放梳子，固定20 min(气温低可置37℃20min)，取出梳子，用DW洗涤未聚合的胶，用滤纸吸干（要使齿尽量放下，然后相互狸漏出，灌胶时应将分离胶灌上一些，以免梳子与分离胶相隔太远）。 加样 计算蛋白浓度 eg: pro量/pro 浓度=体积（取最小值定蛋白量：0.74×18.8=蛋白量）样本号 1 2 3 空白 各样本蛋白浓度（ng/ul）0.92 0.86 0.74 0 所需各样本体积（ul ）17 18 18.8 0 需补悬浮buffer储存液 或去离子水体积（ul） 1.8 0.8 0 18.8 2-巯基乙醇（2—ME ul） 1.2 1.2 1.2 1.2 2×上样Buffer （ul ） 5 5 5 5 ↓ 振荡，离心（使集中与小EP管底部，事先用钟头给小EP管打孔） ↓置泡沫板上 100℃水浴10min ↓ 放冰上备用 ↓ 点样（每个样本体积相当于25ul,空间不能有间隔，量可调整） 电泳（在冰箱内进行） 跑积层胶：80v 30min ↓ 跑分离胶：120v 60min或60v 12h（过夜）使溴酚蓝到胶底，caveolin-1可以不↓ 转膜（注意正反，pro带负电，放在负极，膜正极） ↓100Ma从黑加到白，黑为“-”极，红为“+”极 取出胶，切去积层胶，在1样本处切一小口 ↓ 转到放有海棉和三层滤纸上，用转移buffer浸泡10min，有颜色的朝外，滤纸要比胶大↓（胶用DW洗） 将剪好的PVDF膜用甲醇泡10min，，用DW洗三次，盖在胶上（比胶稍小）↓ 用玻棒赶除气泡 ↓ 加盖三层与胶大小相等滤纸，注意：不能与下面的滤纸接触，以免短路 ↓ 加海棉与黑盖上（黑对黑） ↓ 放入电泳槽，在冰箱内转膜（4h） 膜染色 将膜取下，标记1道正面，用TBST洗2次，5min/次，回收转移buffer. ↓ 用2×丽春红染色（5min）[观察有无目的带出现，如需显示不同的物质，可将有条带的膜↓剪开，分别加一抗，二抗相同，可同时加] 用DW洗两次 ↓ 用TBST洗2次，5min /次 加抗体 2.5g 牛奶用50mlTBST溶解，5%封闭液，封闭2小时，放在摇床上摇 ↓ 用TBST配10m（l%）牛奶（0.1g→10 ml） 用1ml牛奶+（1：200）5ulAb（一抗）不能有气泡，4℃.12h(常温2h) ↓ 取出，用TBST洗三次，10min /次.一抗可回收，（摇动） ↓ l%牛奶1ml+二抗（根据底色从1：2000→1：1000摸索（常温抚育45min）（摇动）↓ 洗涤，用TBST洗4-5次，5min /次.（要求洗干净以免影响显影） 显影 加发光剂（A:B=1:1，共1ml） ↓ 压膜（看荧光）加胶片（强2-3’，弱则延长时间） ↓ 显影（3min ）有条带后停止（可多压几张） ↓ 定影，时间可长一些（10 min） ↓ 用自来水冲洗片子，回收膜，洗净在浮Ab 血管条实验 一、溶液：Kreb’s液 （1）预备液：Cacl2 2.5 mM 10ml/L,配成800ml 溶解后，搅拌后慢慢加入，通混合O2 ; （2）Kreb’s液:用HEPES 代替NaHCO3,不易产生沉淀，用纯O2通气。 Mmol/l 储备液/L 分子量 Kcl 4.6 3.43% 10 ml 74.55 MgSO4 .7H2O 1.16 2.86% 10 ml 246.46 Na2HPO4.2H2O 1.16 1.8% 10 ml 156.01 CaCl2 2.5 2.78% 10 ml 110.99 NaHCO3 21.9 1.84g 84.01 Glucose 11.0 2.18g 198.17 NaCl 115.0 6.72g 58.44 克分子浓度=溶质分子数/溶液体积（升） 溶质克分子数=溶质重量/溶质克分子数 溶质质量=克分子浓度×溶液体积×溶质分子量 例：glucose 分子量197.17克分子浓度11mmol/l=0.11M 溶质质量=0.011×1×198.7=2.18g 二、组织差异性： 1、A．V脉：Ca2+调控：肠系膜A：Ca2+泵活性A≧V；肠系膜V：膜结合力V≧A 2、N分布：小A神经丰富，适于NA研究，主A、V脉N分布少 3、受体：大隐静脉.a受体研究反应好。 三、制作 1、螺旋形条，45°切割，适用于管腔大血管 2、血管环 四、影响反应的因素 1、周围组织：影响药物渗透入组织，影响收缩力； 2、肌层损伤： 3、过度牵拉： 4、缺O2 ：预先通混合O2。30’ 5、内皮细胞：不研究内皮细胞功能，去除（用棉花轻） 鉴别：内皮细胞释放EDRF或NO，引起下降，用皂甙去除内皮，损伤小； 注：激动剂不能用KCl，因为高K引起去极化，释放EDRF减少，反应效果不好。 6、缓冲剂：HEPES使反应抑制。 7、PH：加药后溶器PH是否改变。 8、EGTA：无钙液用EGTA络合残余钙，EGTA引起膜去极化。除细胞外钙络合， 细胞膜外的Ca2+络合。Ca2+动态不平衡，耗竭Ca2+池内的钙。 如何避免：A减少EGTA的量；B缩短EGTA复盖时间，一般用50μM EGTA可以避免。 9、负荷：狗大隐3g,狗肠系膜5g,大鼠主A 1.5g 五，反应可重复性的测定 1、平衡120’,20-30’换一次溶液。 2、可重复性 两次反应高度差异<10%，可重复。或者实验后再做此实验验证。 凝胶成象系统操作使用说明 一、拍摄图像 1、打开电脑，单程序，选择A。A。B programs-1D Advanced,即可进入界面。 2、显示1-DAdvaced 窗口—→File—→Acquire 3、显示Acquire imge 窗口—→单击Acquire 4、显示AAB2.6NTSC（16）窗口—→显示图像，调整镜头上的光圈，放大倍数和 聚焦把图像调至最佳位置，并可调整菜单上的亮度，对比度，使图像更清晰—→单击OK 5、显示ScANNEDPC窗口，将调整后的图像重拍 （1）、将图像反白，image-imvert （2）调图像大小：image display—resige image—→显示Set ZOOM FACTOR窗口——→选Horizontal ZOOM FACTOR：004/vertical ZOOM factor:004｝—→OK （3）调背景：image—→单击correct background 和/或correct background vertical 6、贮存file—→save as —→显示save image file as 对话框—→选文件夹—→文件名—→文件类型（.pcx）—→驱动器（C：）—→确定 二、分析图像 双击桌面D Advanced—→显示1—D Advanced 窗口—→File —→open file—→文件夹—→文件名—→类型—→驱动器—→确定—→显示0111020.pcx图像。 1、Quantitative menu(定量菜单) —→mark lane—→左键点击选择图片中所需条 带。 2、单击manual mark lane —→选QQmmi—→manual markpks —→显示3个窗口。 3、Quantitate menu—→report—→custom report—→显示report display 对话框—→ 选参数—→OK—→调整版面—→①file—→print screen(全屏打印) —→②file —→save report(A SCII) —→文件类型改为AAB report(*.rpt) 4、将软件计算出的平均密度值X各条带面积，既得到各条带的光密度积分值。其 与蛋白含量成正比。 二、把实验结果拷贝到A盘（采用压缩文件） 1、双击桌面ACD See 32—→显示ACD See 32 V24窗口—→打开文件夹Aab—→ Data —→WXR(王雪融) —→在C：\AAB\DATA\WXR窗口下双击需要图像—→显示图像—→文件—→另存为—→显示另存为图片为—→键入文件名—→改保存类型选JPG—→保存—→退出桌面。 2、双击桌面windows 资源管理器—→显示浏览—→（C：）窗口—→点Aab—→ Data —→wxr —→显示文件名称—→点需要文件（按Ctrl，可间断连续点）— →拷到A盘。 注意：1、扫描凝胶时，用白色板滤光，western绿色板 2、调节装置由上至下，分别为光圈、放大缩小、焦距 3、电源旁光源亮度可调节大小 Settings(号数最初装置) Q OMMI Peark threvhold :7 peak width:5 √peak numbers on image Beam sweep:20 Amout :mg √lane (enters on themge) Posieion:mw (二)核酸测定软件： 1、原理：核酸常和蛋白及核蛋白的形式结合，在提纯核酸中，要测定其中蛋白质 杂质含量。通过260nm/280nm 两波长的吸收读数比率和空白的校正。估算核酸的 纯度。DNA比值为1.8。RNA比值哦2.0，对核酸，260/280nm的比值越小，蛋白 质杂质越多。 测定方式： （1）测定260/280nm及280/260nm的比率； （2）测定260/280nm及280/260nm的比率，背景校正波长320nm； （3）测定230/280nm及260/230nm的比率，背景校正波长320nm; （4）测定260/280nm及280/260nm的比率，用wabburg和christian系数计算蛋白质和核酸浓度。 （5）通用法：参数由用户自行设定。 常用测定核酸样品4个波长： （1）230nm：肽腱的吸收波长，比280nm更灵敏，但用缓冲液等对测定干扰； （2）280nm：蛋白质中芳香族氨基酸的吸收波长，干扰少，经常用； （3）260nm：专用测定核酸的含量； （4）320nm：用于本底校正，核酸和蛋白质在此波长下无吸收； 测定核酸和蛋白质浓度公式： 蛋白质=155 -757.3* 核酸（ug/ml）=62.9* A260-36*A280 2举例：测定核酸样品在本底校正时的260/280nm的比率： （1）核酸分析窗口——[assay type]——选[260/280Ratio:Bkg=320nm]项； （2）取装置{sampling device}项中——选方式为[N one]; （3）测定方式下，同时获得样品在260nm和280nm处的光密度及260/280和280/260的比率。 (三)DNA/Oligo Quant Analysis (1)olig DNA LONG (2) olig DNA SHORT (3) olig RNA LONG (4)olig RNA SHORT (5)dsDNA （6）ss RNA （7）RNA （8）230/260＆260/280＆conc (9)230/260＆260/280rations 三、应用条件 （一）蛋白质测定：有8种程序： 1、Biuret(双缩脲法) 2、Bradford(考马斯亮苦G-250染色法) 3、lowry 4、UV 法（紫外法） 5、BCA法 6、colloidal gold（胶体金法） 7、User defined 法（用户自行设定波长） 举例：用Bradford法测定蛋白质的浓度： （1）原理：考马斯亮兰G-250在酸性溶液中为棕红色，它和蛋白质通过疏水作用结合后产生颜色反应呈现蓝色。在595nm处有最大光吸收收，在一定范围内，蛋白质含量与5595nm的吸收值成正比，测定蛋白质浓度范围为1-140ug/ml; （2）方法： 1）配制染色液：100mg考马斯亮蓝G-250溶解于50ml95%的乙醇中，加入100m85%的磷酸，加水稀释至1000ml, 2）配制标准蛋白溶液，在试管中加入含0.10.20.30.40.50.60ug的标准蛋白质，加水至60ul，加3ml染色液，混匀后室温放置15min; 3）配制样品溶液：方法同标准蛋白溶液 （3）仪器操作： 1）用鼠标在屏幕上选击protein analysis窗口——选Biuret——仪器自动给出测定波长为595nm。用户只需在选项中选取所需要的指标和数据，例如：7个标准溶液分别为 0.10.20.30.40.50.60ug/ml 2）在number of standards 一项中输入7，并分别输入7个标准溶液的浓度，从“VIEW” 一项中可观察到方法的具体内容。 3）按顺序测定空白和标准溶液的吸光度。 4）用鼠标器指向[Disp std crrve],仪器会自动给出标准曲线，并计算出标准曲线的斜率。 截距和相关系数。以ABS=SLOP*CONE计算零截距线性标准曲线；ABS=（SLOP*CONE）+A-截距计算非零截距线性标准曲线 5）标准曲线完成后，用鼠标指向[sample]项，即可测定样品，根据标准曲线仪器自动给出样品的浓度。 紫外分光光度计的原理及应用（核酸蛋白分析仪） 一、原理： （一）基本知识： 1、紫外分光光度分析法：是依据物质分子或离子团对紫外的特征吸收而建立起来的分析方 法。 光波是一种频率很高的电磁波，波区分为：可见光区：380-780nm紫外区200-380nm 远紫外区：小于200nm红外区：大于780nm 应用主要范围在紫外区和可见光区。 2、光谱图：透射法，吸光度法，以后者最为常见。 3、紫外/可见分光光度计的组成： （1）光源-单色器——样品室——检测器——显示系统； （2）光源-样品室——单色器——二极管距阵检测器——显示系统； 单色器称波长选择器，包括入射狭缝，反射镜，光栅（棱镜），聚焦装置，出射狭缝。 4、紫外/可见光分光光度计的分类及特点： （1）单光束分光光度计：光路系统简单，光源能量损失小，机械振动小，所以噪声小，信噪比高。 （2）双光束分光光度计：可消除光源强度变化引起的误差。（一个单色器） （3）双波长分光光度计：可测定混浊样品。（两个单色器） 二、BECKMAN的DU600系列及DU7000系列简介： 三种标准的常规测定方式： 1、固定波长：可同时测定12个波长的吸收或透射方式的读数。 2、波长描述：190-1100nm波长的吸收或透射方式的读数。包括光谱图定位峰，谷点，读数 跟踪，局部放大，光谱重叠相比。谱图相减，1-4阶导数及对数计算。净吸光度计算。 重复扫描等。 三、动力字/时间。 溶液配制（脑基底A平滑肌细胞新鲜分离） 一、分别配2mMCacl2测定液，0.8/0.2mM Cacl2分离，消化液的10倍浓缩液。 （一）2mMCacl2测定液×10 成分FW mM g/100ml NaCl 58.44 1450 8.474 KCl 74.55 30 0.224 MgCl2.6H2O 203.3 10 0.203 HEPES.Na 260.3 100 2.603 应用时，若配200ml测定液，则分别取上述三种盐混合液20ml及HEPES.Na10倍浓缩液20ml，再加H2O至200ml ，再加glucose(浓度0.2%)0.4g,最后加0.8M CaCl2贮存液0.5ml，调PH 值7.4即可。 （二）0．8/0.2mM Cacl2分离、消化液×10 成分FW mM g/100ml NaCl 58.44 1300（1.3M）7.5972 KCl 74.55 50 0.3782 MgCl26H2O 203.3 13 0.2643 HEPES.Na 260.3 100 2.603 应用时，若配100ml分离液，则分别取上述三盐混合液10ml及HEPES.Na 10 倍浓缩液10ml，加水H2O至100ml,再加glucose(浓度0.1%)0.1g,调PH值7.4。然后分出90ml，加0.8M CaCl2母液90ul，即得0.8mM CaCl2分离液，余10ml加0.8mM母液2.5ul，即得0.2mMCaCl2消化液。 二、贮备液 1、2mMCaCl2液×10（100ml） NaCl 8.474g KCl 0.224g MgCl2.6H2O 0.203g 2．0.8/0.2mM CaCl2液×10（100ml） NaCl 7.5972g KCl 0.3728g MgCl2.6H2O 0.2643g 3. HEPES.Na×10 称2.603加水100ml 4.0.8MCaCl2(wt:110.99)配100ml; (110.99/1000)×0.8=0.0888g/ml×1000ml=8.88g 脑基底A平滑肌细胞新鲜分离 SD雄性大鼠200g，乙醚麻醉，断头，用手术刀纵向割开头部皮肤，分离头部肌肉，暴露颅骨，用止血钳夹碎颅骨，小心用小手术刀片分离出完整大脑及附带一截较长且完整的延髓，置入0.8mMCaCl2溶液（皿盖）中，在手术显微镜下，小心分离出完整的基底A，置入0.8mMCaCl2溶液（皿底）中漂洗一次，置入含1ml0.2mMCaCl2溶液（皿底）中,在手术显微镜下，用眼科剪将整条基底A剪成0.2mm的动脉环（越细越好），然后用自制细头吸管将此含有A环的1ml0.2mMCaCl2溶液完全吸入含有四种酶的edenpendoff管中，加盖静置1h，用自制细头吸管来回反复吸打管中酶液20次（NOTE：用力不可过猛OR 过轻），然后吸取酶液加入预先准备在平台上的8片的中央各一滴，静置15min，在此过程中，在8个有盖小皿中分别加入含无游离脂肪酸的牛血清白蛋白（BSA）的0.8mM的CaCl2液3ml（配制：称BSA80MG——40ML 0.8mMCaCl2液——2g/lBSA液），15min后将8个玻片分别在一有BSA的0.8mMCaCl2液的大皿中浸一下，再浸入8个有盖小皿中，加盖静置4℃冷藏6h.) 测定 4℃冰箱中取出分离好且已贴壁的脑ASMC(8个有盖小皿)。 另取三只有盖小皿，用移液器各加入1.5ml 0.8mM CaCl2(含BSA)液，然后关灯，在暗室中各加入fura-2/AM10ul。再从8个小皿中任取两玻片（上有贴壁SMC）分别放入此二只小皿中，加盖，且用金属纸完全遮盖小皿，此时开灯，SMC负载fura-2/AM40min，然后关灯，在暗室中分别取出二小皿的玻片，在含0.8mM CaCl2液的皿中漂洗一下，放在细胞固定器上，旋紧螺冒，在最上面再加0.8mM CaCl2液灌流，置于microscrop confocal 下观察。 一、内皮素贮存液（ET）配制 1、ET分子量为2500 左右，每瓶ET重量为50mg，计算可配成10-5M贮存液2ml。 2、在内皮素瓶中加入P BS液2ml，反复吹打至混匀，分装eppenndorf管，每个EPP200ul （贮存液为10-5M），临用前稀释。 3、稀释：先加入900ulPBS +100ulET贮存液于1.5ml，Eppendonf 管，混匀配成10-6ET 4、如此同法稀释可依次配成10-7-10-5MET液，所有液体，-20℃冰箱保存备用。 二同位素配制（稀释） 先灭菌（紫外灯）30分钟 灭菌青霉素瓶1ml，5ml注射器各一支 Eppendonf 管（1.5ml）9个 灭菌PBS一瓶 均放在灭菌罩内。 预先在表霉素小瓶中加入9.75mlPBS液，然后用1ml注射器吸取3H-TDR原液（1mi/ml共1ml装，上海原子核研究所提供）0.25ml+9.75mlPBS即25 ClC-3 Immunofluorescence 1.VSMCs were fixed in 2% paraformaldehyde for 10 min. 2.The cells were washed with 0.75% glycine in PBS for 30 min, (3-5 times) 3.Followed by permeabilization with 0.05% Triton-X 100 in PBS for 15 min. 4.The cells were then incubated with a combination of unconjugated donkey anti-rabbit IgG, anti-mouse IgG or anti-mouse IgM antibodies (1:20) to block non-specific binding for 2 hour. (This step can be replaced by using 1% BSA in PBS for 30-45 minutes) 5.Then incubated with isoform specific anti-ClC-3 primary antibodies(1:100 in PBS containing 1% BSA) for 18-24 hours at 4 o C. 6.Washed in PBS 3 times for 10minutes at room temperature. 7.Incubated with secondary antibody 1:500 dilution in (1:100 in PBS containing 1% BSA) at Room Temperature for 30min. Protect against light in this step. 8.Washed in PBS 3 times for 10minutes at room temperature. 9. Scan the section in 1 hours by using cofocol 488 nm as exciting wavelength. 一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 The final edition was revised on December 14th, 2020. 西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分 析 学院：生命科学学院 专业：生物科学 年级班级：2010级5班 校区编码：北区 姓名：陈建坤 二零一二年十二月四日 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。 【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养 一．引言: 染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科 细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结) 一、消化与吹打 版上很多朋友讨论细胞培养问题，见到很多很好的经验总结，这里说一些我个人的经验，因为一些比较特殊的原因，我自己培养接触过近300种细胞，常用于做实验的，累积有百余种，可以说遇到过许多各式各样古怪的细胞。这里挑细胞消化开始做我的第一篇专题，并不是因为细胞消化最重要，而是近期看到大家频繁讨论这个话题，我就抛砖引玉，下面几点拙见，可能与其它朋友总结的一些经验有点出入，仅供大家参考。 许多同学对细胞消化做了许多研究，得出了很多有价值的经验，也见到很多人的困惑。其实细胞培养，尤其是细胞系的培养，就消化而言，不是太难，做得多了，善于总结经验，就能把细胞越养越好。一般的程序步骤，细节操作，我这里就不讲了，只讲一些基本操作背后的知识，如果不对之处，欢迎指正，一起讨论： 1，其实绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可，吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37度消化。 2，什么算是消化好了呢？不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养 人体外周血淋巴细胞培 养与染色体核型分析 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】 西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分 析 学院：生命科学学院 专业：生物科学 年级班级：2010级5班 校区编码：北区 姓名：陈建坤 二零一二年十二月四日 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。 【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养 一．引言: 染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科 细胞培养基的选择及常用数据库 日期：2012-04-13来源：未知作者：网友点击：次细胞实验技术 经典的培养基有很多种，Invitrogen(GIBCO)、Thermo Fisher(HyClone)、Sigma等公司都可以提供。其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是应用最广泛的培养基。其他如M199、IMDM、L15培养基等也用于某些细胞的培养。 ◆MEM是由Eagle’s基础培养基(BME)发展而来的，其中增加了组分的范围及 浓度。 ◆ Dulbecco改良的BEM(DMEM)培养基是为小鼠成纤维细胞设计的，现在常用于 贴壁细胞的培养。DMEM的氨基酸浓度是MEM的两倍，维生素浓度是MEM的4倍，采用双倍的HCO3-和CO2浓度起到更好的缓冲作用。最初的配方中葡萄糖含量为1000 mg/L，后来为了某些细胞的生长需要，将葡萄糖含量又调整为4500 mg/L，这就是大家常说的低糖和高糖了。 ◆ aMEM含有附加的氨基酸、维生素以及核苷和脂肪酸，它可广泛应用于各种细 胞类型，包括对营养成分要求苛刻的细胞。 ◆ Ham’s F12是为在低血清浓度下克隆CHO细胞而设计的，现在也广泛应用于 克隆形成率的分析及原代培养。F12还可以与DMEM等体积混合使用，得到一种高浓度与成分多样化相结合的产物，这种培养基已应用于许多原代培养及更难养的细胞系的培养。 ◆ RPMI 1640培养基是专为淋巴细胞培养而设计的，现在已广泛应用于悬浮细胞 的培养。 以前经常听到有人问，这种细胞该用哪一种培养基呢?其实这个问题的答案可以很简单，也可以好复杂。此话怎讲?如果这种细胞是购自ATCC或其他的细胞库，那很简单，问供应商就行了。或者找到相关的文献，作为参考。Invitrogen网站上有一个Cell Line Database的工具，也很好用。选择你感兴趣的细胞类型，它就会弹出推荐的培养基、血清和转染试剂等，有时还有优化好的转染步骤，很方便。Sigma网站上也有一个Media Expert，包括了培养基所有成分的功能描述、使用推介和参考文献等，它还 实验原理 人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。 人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。 1912年，Warfter 最先研究人类染色体。1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。 细胞遗传学、组织培养技术为 人类染色体的研究提供了条件。 技术突破主要在于： （1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。 （2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。 （3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。 1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。 实验试剂 RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。 磷酸缓冲液的配制 0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6): A:Na2HPO4?12H2O 28.8克B:Na2HPO4?7H2O 2.164克 KH2PO4 2.67克NaH2PO4?2H2O 0.3克 溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中 实验设备 2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。实验材料 人的外周血淋巴细胞 分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul） ①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应 我是细胞培养的新手，在开始养细胞前看到篇文章（老师给的）很实用，希望对大家有帮助。细胞培养室实验操作规范 一、细胞培养室的环境 1. 细胞生长要求严格的无毒无污染环境，因此必须注意培养室的清洁卫生，保持操作空间的无菌条件： 1) 培养室应为独立、封闭的空间。培养室及缓冲间都应保持整洁，不要随意出入； 2) 保持超净工作台的无菌环境，每次使用前打开紫外灯照射消毒15—30分钟；每次使用后将废弃物清理干净，各用具规放整齐，用70%酒精擦净台面，再打开紫外灯照射30分钟以上； 3) 定期擦洗桌面、地板、清洁培养室，并用0.1%的新洁尔灭溶液消毒；定期打开培养室的大紫外灯，将整个房间进行照射消毒； 4) 每次打开培养箱前，或手伸入超净工作台进行操作之前，均应用70%酒精擦手。 5) 定期清理冰箱。将药品试剂分类摆放，过期的试剂应及时清除； 6) 培养箱要定期清洁。隔板及内壁等用0.1%的新洁尔灭溶液清洗，再用70%酒精擦净；并要注意底层水箱的水位，及时补充水份； 7) 注意监测CO2的气压，及时补充。 8) 注意监测液氮罐中液氮的挥发情况，及时补充，液面不能低于最高一层细胞冻存盒的位置。 2. 实验器具的清洗、消毒灭菌： 1) 反复使用的器皿应严格清洗干净，其清洗程序为：清水浸泡——去污剂刷洗 ——清水冲洗——超声波洗涤——洗液浸泡（过夜）——充分冲洗（务必冲洗干净，不能残留洗液）——蒸馏水漂洗——烘干；若为新的玻璃器皿，要在刷洗后用5%的稀盐酸浸泡过夜。 *洗液：浓硫酸+重铬酸钾 2) 胶塞的清洗：清水浸泡——2%NaOH煮沸10—20分钟——冲洗——1%稀盐酸浸泡30分钟——充分冲洗——蒸馏水漂洗——烘干 3) 玻璃器皿，如玻璃吸管、离心管、玻璃培养瓶、套管等等以及胶塞，清洗后均可用高压蒸气灭菌，15磅灭菌30分钟。 4) 不能高压灭菌而又需反复使用的器具，如加样枪、多道枪的加样槽、塑料吸头等，应事先用70%的酒精擦洗，置于超净工作台中用紫外线照射2小时以上。 二、细胞培养用水、用液： 1. 胞培养必须使用玻璃蒸馏器制备的三次蒸馏水，二次蒸馏水或外购的金属蒸馏器制备的蒸馏水只能用来清洗器皿； 2. 平衡盐溶液（BSS）严格按照配方配制，含Ca++、Mg++离子的要避免其沉淀。可过滤灭菌或高压灭菌。采用高压灭菌时如含有葡萄糖等成份，应避免高压过度，一般8磅10分钟及即可。灭菌后的BSS于4℃冰箱中保存，如出现浑浊或沉淀时，应废弃，重新配制。 3. 培养液的配制，以配制1000ml RPMI1640为例： 1) 将RPMI1640干粉倒入约800ml三蒸水中，搅拌使其溶解； 2) 加入5.94g HEPES，在磁力搅拌器上搅拌约半小时； 3) 加入2g NaHCO3，继续搅拌约2小时； 4) 定容至1000ml；必要时用1N NaOH凋至PH7.0 5) 过滤除菌。滤纸由上到下为：普通定性滤纸、0.4μm滤膜、0.22μm滤膜； 实验十五动物细胞培养技术及其应用 一．实验目的 通过本实验使学生掌握细胞培养、细胞检测和细胞表达等成套技术的原理和方法。 二. 实验内容 1.培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏等基本技术； 2.细胞生长曲线测定、细胞活性检测等常用技术； 3.细胞污染检测方法与技术； 4.病毒在细胞中的感染与增殖、重组病毒异源蛋白的细胞表达等实用技术。 三．实验用品 1. 材料：Sf 细胞、Hi5 细胞等 2. 器材：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、培养基抽滤装置、电泳仪、离心机、pH 计、液氮罐（含液氮）、水浴锅、温度计、培养瓶、血清瓶、5 ml和10 ml 移液 管、不锈钢移液管筒、大小不锈钢饭盒、酒精灯、吸耳球、血球计数板、96孔板、 24孔板、无菌冻存管、离心管、记号笔、一次性过滤器、微量加样器、精密pH 试纸、酒精棉球等 3. 试剂与药品：Grace培养基、胎牛血清、甘油、DMSO、双抗（青霉素、链霉素）100 u/ml、 Hank’s液、胰蛋白酶、台盼蓝、液氮、分析纯无水酒精、95%医用酒精、Tris 碱、硼酸、EDTA、琼脂糖粉（电泳用）、dNTPs、Taq酶、支原体检测试剂盒、 DNA提取试剂盒DNeasy Blood & Tissue kit （Qiagen）等。 四．实验方法与步骤 （一）培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏 1. 缓冲液及培养基配制 Hank’s液：KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml，高压灭菌。4℃下保存。 胰蛋白酶液： 称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s 液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。 4%台盼蓝染液：称取台盼蓝4克，加双蒸水至100 ml。 MTT溶液：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的Hank’s液中。4℃下保存。Grace培养基：取一份GIBCO公司的Grace培养基粉剂，按说明用量加入1000ml三蒸水100单位／毫升青、链霉素，充分混匀使溶解，调节pH值至6.8左右。 0.22 μm 滤膜抽滤除菌，4℃下保存。此为基础培养基。使用前加入10%胎牛 血清。 细胞冻存液：基础培养基加入10%DSMO，20%胎牛血清，用前配制。 PBS缓冲液：137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.1 mmol/L Na2HPO4, 1.5 mmol/L KH2PO4, 第一讲体外细胞培养的基本技术 ●体外细胞培养条件和基本技术 ●体外细胞培养 ●体外培养物的生长生物学 ●细胞系和细胞株 ●培养物的冷冻与复苏 ●培养物的污染、检测和排除 ●一、体外细胞培养条件和基本技术 体外细胞培养的优缺点 优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。 体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。 一、体外细胞培养条件 （一）、体外培养实验室 1. 准备室 2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。 3. 缓冲室 4. 其他实验室 （二）、体外培养的设备和器具 设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值 3. 倒置显微镜 4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器， 超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置 8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平 培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器， 针头式加压塑料小滤器 2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿 （4）多孔培养板（5）离心管 3. 移液器 4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网 （三）培养用液 ?水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS) 水：离子交换水，蒸馏水 平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖 常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks，Hanks ?培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液 2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等 第19卷第2期 江西农业大学学报 V o l.19,N o.2 1997年6月 A cta A gricu ltu rae U n iversitatis J iangx ien sis June,1997 α 小鼠胚胎干细胞培养体系的建立 汪河海1 刘红林2 范必勤1 钟 卉3 丁家桐4 (1 江苏农科院牧医所,南京 210014;2 南京农业大学动物科技学院,南京 210059;3 南京铁道医学院,南京 210009;4 扬州大学农学院动物科学系 225009) 摘 要 通过探讨影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素,建立了小鼠胚胎干细胞体外培养体系,并建成小鼠ES细胞系。 关键词:小鼠;胚胎干细胞;培养体系;ES细胞系 中图分类号:S865.1 胚胎干细胞又称ES细胞(Em b ryon ic Stem Cells)。其特点是在体外特定的培养条件下能保持其只生长、不分化的增殖状态,并具早期胚胎细胞发育的全能性。哺乳动物的ES细胞系自Evan s和Kaufm an(1981)首次建立以来[1],引起人们高度的重视,并被广泛地用于动物发育遗传学的基础理论研究和转基因动物的生产实践。但ES细胞系要在体外克隆成功,必须有成纤维细胞或STO细胞饲养层的支持[2],为建立有效的哺乳动物ES细胞体外培养体系,本文就影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素做初步探讨,为今后进一步开展研究奠定基础。 1 材料和方法 111 动物准备 选3～4月龄的性成熟的昆明鼠,母鼠自然发情或超排后与公鼠交配,第2天早晨检查阴道栓,见栓查为发情受精。妊娠至一定日龄后取其胚胎或胎儿用于分离囊胚内细胞团细胞或制备胎儿成纤维细胞饲养层。 112 溶液的配制 按日本学者管原七郎的配方配制D PB S液,胰蛋白酶溶液、DM E M液及ES细胞培养液(配方略)。 113 胎儿成纤维细胞饲养层的制备 α 实验二细胞传代培养 一、目的和要求 (1) 掌握贴壁细胞传代的培养方法； (2) 掌握细胞计数和存活率计算方法； (3) 培养建立无菌操作意识。 二、实验原理 细胞培养是培养连续细胞系或者离体正常组织或肿瘤细胞的技术。当离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止；若不及时分离、传代培养，细胞将逐渐衰老死亡。传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或其他比例转移，接种到其他培养瓶的培养。贴壁细胞的传代通常是用胰蛋白酶消化，把细胞分散成单细胞再传代；而悬浮生长的细胞则用直接法传代或离心法传代。 细胞计数是观察判别所培养细胞的状态的重要手段，也是细胞传代培养及判断实验处理对细胞的影响所必需的方法。细胞计数的结果一般用每毫升（液体培养）或每平方厘米（固体单层培养）的细胞数来表示。通常细胞计数是运用光学显微镜和血球计数板对细胞进行直接计数。图1为血球计数板一个计数区的示意图。血球计数板具有两个可以计数的区室，每个计数区由9个亚区构成，每个亚区的面积为1mm2，同时血球计数板上覆盖一个具有一定厚度的血盖片，保证计数区与盖片之间的距离为0.100mm。当盖片放置正确，每个亚区上的体积为0.1mm3即1×10-4mL。统计计数区中的4个角亚区中的平均细胞数（或中央亚区中的细胞数），记做N；若在准备过程中，对细胞的稀释倍数为D，则样品的细胞密度 4 N C个/mL。 =D ? 10 ? 图1 血球计数板构造示意图细胞膜是一层选择性通过的半透膜，当细胞膜完整时，某些染料无法进入细胞中。利用这一特性可以进行细胞存活检查。通常使用台盼蓝，活细胞无法被台盼蓝染色，而死细胞则会吸收染料被染色。 三、器材与药品 (1) 实验器材： CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压灭菌锅、水浴锅、离心机、血球计数 板、离心管、培养瓶、移液枪、微孔滤器等。 (2) 实验材料： 实验五人的外周血淋巴细胞培养 一、实验原理 外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期(或Go期)，一般情况下是不再分裂的，在培养液中加入植物凝血素(PAH) 时，这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。本方法已为临床医学、病毒学，药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。 二、实验目的 掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。 三、实验材料 人的外周血。 四、实验器具和药品 1．用具: 2毫升灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量筒，培养瓶，试剂瓶，酒精灯，烧杯，载玻片，切片盒，天平，离心机，恒温培养箱，显微镜。 2．器皿的清洗和消毒 玻璃器皿在使用前，均应用肥皂水洗刷，清水冲净，烘干后浸泡在洗液中至少2h，再用流水冲洗，烘干待消毒。 将已洗净、烘干的玻璃器皿装入铝盒或用纸包装，放入干燥消毒箱内；150℃1h。 隔离衣、口罩。橡皮塞，注射用针筒等则用高温高压消毒(15磅15min)。 3．药品 (1) RPMI“1640”培养基：称取“1640”粉末10.5克，用1000ml的双蒸水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时，可用干冰或CO2气体处理，如pH值降至6.0时，则可溶解而透明。每1000ml溶液加NaHCO， 1.0－1.2g，以干冰或CO2气体校正pH至7.0－7.2。立即以5号或6号细菌漏斗过滤灭菌，分装待用。 (2) 肝素：作为抗凝剂使用。称取该粉末160mg(每mg含126U)，用40ml的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每ml 500U。高压消毒8磅15min。 (3) 秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度；抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素4mg，用100ml生理盐水溶解，用6号细菌漏斗过滤，然后放入冰箱4℃保存。使用时用1ml注射器吸取该溶液0。05－0.1ml加入5ml的培养物中，其最终浓度为0.4—0.8ug／ml。 (4) 植物凝血素(PHA)：是淋巴细胞有丝分裂刺激剂。提取PHA的方法有两种。一种比较简单，直接用四季豆的浸出液；另一种较复杂，最后制品为粉末。如用之得当，二种方法均可获得良好的效果。 盐水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它颜色如红斑色、黑色.黄色，白色的四季豆亦可。取豆子20g，用水洗净可能粘附在种子外面的化学药物。先在水中浸过夜(4℃)，次日倒去水分，将豆子放入组织搅碎器内，加30ml生理盐水，开动搅碎器使之成为粘糊状，向搅碎器再加70ml生理盐水，混合均匀。置冰箱24h。然后以3000转／min离心15min，取上清液，用生理盐水稀释10倍，5号除菌滤斗过滤，分装小瓶，冰冻保存。 一、细胞培养实验室的设置及设备 （一）细胞培养实验室的设置 组织细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。目前，超净工作台的广泛使用，很大程度上方便了组织细胞培养工作，并使一些常规实验室有可能用于进行细胞培养。 细胞培养实验室应能进行六方面的工作：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。 1．无菌操作区 （1）无菌操作室：无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好能与外界隔离，不能穿行或受其他干扰。 理想的无菌操作室应划为三部分： a) 更衣室—―供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。 b) 缓冲间—―位于更衣间与操作间之间，目的是为了保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。 c) 无菌操作间—―专用于无菌操作、细胞培养。其大小要适当，且其顶部不宜过高（不超过2.5m）以保证紫外线的有效灭菌效果；墙壁光滑无死角以便清洁和消毒。工作台安置不应靠墙壁，台面要光滑压塑作表面，漆成白色或灰色以利于解剖组织及酚红显示pH的观察。 无菌操作间的空气消毒： 紫外线灯—－产生臭氧，并且室温度及湿度均较高，不利于工作人员健康。 空气过滤的恒温恒湿装置—－最好。 表1 洁净室（区）空气洁净度级别表 洁净度级别尘粒最大允许数／立方米微生物最大允许数浮游菌／立方米沉降菌／皿 100级3,500 0 5 1 10000级350,000 2,000 100 3 100000级3,500,000 20,000 500 10 300000级10,350,000 60,000 - 15 无臭氧紫外线消毒器 电子消毒灭菌器—－在高压电场作用下，电子管的外电极发生强烈电子轰击，使空气电离而将空气中的氧转换成臭氧。臭氧是一种强氧化剂，能同细菌的胞膜及酶蛋白氢硫基进行氧化分解反应，从而靠臭氧气体弥漫性扩散达到杀菌之目的，消毒时没有死角。消毒后空间的残留臭氧只需30～40min即能自行还原成氧气，空气不留异味，消毒物体表面不留残毒。 简介 哺乳动物细胞培养作为一个无价的细胞生物学工具已有几十年。生长在扁平和僵硬的二维(2D)底物(如 聚苯乙烯或玻璃)上的单层贴壁细胞已成为传统细胞培养系统的中流砥柱。二维细胞培养的研究在扩宽 我们对发育生物学、组织形态发生、疾病机制、药物发现、大批量蛋白生产、组织工程和再生医学方 面的知识方面扮演了至关重要的角色。与此同时，随着2D培养系统而来的缺陷也显现了出来，尤其是 其不能模拟体内环境以提供生理相关的数据。 在体内，几乎所有组织的细胞都处在由一个复杂三维(3D)结构的细胞外基质(ECM)中，它们和相邻的 细胞通过生化和机械关系产生着相互作用1。细胞-细胞和细胞-细胞外基质间的相互作用构建成了一个 用于维持组织特异性和稳态的3D通讯网络2。细胞生命周期的关键事件通过受到周边细胞微环境的控 制3。2D培养试验中，细胞无法实现类似于体内的结构组织和连接，这使得细胞形态、存活力、增值 能力、分化、基因和蛋白表达、对刺激的反应、药物代谢及一般的细胞功能受到了限制或减弱。 2D 培养的限制对临床前基于细胞的药物和毒性筛选试验的可预测性造成了影响。超过90&的药物通过了体外临床前研究，却在随后的临床实验中未能达到预期的疗效或安全范围4。癌症药物的失败率更高 5, 12，因为2D培养系统常常无法构建有效的肿瘤生物学模型6,7。而且，在使用2D模型进行临床前药物研 发时，生物利用率和毒物学的研究严重依赖于动物模型的使用。这一高失败率表明动物模型可能并不 适用和/或并非人用治疗方案安全性评测的代表4,16,17。 为了克服这些短板，大量的3D细胞培养模型在近20年被开发了出来。由于3D模型显著促进了癌生物 学、组织工程和再生医学的研究，又得到了进一步的发展。为此，细胞生物学家们、材料科学家们、 生物医学工程师们以及其他开发更有用的模拟体内环境的3D模型来缩短2D培养与活体组织间差距的 人，携手参与了多学科的研究。越来越多的证据表明，3D培养建立起来的生理细胞-细胞与细胞-细胞 外基质相互作用可以模拟天然组织的特异性，并且比传统2D培养的生理相关性更强8-10。这在干细胞培 养和分化、癌生物学、药物和毒性筛选及组织工程中显得尤为突出。 Suparna Sanyal, Ph.D.3D细胞培养和试验系统 综述文章 人体间期细胞X—小体的制备 一、原理 1949年Barr等发现，在雌性体细胞中的两条X染色体有一条（或这条的大部分）处于凝集不活动状态，从而形成X-小体（或称X-染色质、性染色质、Barr 小体）。进而发现，所有哺乳类雌体细胞中都有一条这种表现的X染色体，当在个用雌或雄体中，有多于2条X染色体时，在间期细胞内除一条外，其余均形成X-小体。 人类正常的男女体细胞中，22对常染色体并无区别，但其性染色体分别为XY 和XX。女性的两条X染色体中，有一条在间期呈现浓缩状态，可由适当的染料显示。正常女性间期细胞中X小体阳性率约为30—50%。 二、仪器、用品及试剂 光学显微镜，恒温水浴箱； 牙签、载玻片、染色缸； Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸＝3∶l）70%乙醇，硫堇染液； 5N HCl，0.2%甲苯胺兰染液。 三、操作步骤 （一）方法一 l．取材、涂片：取女性口腔上皮细胞均匀涂布在洁净载玻片上。 2．固定：涂片后立即95％乙醇中固定30分钟（不可干燥）。气干。 3．染色：玻片在蒸馏水中冲洗几次后5N HCl（22℃）水解10分钟，蒸馏水洗去多余HCl，硫堇染色30分钟。水洗。 4．镜检、气干后即可镜检。若背景颜色过深可在75%乙醇、95%乙醇中分色后再镜检。 （二）方法二 l．取女性口腔上皮细胞涂片。待干燥。 2．Carnoy固定液中固定15分钟。干燥。 3．5N HCl中10分钟。水洗。干燥。 4．0.2%甲苯胺兰染色2—5分钟。水洗。气干。 5．镜检。 四、注意事项 l．涂片时应均匀涂成单层，取材细胞要多些。取材前应漱口。 2．镜检应选择完整、核质中颗粒均匀的细胞观察，X-小体大小约为1μm，多位于细胞核边缘。 3．统计X-小体阳性率，计数应选300—500个细胞。 五、试剂 1．硫堇染液配方： ①4%硫堇原液：4g硫堇粉末置研钵中以50%乙醇100ml研磨溶解。过滤。 ②Michaelies缓冲液：醋酸钠9.714g，巴比妥钠14.714g加双蒸水至500ml。 ③硫堇工作液（PH5.7）：0.1N HCl 32ml Michaelies缓冲液28 ml 4%硫堇原液400ml 2．甲苯胺兰染液配方： 0.2g甲苯胺兰粉末溶于100ml双蒸水中即可。 细胞培养实验室构建方案 （一）细胞培养实验室的设置 细胞培养实验室与其他一般实验室的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。 细胞培养实验室应分为以下几个区：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。 1．无菌操作区 （1）无菌操作室：无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好能与外界隔离，不能穿行或受其他干扰，一般地理位置在最后部分。 理想的无菌操作室应划为三部分： a) 更衣室—―供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。 b) 缓冲间—―位于更衣间与操作间之间，目的是为了保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。 c) 无菌操作间—―专用于无菌操作、细胞培养。其大小要适当，且其顶部不宜过高（不超过2.5m）以保证紫外线的有效灭菌效果；墙壁光滑无死角以便清洁和消毒。工作台安置不应靠墙壁，台面要光滑压塑作表面，漆成白色或灰色以利于解剖组织及酚红显示pH的观察。 （2）净化工作台：操作简单，安装方便，占用空间小且净化效果很好。一般细菌培养室使用的净化工作台主要有两种：a)侧流式或称垂直式b)外流式或称水平层流式。 净化工作台工作原理（大致相同）――通常是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器精滤，由此送出的洁净气流以一定的均匀的断面风速通过无菌区，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。 净化工作台应用注意： （1）净化工作台应安装在隔离好的无菌间或清洁无尘的房间内，以免尘土过多易使过滤器阻塞，降低净化效果，缩短其使用寿命。 （2）新安装的或长期未使用的工作台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作，然后再采用药物灭菌法或紫外线灭菌进行灭菌处理。 （3）使用净化工作台前，应先用75％酒精擦洗台面，并提前以紫外线灭菌灯照射30～50min处理净化工作区内积存的微生物。关闭灭菌灯后应启动风机使之运转两分钟后再进行培养操作。 （4）净化工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流流型不受干扰。 共培养体系-①直接共培养体系，即将2种或2种以上的细胞同时或分别接种于同一孔中，不同种类的细胞之间直接接触 共培养体系-①直接共培养体系，即将2种或2种以上的细胞同时或分别接种于同一孔中，不同种类的细胞之间直接接触。②间接共培养体系，即将2种或2种以上的细胞分别接种于不同的载体上，然后将这两种载体置于同一培养环境之中，使不同种类的细胞共用同一种培养体系而不直接接触。 学术术语来源—— 不同培养条件下脂肪干细胞与成骨细胞的共培养 文章亮点： 1 共培养体系主要用于诱导细胞向另一种细胞分化，诱导细胞自身分化，维持细胞功能和活力，对细胞增殖进行调控，促进早期胚胎的发育和提高代谢产物的产量。 2 实验的创新性在于将第3代脂肪干细胞和第2代成骨细胞在不同胎牛血清条件下共培养，证实两种方法均能使脂肪干细胞向成骨细胞分化。 关键词： 干细胞；脂肪干细胞；成骨分化；共培养；细胞培养；胎牛血清 主题词： 脂细胞；成骨细胞；细胞分化；细胞培养技术 摘要 背景：成骨细胞与骨髓干细胞共培养后可以诱导骨髓干细胞向成骨细胞分化，成骨细胞与脂肪干细胞共培养是否也能诱导向成骨细胞分化呢？ 目的：观察脂肪干细胞与成骨细胞共培养后能否向成骨细胞分化。 方法：分离新西兰大白兔脂肪干细胞和成骨细胞，待脂肪干细胞生长至3代，成骨细胞生长至2代时，进行共培养。根据培养时血清浓度不同分为10%胎牛血清共培养组和5%胎牛血清共培养组，共培养14 d。 结果与结论：共培养7 d后，2组脂肪干细胞均出现部分变圆。14 d后，脂肪干细胞高度分化与成熟成骨细胞相似，碱性磷酸酶染色阳性、茜素红染色阳性， 其Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA表达均增高，以10%胎牛血清培养组更为明显。提示脂肪干细胞与成骨细胞经过共培养后可以向成骨细胞分化，高浓度血清培养可以促进诱导作用。 细胞培养中常见的问题 2006-11-23 15:53 细胞中的颗粒到底是怎么回事？ 我的细胞总有颗粒，开始是细胞中有，后来细胞之间也好像有许多颗粒。好像是细胞碎片一样。是什么东西啊？是支原体污染吗？这可是我刚买回来的细胞啊! 我们实验室也有这种情况，是不是黑的小碎片，有人说是细胞代谢产物，后来拿到高倍镜下看还会动，就怀疑是污染了，也想问问大家到底是什么 是黑色的小碎片。我没注意到它会动，只是觉得不像是活的微生物。我觉得是由于某种污染或外界因素导致的细胞状态变差，裂解出的东西。但是，是什么东西不清楚。 的确很常见 在以前帖子见到说是“黑焦虫”。长时间培养的很容易出现，我根据自己的经验估计是一种污染，因为随着黑点增多，本来生长旺盛的细胞逐渐停滞甚至死亡。而且我后来原代培养的几批细胞并没有发现，我怀疑有好多细胞系本身就是污染的。不过增加换液次数的情况下，好象一般不太娇气的细胞生长不是很受影响。 以前听很有经验的老师说黑焦虫是国产血清的问题，可以有条件换进口血清试试，或者离心一下也可能能解决问题。那么所谓的“黑焦虫”到底是什么东西啊？有谁知道？ 我培养的细胞也出现过此中问题，放到高倍镜下看时有东西在动，但培养液不混浊，估计不是细菌污染，可能是血清问题，是支原体污染。 我培养的细胞也出现过这样的问题，我个人认为是一种支原体污染。国产血清是罪魁祸首，因为只要将细胞饥饿一下，不超过24小时，这种东西就会疯长 我培养的细胞也有出现这中情况。但是并不影响细胞生长。应该不是支原体污染 最近，我复苏细胞细胞的时候也发现过这样的东西，尽管我用的是GIBCO的FBS，后来，每天换液之前洗几遍后，就慢慢变少，现在没了 细胞培养的细菌污染 我们新建的细胞室。每周都会做清洁，用0。2%新洁尔灭消毒，照紫外。实验前也会照至少30分钟。培养基中加青霉素，链霉素。可是培养细胞时还是常有细菌污染，有时甚至分析不出原因。用培养瓶还好一点，用多孔板或平皿就更凄惨。我养的是哺乳动物细胞，不知各位有什么好的方法避免污染！谢谢！ 很可能是超净台无效了，，或者培养基？其实严格操作箱污染都难 我们是新的超净台，不可能失效。而且用同一瓶培养基，一瓶传两瓶，原始的一(完整word版)2015 动物细胞培养技术实验报告
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细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结)
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