工业微生物菌种的选育——诱变选育(1)

工业微生物菌种的选育——诱变选育（1）

工业微生物菌种的选育——诱变选育（1）

诱变选育

诱变育种是指利用各种诱变剂的物理因素和化学因素处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质菌种的育种方法。诱变育种具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。

诱变育种的步骤与方法

（一）、工业育种的一般步骤（图）

（二）、诱变育种方案设计

诱变育种方案包括突变的诱发、突变株的筛选和突变高产基因的表现。

1、出发菌株的选择

工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株。出发菌株

选择目前主要依据实际经验，总结如下：①以单倍体纯种为出发菌株；②采用具有优良性状的菌株；③选择对诱变剂敏感的菌株；④许多高产突变往往要经过逐步累积的过程，才变得明显，所以有必要多挑选一些已经过诱变的菌株为出发菌株，进行多步育种，确保高产菌株的获得。

2、出发菌株的纯化

为什么要对出发菌株进行纯化呢？这是因为微生物容易发生变异和染菌，同时一般丝状菌的野生菌株多为异核体。生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触、吻合后，易产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然突变株等。这些都会造成细胞内遗传物质的异质化，使遗传性状不稳定。通过纯种分离，从中挑选所需的优良菌株。常用划线分离和稀释分离法，并结合显微镜操纵器分离单孢子。

3、单孢子悬液的制备

诱变育种要求所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。

首先是细胞的生理状态对诱变处理也会产生很大的影响，如细菌在对数期诱变处理效果较好；霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子影响不大，但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率。

其次是分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落。由于在许多微生物的细胞内同时含有几个核，所以即使用单细胞悬浮液处理，还是容易出现不纯的菌落。若诱变剂产生的突变只在DNA双链中的某一条单链，故该突变无法反映在当代的表型上。只经过DNA的复制和细胞分裂，表型才会发生变异，出现不纯菌落，这就叫表型延迟(phenotypic lag) 。不纯菌落的存在，也是诱变育种工作中初分离的菌株经传代后很快出现生产性状“衰退

”的主要原因。

（1）供试菌株的孢子或菌体的选择

供试细胞要新培养的，细胞生理活性既要同步，又要在最旺盛的对数期，这样突变率高，重现性也好。对细菌来说，常常通过前培养达到要求。菌悬液中的菌体应该是单细胞或单核的孢子，不但能均匀地接触诱变剂，还可减少分离现象发生。在实际工作中，要得到均匀分散的细胞悬液，通常可用无菌的玻璃珠来打散成团的细胞，然后再用脱脂棉或滤纸过滤。

菌悬液的细胞浓度一般控制为：真菌孢子或酵母细胞10 6 ~ 10 7 个/ml，放线菌或细菌10 8 个/ml。菌悬液一般用生理盐水（0.85%NaCl）稀释。有时，也需用0.1mol/L磷酸缓冲液稀释，因为有些化学诱变剂处理时，常会改变反应液的pH 值。

（2）菌悬液制备方法

细菌：在诱变处理前进行摇瓶振荡培养，利用温度和碳源控制其同步生长，离心洗涤，用冷生理盐水或缓冲液制备菌悬液，放在有玻璃珠的三角瓶内振荡10min，用无菌脱脂棉或滤纸过滤，通过菌体计数，调整菌悬液的浓度。孢子：在试验中尽量采用成熟而成熟的孢子，并置于液体培养基中振荡培养到孢子刚萌发，即芽长相当孢子直径0.5－1倍。离心洗涤，加入生理盐水或缓冲液，振荡打碎孢子团块，以脱脂棉过滤，计数，调整菌体浓度供诱变处理。对不产孢的真菌，可直接采用年幼的菌丝体进行诱变处理。

4、诱变剂的种类和选择

A、诱变剂种类的选择

物理诱变剂包括：各种射线，如紫外线（焦耳）、X射线（库仑/千克）、β射线、γ射线、α射线和超声波等；化学诱变剂包括甲基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥等。

选择诱变剂要根据诱变剂作用机制，结合菌种特性来考虑选择哪种诱变剂，同时要考虑菌种特性和遗传稳定性。同时还要参考出发菌株原有的诱变系谱来选择诱变剂。对遗传稳定的菌株，最好采用以前未使用过的、突变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂进行复合处理，然后再采用一些作用较缓的

诱变剂处理。对遗传不稳定的菌株，首先进行自然分离，划分菌落类型，从中选择效价高的、性能好的一类菌落作为诱变处理的出发菌株。采用温和诱变剂或对该类菌剂进行继续处理，从中筛选突变体。并结合自然分离和环境条件的改变，使有效的菌落类型不断增加，成为正常型菌落。在诱变之前还要考查出发菌株的诱变系谱，详细分析，总结规律性，选择一种最佳的诱变剂。

B、最适诱变剂量的选择

诱变的最适剂量，应该使所希望得到的突变株在存活群体中占有最大比例，这样可减少以后的筛选工作。

要确定一个合适的剂量，通常要经过多次试验。就一般微生物而言，诱变频率往往随剂量的增高而增高，但达到一定剂量后，再提高剂量会使诱变频率下降。根据对紫外线、x 射线及乙烯亚胺等诱变剂诱变效应的研究，发现正突变较多地出现在较低的剂量中。而负突变则较多地出现在高剂量中，同时还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，高剂量更容易出现负突变。因此，在诱变育种工作中，目前较倾向于采用较低剂量。例如，过去在用紫外线作诱变剂时，常采用杀菌率为90—99.9%的剂量，而近年来则倾向于采用杀菌率为70%～75%，甚至更低(30%～70%)的剂量，特别是对于经多次诱变后的高产菌株更是如此。

化学诱变剂主要是调节浓度、处理时间和处理条件（温度、

pH等）。物理诱变剂主要控制照射距离、时间和照射过程中的条件（氧、水等），以达到最佳的诱变效果。

5、诱变处理

A、不同诱变处理方法

（1）紫外线照射

由于紫外线不需要特殊贵重设备，只要普通的灭菌紫外灯管即能做到，而且诱变效果也很显著，因此被广泛应用于工业育种。

紫外线诱变育种的原理是：紫外线是波长短于紫色可见光而又紧接紫色光的射线、波长范围为136～300nm，紫外线波长范围虽宽，但有效范围仅限于一个小区域，多种微生物最敏感的波长集中在265nm处，对应于功率为15W的紫外灯。它是一种非电离辐射，当物质吸收一定能量的紫外线后，它的某些电子将被提升到较高的能量水平，从而引起分子激发而造成突变；而不吸收紫外线的物质，能量不发生转移，分子也不会激发，不会产生任何化学变化，然而，脱氧核糖核酸能大量吸收紫外线，因此它极容易受紫外线的影响而变化。紫外线的诱变作用是由于它引起DNA分子结构变化而造成的。这种变化包括DNA链的断裂，DNA分子内和分子间的交连，核酸与蛋白质的交联，嘧啶水合物和嘧啶二聚体的产生等，特别是嘧啶二聚体的产生对于DNA的变化起主

要作用。

紫外线诱变方法：将10mL菌悬液放在直径为9cm的培养皿中，液层厚度约为2mm，启动磁力搅拌器，使用15w功率紫外灯管，照射距离为30cm左右，照射时间以几秒至数十分钟为宜，具芽孢的菌株需处理10 min左右。为准确起见，照射前紫外灯应先预热20~30min，然后再进行处理。

不同的微生物对于紫外线的敏感程度不一样，因此不同的微生物对于诱变所需要的剂量也不同。在紫外灯的功率、照射距离已定的情况下，决定照射剂量的只有照射时间，这样可以设计一个照射不同时间梯度的实验，根据不同时间照射的死亡率，作出照射时间与死亡率的曲线，这样就可以选择适当的照射剂量。

一般以照射后微生物的致死率在90%~99.9% 的剂量为最佳照射剂量，近来也有倾向于采用杀菌率70%~75%甚至更低(30%~70%)的剂量。一般认为，偏低的剂量处理后正突变率较高，而用较高的剂量时则负突变率较高，但高剂量造成损伤大、回复少。目前趋向采用低剂量、长时间处理，尽管致死率较高，而诱变效果较好。

实验时，为了避免光复活现象，处理过程应在暗室的红光下操作，处理完毕后，将盛菌悬液的器皿用黑布包起来培养，然后再进行分离筛选。

（2）CO60 照射

CO60属γ射线，是一种高能电磁波，其诱发的突变率和射线剂量直接有关，而与时间长短无关。它能产生电离作用，直接和间接改变DNA结构。直接的效应是导致碱基的化学键、脱氧核糖的化学键、糖-磷酸相连接的化学键的断裂；间接的效应是电离辐射使水和有机分子产生自由基，自由基作用于DNA分子，特别是对嘧啶的作用更强，可引起缺失和损伤，造成基因突变，还能引起染色体断裂，引起倒位、缺失和易位等畸变。不同的微生物对C060的辐射敏感程度差异很大，可以相差几倍，引起最高变异的剂量也随菌种而有所不同。

一般照射时多采用菌悬液，也可用长了菌落的平皿直接照射。照射剂量在4~10万伦琴，或者采用能使微生物产生90％~99％死亡率的剂量。电离幅射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺失突变，但可能影响邻近基因的性能。

（3）等离子输入

等离子输入是一种较新的诱变方法，国外自20世纪60年代中、后期相继开始把等离子注入技术应用于生物学领域的研究，国内将离子束作为一种新技术应用于生物等品种改良的

研究则是由中国科学院等离子体物理研究所于1986年开创的。低能离子束是以具质量、能量双重诱变效应的特征不同于传统的电磁辐射，它的注入引发的生物效应，机制相当复杂，既有能量的沉积、动量的传递，又有粒子的注入和电荷的交换，可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和膜电场的改良，与γ射线，中子束等明显不同。离子束与生物体作用，首先有能量的沉积，即注入离子与生物大分子发生一系列碰撞，生物大分子获得能量时，键断裂，分子击出原位，留下断键或缺陷；同时还有质量沉积，离子束是高LET 粒子，有Braag峰，具有较强的电离作用，还能产生活性高的自由基间接损伤作用，因此它对生物体的作用可导致较高的突变率；另外由于注入离子的不同电荷数、质量数、能量、剂量的组合，提供了众多的诱变条件，通过这种电、能、质的联合作用，将强烈影响生物细胞的生理生化特性，以引起基因突变，所以变异幅度大，有较高的突变率，较广的突变谱；再者突变体的遗传性能比较稳定，回复突变率低。

B、不同诱变处理方式

①单一因子处理：采用单一诱变剂处理，可以减少减少菌种遗传背景复杂化、菌落类型分化过多的弊病，使筛选工作趋向简单化。

②复合因子处理：指两种以上诱变因子共同诱发菌体突变。

适合于遗传性稳定的纯种及生活能力强的菌株处理，能导致较大的突变。主要有：两个以上因子同时处理；不同诱变剂交替处理；同一种诱变剂连续重复使用；紫外线复活交替处理。

工业微生物菌种的选育、保藏与培养

工业微生物菌种的选育、保藏与培养 自然环境中的微生物是混杂生长的，要想得到生产某一目的产物的野生菌株，就需要采取一定的方法将它们分离出来。菌株分离（separation）就是将混杂着各种微生物的样品按照实际需要和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。菌株分离和筛选是获得目的菌种的两个重要环节。菌株的分离要根据生产实际需要、目的代谢产物的性质、可能产生所需目的产物的微生物种类、微生物的分布、理化特性及生活环境等，设计选择性高的分离方法，才能快速地从环境或混杂了多种微生物样品中获得所需菌种。筛选方法也很重要，在设计筛选方案时有两点必须注意，即所采用方法的选择性和灵敏度。微生物细胞内含物及其周围的培养基成分非常复杂，目标产物往往又含量极低。因此，需要建立灵敏度高、快速、专一性强的检测方法。 菌种收集和筛选途径： （1）向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。 （2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。 （3）从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。该类发酵制品经过长期的自然选择，具有悠久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株。 发酵工业对菌种的要求如下：①能在廉价原料制成的培养基上生长，且生成目的产物产量高、易于回收；②生长较快，发酵周期短；③培养条件易于控制；④抗噬菌体及杂菌污染的能力强；⑤菌种不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定；⑥对放大设备的适应性强；⑦菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。 菌种筛选主要步骤： 调查研究及查阅充分的资料筛选 ↓↓ 设计实验方案初筛（1株1瓶）↓确定采集样品的生态环境↓ 采样复筛（1株3～5瓶） ↓确定特定的增殖条件↓结合初步工艺条件摸索增殖培养再复筛（1株3～5瓶）↓确定特殊的选择培养基及可能的↓ ↓定性或半定量快速检出法3～5株平板分离↓ ↓单株纯种分离原种斜面↓生产性能试验及毒性试验↓确定发酵培养基础条件菌种鉴定 一、菌种的分离筛选 一）样品采集与预处理 总的原则是：样品的来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。特别是在一些极端的环境中，如高温、高压、高盐等极端环境中，可找到能适应苛刻环境压力的微生物类群。 1、从土壤中采样 土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（108）>放线菌（107）>霉菌（106）>酵母菌（105）>藻类（104）>原生动物（103），其中放线菌和霉菌指其孢子数。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。

第二章 微生物菌种选育(笔记类)

第二章工业微生物基础 ●知识要点和教学要求 1）、了解微生物的特点 2）、了解常见的工业微生物 3）、掌握工业微生物菌种的分离和选育 4）、掌握工业微生物菌种的改良 5）、掌握工业微生物菌种的保藏 6）、掌握工业微生物菌种的扩大培养 ●能力培养要求 通过本章节的学习，学生能掌握工业微生物菌种的分离和选育、改良和保藏方法，以及菌种扩大培养的基本工艺。 ●教案内容 2.1微生物的特点 （1）种类多，分布广 目前已发现的微生物在10万种以上。不同种类的微生物具有不同的代谢方式，能分解各式各样的有机物质和无机物质，当前国内外积极利用微生物来防治公害，分解三废中许多毒性强、结构复杂的物质。另一方面，不同微生物在生化过程中积累不同的代谢产物，所以发酵工业上常利用各种微生物来生产各种产品，如酒类、酒精、丙酮丁醇、抗生素、酶制剂、有机酸、氨基酸、核酸、维生素、菌体蛋白、医药产品和化工产品等到。 （2）高面积-体积比，代谢能力强 （3）生长迅速，繁殖快 （4）适应性强，容易培养 （5）易变性

2.2常见的工业微生物 广义的微生物包括病毒、立克次氏体、细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、单细胞藻类、原生动物和支原体等。在发酵工业中经常遇到的是细菌、放线菌、酵母菌、霉菌及危害、放线菌生长的噬菌体。 微生物工业的范围 微生物工业越来越深地同国民经济各部门发生关系，涉及的范围十分广泛，而且越来越大，大致可分为下列14类： （1）酿酒工业（啤酒、葡萄酒、白酒等） （2）食品工业（酱、酱油、食醋、腐乳、面包、酸乳等） （3）有机溶剂发酵工业（酒精、丙酮、丁醇等） （4）抗生素发酵工业（青霉素、链霉素、土霉素等） （5）酶制剂发酵工业（柠檬酸、葡萄糖酸等） （6）酶制剂发酵工业（淀粉酶、蛋白酶等） （7）氨基酸发酵工业（谷氨酸、赖氨酸等） （8）核苷酸类物质发酵工业肌苷酸、肌苷等） （9）维生素发酵工业（维生素B2、维生素B12等） （10）生理活性物质发酵工业（激素、赤霉素等） （11）微生物菌体蛋白发酵工业（酵母、单细胞蛋白等） （12）微生物环境净化工业（利用微生物处理废水、污水等） （13）生物能工业（沼气、纤维素等天然原料发酵生产酒精、乙烯等能源物质） （14）微生物冶金工业（利用微生物探矿、冶金、石油脱硫等）

工业微生物育种

转谷氨酰胺酶生产菌株的诱变选育方案 学生： 摘要：通过诱变育种选育转谷氨酰胺酶工业生产菌株，使目的菌株产酶量高、酶活高、到达最大产酶量的时间短，生长周期、最适产酶温度等条件尽可能地符合工厂要求。 关键字：筛选；工业菌株；诱变育种 前言： 工业微生物育种是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造, 去除不良性质, 增加有益新性状, 以提高产品的产量和质量的一种育种方法。工业微生物的育种技术已从常规的突变和筛选技术发展到基因诱变、基因重组和基因工程等, 育种技术的不断成熟, 大大提高了微生物的育种效果。 微生物发酵要想取得优良成绩, 有赖于优良菌种的利用。从工业发酵的观点来看发酵菌种的优异生产性能等于经选育的、符合经济要求的优良遗传背景加上经人为精心设计的、优化的发酵环境。菌种选育的最终目标, 就是通过人工干预, 使选出的优良菌种在优化环境中尽可能表现出优异性状。菌种分离、筛选、改良是贯彻微生物发酵始终的工作。 一．菌种选育的具体目标 (1) 提高产量。 (2) 提高产物的纯度。减少副产物; 提高有效组分;减少色素等杂质。 (3) 改变菌种性状。改善发酵过程, 包括: 改变和扩大菌种所利用的原料结构; 改善菌种生长速度; 提高斜面孢子化程度; 改善菌丝体形状, 采用菌球菌丝体发酵;少用消泡剂或使菌种耐合成消泡剂; 改善对氧的摄取条件, 降低需氧量及能耗; 耐不良环境: 抗噬菌体的侵染,耐高温、耐酸碱、耐自身所积累的代谢产物; 改善细胞透性, 提高产物的分泌能力等。 (4) 菌种的遗传性状。生产性状稳定。 (5) 改变生物合成途径。以获得新产品。 二．获取优良菌种的有效途径 广义上说, 菌种改良可描述为采用任何科学技术手段( 物理、化学、生物学、工程学方法以及它们的各种组合)处理微生物菌种, 从中分离得到能显示所要求表型的变异菌种。 菌种改良的基本途径: 突变和选择; 基因重组( 遗传重组) 和基因工程( 遗传工程) MTG 生产菌株的诱变育种 诱变的方式包括了各种物理射线、化学诱变剂以及生物方面的噬箘体等等。用得最多的是前两种，也有将几种方式混合使用的。国内的王璋教授还曾借助“神舟”4 号飞船搭载MTG 生产菌种在外太空进行诱变实验，取得不错的效果。

工业微生物育种诱变剂

第一章工业微生物育种诱变剂 1物理诱变剂的总类：物理辐射分为电离辐射和非电离辐射。 包括紫外线、X射线、r射线。快中子。微波，超声波、电磁波、激光射线和宇宙线等。（X 射线、r射线属于电离辐射，紫外线属于非电离辐射） 2物理诱变剂对微生物的影响实质：由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程。 3辐射作用的时相阶段： 物理阶段——直接作用DNA或作用于水 物理化学阶段——激发和电离DNA分子或激发电离水分子 化学阶段——产生生物自由基 生物学阶段——分子发生变化，变异或死亡 4细菌中紫外线对DNA的影响：促使G:C A:T的转换； DNA链断裂，单链或双链；嘧啶或嘌呤被氧化脱去氨基；碱基分子结构中碳与碳之间的链断裂形成开环现象；辐射击中单个核苷酸后，使碱基或磷酸酯游离出来；交联作用 5辐射引起的生物学效应的影响因素：微生物的遗传背景；微生物的生理状态；可见光；细胞水分；温度；空气或氧气。 6紫外线的诱变机理及原因？ 机理：(1)DNA与蛋白质交联(2)胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用(3)DNA链断裂，形成嘧啶二聚体 原因：形成嘧啶二聚体 7DNA损伤修复中光修复与暗修复的主要机理？ 光修复：嘧啶二聚体被一种光激活酶结合形成复合物，这种复合物在可见光下由于光激活酶获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。 暗修复：嘧啶二聚体的5’端限制性内切酶和外切酶的作用下，造成单链断裂，接着在外切核酸酶的作用下，切除嘧啶二聚体。然后再DNA聚合酶Ⅰ、Ⅲ的作用下，并以另一条完整的单链做模板合成正确的碱基对序列，最后由连接酶完成双链结构。 8紫外线有效波长（诱变）范围是：200~300nm 9紫外线的剂量以什么计算？绝对剂量：erg/mm2；相对剂量：照射时间、杀菌率表示 10紫外线诱变的步骤方法（以及应用，包括如何计数、致死率的计算） 步骤：（1）出发菌株的选择将细菌斜面培养至对数期，霉菌或放线菌培养至孢子刚成熟（2）前培养培养基中可添加咖啡碱或异烟肼等抗修复物质。将菌体培养至最佳状态（对数期）。 （3）制备菌悬液离心去除培养基，用生理盐水制备菌悬液，要求菌体浓度108，107， 106 mL-1等 （4）紫外线照射紫外灯预热20min；避免光修复。 （5）后培养将照射完毕的菌悬液加入到适合于正突变体增殖的培养基中，在适宜温度下培养1.5-2h。 （6）稀释涂皿后培养结束后，从中取一定量培养物，经不同稀释，涂皿，并且以未经紫外线照射过的菌悬液做对照皿，培养后，挑取菌落，以待筛选。 11化学诱变剂的概念：一类能够对DNA起作用、引起遗传变异的化学物质。 12以5-BU为例，详述碱基类似物的诱变机理：（见书43页） 答：诱变作用是取代核酸分子中碱基的位置，再通过DNA的复制，引起突变，因此，也叫掺入诱变剂。 1）争产掺入错误复制

(整理)工业微生物育种复习资料.

第一章绪论 一、微生物遗传育种 对野生型菌株或低产菌株进行遗传操作和分离筛选，从大量突变体中筛选出性状优良的菌株，并对其发酵条件加以优化，得到适合发酵工业生产的优良菌种（产量、质量、新产物）。 二、微生物遗传育种的具体目标: 1、提高产量生产效率和生产效益总是排在一切商业发酵首位的目标 2、提高产物的纯度，减少副如色素；提高有效产物组分 3、改变菌种形状，改善发酵过程，如改变和扩大菌种的原料结构；改善菌种生长速率；提高斜面孢子化程度；降低需氧量和能耗；耐不良环境；耐目的产物；改变细胞透性，提高产物分泌 4、遗传性状特别是生产性状稳定 5、改变生物合成途径，获得新产物 三、优良发酵菌株应具备哪些特性 1、遗传稳定 2、易于培养：营养谱广、培养条件易达到 3、易于保存（如孢子丰富或产生休眠体） 4、种子生长旺盛 5、发酵周期短，产量高，产物单一 6、产物易于分离纯化 第二章微生物遗传学基础 一、名词解释： 基因：遗传信息的基本单位。一般指位于染色体上编码一个特定功能产物（如蛋白质或RNA分子等）的一段核苷酸序列。 转化：受体细胞直接吸收了来自供外源DNA片断，并把它整合到自己的基因组中，细胞部分遗传性状发生变化的现象叫转化。 转导：外源遗传物质通过噬菌体的携带进入受体细胞，并与受体染色体发生基因重

组 接合：供体菌通过性菌毛传递不同长度的单链DNA给受体菌，在后者细胞中发生交换、整合，从而使后者获得新的遗传性状的现象。 菌种衰退：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。 二、突变型的种类：形态突变型、生化突变型、条件致死突变型、致死突变型、抗性突变型。 三、试质粒的性质及其在基因工程中的应用 性质：自我复制、拷贝数高、不相容性、转移性。 第四章工业微生物诱变育种 一、物理诱变剂基本作用过程 物理过程：能量吸收和传递物理化学作用：分子激发 化学过程：DNA断裂、碱基异构、碱基化学共价交联、碱基脱氨基等 生物学过程：经过DNA修复、复制、细胞分裂、代谢，产生死亡、基因突变、染色体畸变、染色体倍性变化等，使细胞死亡或形成各种突变体 二、紫外线的诱变机制 1、造成NDA断裂、与蛋白质交联、形成胸腺嘧啶二聚体 2、形成胸腺嘧啶二聚体是UV 引起突变的主要原因。形成于单链相邻TT间、或双链间 3、单链上出现TT二聚体，复制可能在此停止，或超越这一点继续复制，使子代DNA形成缺口，碱基错误插入该缺口，造成突变 4、双链间出现TT二聚体造成复制无法进行 三、DNA中TT二聚体的修复方法 1、光复活：90％，可见光，在黑暗下TT与一种光激活酶结合成较稳定的复合物，但在可见光下这种酶吸收光能而解离，二聚体重新分解！！！紫外诱变时照射和分离均应在黑暗或红光下进行 1、切补修复：4种酶参与，识别、内切、外切、延伸、连接。紫外诱变照射后在冰

微生物菌种选育方式(一)

微生物菌种选育方式(一) 关键词：地衣芽孢杆菌诺卡氏菌 ATCC 北京标准物质网 微生物菌种选育技术在现代生物技术中具有十分重要的地位，经历了自然选育、诱变育种、杂交育种、代谢控制育种和基因工程育种五个阶段，各个阶段并不孤立存在，而是相互交叉，相互联系的。新的育种技术的发展和应用促进了生产的发展。 1．自然选育 随着微生物学的发展，特别是在发明微生物的纯培养技术之后，出现了微生物纯种的自然选育。以基因自发突变为基础选育优良性状菌株的这种方法，是最早应用微生物遗传学原理．进行育种实践的一个实例。由于微生物体内存在光复活、切补修复、重组修复、紧急呼救修复等修复机制以及DNA聚合酶的校正作用，使得自发突变几率极低，一般为10-6～10-10这样低的突变率导致自然选育耗时长、工作量大，影响了育种工作效率。在这种情况下，就出现了诱变育种技术。 2．诱变育种 1927年，Miller发现X射线能诱发果蝇基因突变。之后，人们发现其他一些因素也能诱发基因突变，并逐渐弄清了一些诱变发生的机理，为工业微生物诱变育种提供了前提条件。1941年，Beadle 和 Tatum 采用X射线和紫外线诱变红色面包霉，得到了各种代谢障碍的突变株。在这之后，诱变育种得到了极大发展。 诱变育种是以诱变剂诱发微生物基因突变，通过筛选突变体，寻找正向突变菌株的一种诱变方法。诱变剂包括物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂。其中，物理诱变剂包括紫外线、X射线、射线、快中子等；化学诱变剂包括烷化剂(如甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝基乙基脲、乙烯亚胺及氮芥等)、天然碱基类似物、脱氨剂(如亚硝酸)、移码诱变剂、羟化剂和金属盐类(如氯化锂及硫酸锰等)；生物诱变剂包括噬菌体等。物理诱变剂因其价格经济，操作方便，所以应用最为广泛；化学诱变剂多是致癌剂，对人体及环境均有危害，使用时须谨慎；生物诱变剂应用面窄，其应用也受到限制。 现今，诱变育种已取得了显著的成果，如青霉素生产菌的青霉素产量在40年内增加了近万倍，达到lO万u／ml左右；谷氨酸产生菌经紫外诱变处理，产酸率提高了3l％；用亚硝酸钠、紫外线等物化方法诱变产碱性蛋白酶的地衣芽

工业微生物育种

工业微生物育种简介 刘春波-12生工2-20120802224 摘要：本文综述了工业微生物遗传育种的历史地位，介绍了遗传育种的方法和机理，并对其前景进行了展望。微生物遗传育种，所谓微生物遗传育种，即菌种改良，是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造，去除不良性质，增加有益新性状，以提高产品的产量和质量的一种育种方法[1]，使我们获得所需要的高产、优质和低耗的菌种，其目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求。 关键词：工业微生物；遗传育种；方法；机理 工业微生物菌株选育在工业发酵中占有重要地位。用于工业生产的微生物菌种，最好具有以下特征：1.在遗传上必须是稳定的。2.易于产生许多营养细胞、孢子或其它繁殖体3.必须是纯种，不应带有其它杂菌及噬菌体。4.种子的生长必须旺盛、迅速。5.产生所需要的产物时间短。6.比较容易分离纯化。7.有自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强。8.能保持较长的良好经济能力。9.菌株对诱变处理较敏感，从而提高产量潜力高[2]。 1 历史地位 菌种选育技术的广泛应用为我们提供了各种类型的突变菌株，使得在食品工业、医药、农业、环境保护、化工能源、矿产开发等领域产生众多新的产品，促使传统产业的技术改造和新型产业的产生，同时使诸如抗生素、有机酸、维生素、色素、生物碱、激素以及其它生物活性物质等产品的产量成倍甚至成千万倍地增长，并且产品的质量也不断的提高。与此同时链霉素、土霉素、金霉素和氯霉素等抗生素也大规模的生产起来；在代谢控制育种的推动下使得产氨基酸、核苷酸、有机酸等次生代谢产物的高产菌株大批投入生产；由基因工程构建的工程菌株使得微生物次生代谢产物生产能力迅速提高，而且生产出微生物本生不能生产的外源蛋白质，如胰岛素、生长激素、单克隆抗体和细胞因子等等。由此可见工业微生物遗传育种技术是工业发酵工程的核心技术，在其作用下人们获得了许多的高产优质菌株，为生产实践发展起了强大的推动作用。 2 机理及方法 2.1 自然选育 就是不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。这类突变没有人工参与并非是没有原因的，一般认为自然突变有两种原因引起，即多因素低剂量效应和互变异构效应。所谓多因素低剂量效应，是指在自然环境中存在着低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等作用引起的突变。互变异构效应是指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基的错配[3]。自然突变可能会产生两种截然不同的结果，一种是菌种退化而导致目标产量或质量下降；另一种是对生产有益的突变。为了保证生产水平的稳定和提高，应经常地进行生产菌种自然选育，以淘汰退化的，选出优良的菌种。

工业微生物菌种的选育——诱变选育(1)

工业微生物菌种的选育——诱变选育（1） 工业微生物菌种的选育——诱变选育（1） 诱变选育 诱变育种是指利用各种诱变剂的物理因素和化学因素处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质菌种的育种方法。诱变育种具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。 诱变育种的步骤与方法 （一）、工业育种的一般步骤（图） （二）、诱变育种方案设计 诱变育种方案包括突变的诱发、突变株的筛选和突变高产基因的表现。 1、出发菌株的选择 工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株。出发菌株

选择目前主要依据实际经验，总结如下：①以单倍体纯种为出发菌株；②采用具有优良性状的菌株；③选择对诱变剂敏感的菌株；④许多高产突变往往要经过逐步累积的过程，才变得明显，所以有必要多挑选一些已经过诱变的菌株为出发菌株，进行多步育种，确保高产菌株的获得。 2、出发菌株的纯化 为什么要对出发菌株进行纯化呢？这是因为微生物容易发生变异和染菌，同时一般丝状菌的野生菌株多为异核体。生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触、吻合后，易产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然突变株等。这些都会造成细胞内遗传物质的异质化，使遗传性状不稳定。通过纯种分离，从中挑选所需的优良菌株。常用划线分离和稀释分离法，并结合显微镜操纵器分离单孢子。 3、单孢子悬液的制备 诱变育种要求所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。 首先是细胞的生理状态对诱变处理也会产生很大的影响，如细菌在对数期诱变处理效果较好；霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子影响不大，但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率。

工业微生物育种全解

1.工业微生物育种在发酵工业中的作用如何？其目的是什么？ 工业微生物育种建立在： （1）遗传和变异（微生物遗传学）的基础之上； （2）物理和化学诱变剂的发现和应用； （3）工业自动化（自动仪表装置和微机）。 工业微生物育种在发酵工业中占有重要地位，是决定该发酵产品能否具有工业化价值及发酵过程成败与否的关键。 2.工业微生物发展经历了哪几个阶段？ 1)自然选育阶段 2)人工诱变选育阶段 3)杂交育种阶段 4)代谢控制育种阶段 5)基因工程育种阶段 3.工业微生物育种的核心指标有哪些？ 1)在遗传上必须是稳定的。稳定性。 2)易于产生许多营养细胞、孢子或其它繁殖体。 3)必须是纯种，不应带有其他杂菌及噬菌体。 4)种子的生长必须旺盛、迅速。 5)产生所需要的产物时间短。转化率。 6)比较容易分离提纯。 7)有自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强。 8)能保持较长的良好经济性能。产率。

9)菌株对诱变剂处理较敏感，从而可能选育出高产菌株。 10）在规定的时间内，菌株必须产生预期数量的目的产物，并保持相对地稳定。 4.革兰氏阳性和阴性菌的细胞壁结构有何差异？它们对溶菌酶和青霉素的敏感有何不同？ 5.缺壁细菌有哪些类型和异同？制备缺壁细菌主要有哪些途径？原生质体：G+菌经溶菌酶或青霉素处理； 球状体：G-菌，残留部分细胞壁。 是研究遗传规律和进行原生质体育种的良好实验材料。 L型细菌：自发突变形成细胞壁缺陷菌株； 6.原生质体制备时，为什么不同微生物要选择不同的酶？举例说明。 酶在原生质体制备中主要用来酶解细胞壁的，不同的微生物其细胞壁成分及含量可能不同，所以要用不同的酶。 酵母菌的细胞壁主要成分有葡聚糖、甘露聚糖蛋白质、几丁质。霉菌的细胞壁：主要成分是纤维素、几丁质、葡聚糖等。

2020年(生物科技行业)第二章微生物菌种选育(笔记类)

（生物科技行业）第二章微生物菌种选育(笔记类)

第二章工业微生物基础 ●知识要点和教学要求 1）、了解微生物的特点 2）、了解常见的工业微生物 3）、掌握工业微生物菌种的分离和选育 4）、掌握工业微生物菌种的改良 5）、掌握工业微生物菌种的保藏 6）、掌握工业微生物菌种的扩大培养 ●能力培养要求 通过本章节的学习，学生能掌握工业微生物菌种的分离和选育、改良和保藏方法，以及菌种扩大培养的基本工艺。 ●教案内容 2.1微生物的特点 （1）种类多，分布广 目前已发现的微生物在10万种之上。不同种类的微生物具有不同的代谢方式，能分解各式各样的有机物质和无机物质，当前国内外积极利用微生物来防治公害，分解三废中许多毒性强、结构复杂的物质。另壹方面，不同微生物在生化过程中积累不同的代谢产物，所以发酵工业上常利用各种微生物来生产各种产品，如酒类、酒精、丙酮丁醇、抗生素、酶制剂、有机酸、氨基酸、核酸、维生素、菌体蛋白、医药产品和化工产品等到。 （2）高面积-体积比，代谢能力强 （3）生长迅速，繁殖快

（4）适应性强，容易培养 （5）易变性 2.2常见的工业微生物 广义的微生物包括病毒、立克次氏体、细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、单细胞藻类、原生动物和支原体等。在发酵工业中经常遇到的是细菌、放线菌、酵母菌、霉菌及危害、放线菌生长的噬菌体。 微生物工业的范围 微生物工业越来越深地同国民经济各部门发生关系，涉及的范围十分广泛，而且越来越大，大致可分为下列14类： （1）酿酒工业（啤酒、葡萄酒、白酒等） （2）食品工业（酱、酱油、食醋、腐乳、面包、酸乳等） （3）有机溶剂发酵工业（酒精、丙酮、丁醇等） （4）抗生素发酵工业（青霉素、链霉素、土霉素等） （5）酶制剂发酵工业（柠檬酸、葡萄糖酸等） （6）酶制剂发酵工业（淀粉酶、蛋白酶等） （7）氨基酸发酵工业（谷氨酸、赖氨酸等） （8）核苷酸类物质发酵工业肌苷酸、肌苷等） （9）维生素发酵工业（维生素B2、维生素B12等） （10）生理活性物质发酵工业（激素、赤霉素等） （11）微生物菌体蛋白发酵工业（酵母、单细胞蛋白等） （12）微生物环境净化工业（利用微生物处理废水、污水等）（13）生物能工业（沼气、纤维素等天然原料发酵生产酒精、乙

工业微生物化学诱变育种研究及应用进展

[收稿日期]2008-05-18 　[作者简介]欧平(1970-),男,广西贺州学院讲师,微生物专业在读硕士。主要研究方向:微生物学。 工业微生物化学诱变育种研究及应用进展 欧　平 (贺州学院,广西　贺州　542800) [摘　要]文章着重介绍了当代化学诱变技术、发生突变的机理和诱变效率,概述了化学诱变的原理及 其在工业微生物育种上的应用进展,选择性地介绍了几种公认有效的突变剂的作用机理。 [关键词]微生物;化学诱变;诱变剂 [中图分类号]Q933　[文献标识码]A [文章编号]1673-8861(2008)03-0139-06 变异是生物进化的基础推动力(Stebbins 1950),也是保证物种多样性的前提,是其他任何方式不能代替的重要演变方式。人为地利用这种方式,用尽可能小地影响基础生命代谢的方式最大限度地追求对物种变异的加速,正是诱导变异的研究目的。诱变育种是人为地利用诱变因素诱发生物遗传变异,在较短时间内获得有利用价值的突变体,根据育种目标要求,选育成新品种直接生产利用,或育成新种质作亲本在育种上利用的育种途径。诱变育种对于品种的改良有着很大的贡献,而在生物的生理机制研究中,诱变技术也功不可没,许多代谢途径的发现都是建立在若干突变体的基础上的。随着分子水平的深入研究,与诱变相关的基因um u D 、C 和di n B 的克隆,以及其他突变机理的进一步明晰,诱变育种的工作变得更为有序和可操纵。 1927年,Muller 发现X 射线能诱发果蝇基因突 变,从此开创了诱变育种技术的先河。诱变育种技术发展至今形成了3种技术:辐射诱变、定点诱变和化学诱变。世界化学诱变育种研究工作始于20世纪50年代,我国近几十年来这方面的研究工作也有了较大进展。20世纪70年代以来,诱变因素从早期的单一诱变剂发展到多种化学诱变剂和生理活性物质,诱变方法从单一处理发展到复合处理,同时,诱变育种与组织培养等密切结合,大大提高了诱变育种的实际意义。 从自然环境中分离,经过简单筛选而获得的的产酶菌株虽然具备了一定的产酶能力,但是要达到某种特定代谢产物的大量积累,实现高产、优质和低 耗的高效转化,则需要对菌株进行改良,解除或突破微生物的代谢调控[1]。微生物育种手段主要有:诱变育种、杂交育种和基因工程育种。虽然现代的基因操作技术对菌株改造更为精准,但实际工业化生产上所使用的产酶菌株,仍然是多采用一些传统诱变技术。诱变育种就是利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群,在大大提高其突变频率的基础上,采用适当的筛选方法获得所需要的突变菌株,以供科学实验和生产实践使用[2]。由于化学诱变育种技术还具有易操作、剂量易控制、对基因组损伤小、突变率高等特点,因而近年来成为运用最为广泛的诱变技术。经过近一个世纪的不断发展和完善,化学诱变育种技术已成为目前工业微生物育种中最为常用、最有效的技术之一。 1.化学诱变的主要原理 化学诱变是通过采用一些分子结构不太稳定的化学诱变剂进行的,它通过化学试剂造成生物的损伤和错误修复,产生突变体。这些突变以点突变为主,并且因试剂不同具有某些相对高频而且较为稳定的突变谱。单一碱基对改变而形成的点突变是化学诱变的主要形式。 化学诱变剂主要指某些烷化剂、碱基类似物、抗 生素等化学药物,常见的有甲基磺酸乙酯(EMS )、硫酸二乙酯(DES )、叠氮化钠(SA )和乙烯亚胺(EI )等,这些化合物通过与核苷酸中的磷酸、嘌呤和嘧啶等分子直接反应来诱发突变,并对某特定的基因或核酸有选择性作用[3]。 其中烷化剂因可与核酸的碱基等直接发生化学

工业微生物试题

一、填空题 (每小题2.5分，共25分) 1.微生物是指所有形体微小，单细胞或结构简单的多细胞，或没有细胞结构的一群最低等生物。 2.工业微生物主要包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、噬菌体等五大类, 其主要特性是(l) 种类多 (2) 分布广(3) 繁殖快 (4) 代谢强 (5) 易变异。 3.细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，它是由许多肽聚糖单体聚合而成的大分子化合物, 其结构是由N—乙酰葡萄糖胺与N—乙酰胞壁酸重复交替连接构成骨架, 短肽接在N—乙酰胞壁酸上，相邻的短肽交叉相联而形成致密的多层网状结构。 4.原核生物的细胞核比较原始简单，没有核膜包住，不具核仁和典型染色体，故称拟核,它实际上是一条很长的环状双链DNA 与少量类组蛋白及RNA结合, 经有组织地高度压缩缠绕而成的一团丝状结构, 其功能是起贮存遗传信息和传递遗传性状的作用。 5.噬菌体是侵染原核生物(细菌、放线菌和蓝细菌)的病毒，它是一种超显微的，没有细胞结构的，专性活细胞寄生的大分子微生物, 其生长繁殖过程可分为吸附、侵入、增殖、成熟、裂解五个阶段。 6.微生物的四大营养类型是光能自养型、光能异养型、化能自养型、化能异养型。微生物的营养五要素是水、碳源、氮源、无机盐和生长因子。 7.从自然界中分离筛选菌种一般可分为样品采集、增殖培养、纯种分离、性能测定等四个步骤。营养缺陷型的选育过程一般可分为诱变、中间培养、淘汰野生型、营养缺陷型检出、营养缺陷型鉴定、变异株的筛选等六个步骤。 8.能够满足野生型菌株生长要求的最低成分合成培养基称为基本培养基。能够满足各种营养缺陷型菌株生长要求的培养基称为完全培养基。 9.化学诱变剂按其作用方式可分为天然碱基类似物、烷基化剂、移码诱变剂、亚硝酸等四大类。紫外线(uv)是物理诱变剂, 它引起DNA结构改变的形式主要有氢键断裂、DNA链断裂、水合作用、T二聚体形成。 10.常用的六种菌种保藏方法是斜面冰箱保藏法、石蜡油封藏法、麸曲保藏法、砂土管保藏法、甘油低温保藏法、冻干法。 二、名词解释 (每小题３分，共18分) 1.革兰氏染色法一种重要的细菌鉴别染色法。该染色法的步骤是：（1）先用结晶紫液初染；（2）再用碘液媒染（与结晶紫形成不溶于水的复合物）；（3）接着用95%乙醇进行脱色；（4）最后再用番红（沙黄）液复染。经过这种染色方法可以将所有细菌基本上区分为两大类：革氏阳性细菌被染上紫色，革氏阴性细菌被染上红色。 2.巴斯德消毒法一种低温消毒法，具体的处理温度和时间各有不同，一般在60~85℃下处理15s至30min。用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体的消毒方法，主要目的是杀死其中无芽孢的病原菌，而又不影响它们的风味。 3.营养缺陷型是指在某些营养物质(如氨基酸、核苷酸、维生素等)的合成能力上出现缺陷，必须在培养基中外加这些营养成分才能正常生长的变异菌株。 4. 溶源性细菌受到温和噬菌体侵染而带有原噬菌体却又没有形态上可见到的噬菌体粒子的宿主菌，称为溶源性细菌，简称溶源菌。 5.活性污泥是由污水中繁殖的好气性微生物群体组成的絮状污泥，具有很强的吸咐、凝聚和氧化分解污水中有机物质和其它物质的能力。 6.生物传感器生物传感器是一种利用生物活性物质的分子识别能力, 选择性地识别和测定各种生物化学物质的传感器。它是分析生物学与传感器技术交叉的产物。 三、问题解答 (共57分) l.何谓大肠菌群? 简述食品中大肠菌群数的测定方法。(6分) 大肠菌群是指一群在37℃、24小时内能发酵乳糖、产酸产气、需氧或兼性需氧, 革兰氏阴性、无芽孢的杆状细菌。主要包括大肠杆菌、产气杆菌和一些中间类型的杆菌。 检测大肠菌群的方法有多管发酵法与滤膜法两种: 多管发酵法又称水的标准分析方法,大多数卫生单位与水厂均普遍采用此法。多管发酵法检测食品中大肠菌群数的操作过程为：(l) 培养基的制备, (2) 食品检样稀释, (3) 乳糖初发酵试验, (4) 平板分离培养, (5) 证实试验, (6) 报告MPN (大肠菌群的最可能数)。 滤膜法是一种快速的测定方法, 其结果重复性较好, 又能测定较大体积的水样, 目前巳有很多供水公司采用此法。其检测程序为：滤膜洗涤灭菌→滤膜过滤器安装→加水样抽滤→移滤膜贴于培养基上→培养与计数。 2.现有一培养基配方如下:可溶性淀粉5%、蛋白胨1.5%、磷酸二氢钾0.5%、硫酸镁0.1%、琼脂2%, pH5.0,试回答下列问题: (l)按营养物质来源分类, 属何种类型培养基? 为什么? (2)此培养基适于培养哪类微生物? 为什么? (3)简述配制200ml该斜面培养基的操作过程。 (7分) (1) 属半合成培养基。因培养基中，一部分采用天然材料，另一部分用已知的化学药品组成。 (2) 此培养基适于培养霉菌。因pH5.0适于培养霉菌和酵母菌, 但酵母菌不能直接利用可溶性淀粉为碳源。 (3) 操作过程：准确称量可溶性淀粉10g、蛋白胨3g、 磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.2g、琼脂4g于500ml烧杯中→加入200ml水溶解→调节pH5.0 →加热融解→补足水分→分装试管→灭菌→摆斜面。 3.现拟从自然界中分离筛选出α-淀粉酶产量较高的枯草芽抱杆菌,试回答下列问题: (l)你认为应该到什么地方采集含此菌的样品较为适宜? (2)进行纯种分离时,为提高效率,根据该菌的何种特性可采用哪些相应的措施? (3)可采用哪些纯种分离方法? (4)在进行性能测定时, 可采用何种简化的初筛方法? (l) 应该到富含淀粉质的地方采集含此菌的样品。 (2) 根据该菌的耐热特性可采用将含菌样品加热80℃处理10min后，杀死不耐热杂菌, 再进行纯种分离的相应措施。 (3) 可采用划线分离、稀释分离、刮棒连续涂布等纯种分离方法。 (4) 可采用平皿淀粉透明圈法进行初筛。 4.对于分支合成途径, 怎样才能积累大量的末端产物? 试以简图表示并说明之。(4分)

微生物菌种选育技术的发展与应用

微生物菌种选育技术的发展与应用 院系生命科学系 专业生物科学（非师） 姓名 xxxxx 学号 xxxxxxx

【摘要】微生物菌种选育技术是指运用遗传学诱变杂交等原理，对某种有特定生产作用的微生物菌种进行筛选及改造，从而使所需产物达到高产量高质量的一门技术二基于此，主要对微生物菌种选育技术的发展和研究进行介绍和分析。本文就目前微生物菌种选育技术热点问题做了简单的概述，微生物的育种是现代工业发展的一个关键环节。[1]介绍了现代工业微生物育种技术发展，包括自然育种、诱变育种、代谢控制育种、基因工程育种等，并对育种技术的发展做了展望。【关键词】微生物菌种；研究进展；育种技术；菌种选育 【Abstract】Microbial breeding technology refers to the use of genetic mutation hybrid principle, has the effect of specific microbial production of some of the screening and transformation, so that the desired product to achieve high yield and high quality technique of two based on this, mainly on the introduction and analysis of the research and development of microbial breeding technology.In this paper, the breeding technology hot spots do a simple overview of microorganism, microbial breeding is a key link in the development of modern industry. Introduces the process of breeding technology development, including natural breeding, mutation breeding, metabolic control breeding, gene engineering breeding, and the development of breeding technology is prospected. 【Keywords】Microbial strains; research progress; Breeding technology; Strain breeding 前言：随着生物技术的不断改进和完善，微生物菌种的选育已广泛应用到各行各业中，尤其在发酵产业中，对其整个行业的产量和质量都有大幅度提高微生物菌种的选育总共历程了5个阶段，从开始对常规菌种的自然突变筛选发展到近些年的人工干预:诱变育种技术、杂交育种技术、代谢控制育种技术，直到基因工程育种技术各个技术之间并不是相互孤立的，而是相互交又相互关联的，也是逐次在上个技术上不断改善和完善的。对微生物菌种的优化选育是提高产量和质量的一条有效途径。以突变和筛选为中心的传统育种技术在工业微生物发展到现在规模的过程中始终起着重要作用。70年代以来，重组DNA 技术和原生质体融合技术开始用于菌种选育。[2]各种外源基因在原核生物、真核细胞的克隆和表达研究取得了重大成果，使微生物育种技术进入了真正意义的分子水平育种时代。 一、什么是微生物菌种选育技术？ 微生物育种是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌种进行改造，以提高产品的产量和质量，优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键，要使发酵工业产品的种类、产量和质量有较大的改善，首先必须选育性能优良的生产菌种。[3]微生物菌种选育技术在现代生物技术中特别是发酵产业中具有十分重要的地位。通过对微生物菌种的选育可以有效提高产品产量和质量，微生物育种技术经历了自然选育，诱变育种，杂交育种，代谢控制育种，和基因工程育种五个阶段，各个阶段并不孤立存在，而是相互交叉，相互联系。新的育种技术的发展和应用促进了生产的发展。 二、微生物菌种选育主要技术类型 2.1自然育种 常规选育最先用于酒精发酵产业，通过对纯系菌种的选育，[4]显著改善酒精生产中不稳定的情况，这是常规选育纯菌种成功的一个例证常规育种是在基因突变基础上，生产

工业微生物菌种开发的一般过程

1、工业微生物菌种开发的一般过程 自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。土壤样品的含菌量最多。菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤。 （1）采样 注意事项 1、采样时应尽可能保持相对无菌； 2、所采集的样本必须具有某种代表性； 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等； 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的； （2）富集培养 目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。富集培养主要根据微生物的碳、氮源、pH、温度、需氧等生理因素加以控制。 例如控制培养基的营养成分的富集培养，如要分离水解酶产生菌，可在富集培养基中以相应底物为惟一碳源，加入含菌样品，给目的微生物以最佳的培养条件（pH、温度、营养、通气等）进行培养。能分解利用该底物的菌类得以繁殖，而其他微生物则因得不到碳源无法生长，菌数逐渐减少。 （3）分离筛选 经富集培养以后的样品，目的微生物得到增殖，占了优势，其他种类的微生物在数量上相对减少，但并未死亡。富集后的培养液中仍然有多种微生物混杂在一起，即使占了优势的一类微生物中，也并非纯种。因此，经过富集培养后的样品，也需要进一步通过分离纯化，把最需要的菌株直接从样品中分离出来。 例如划线分离法，用接种环取部分样品或菌体，在事先已准备好的培养基平板上划线，当单个菌落长出后，将菌落移入斜面培养基上，培养后备用。该分离方法操作简便、快捷，效果较好。 （4）产物鉴别 经典微生物分类鉴别 现代的分子生物学分类鉴别 2、分子生物学分类方法（微生物分类鉴定的经典和现代方法）

工业微生物育种思考题

工业微生物育种思考题 1.工业菌种的微生物应具有什么基本特征？ 2.育种思路原则是什么？ 3.概述工业微生物育种方法。 4.你认为与工业微生物育种有关的最重要发现或发明有那些？为什么？ 5.名词解释：基因和基因组，基因型和表现型 6.简述如何采集自然界微生物样品 7.简述野生型菌株的分离与筛选的步骤 8.简述选择性培养基在育种中的应用及富集培养在育种中作用 9.诱变菌悬液的制备要考虑哪些因素？为什么要这样制备诱变菌悬液？ 10.简述工业微生物物诱变育种程序是什么？ 11.如何选用诱变剂和诱变方法？ 12.举例特殊性能变异株的初筛方案设计。 13.代谢调控育种的基础与方法有那些？ 14.筛选营养缺陷型菌株在操作上应注意那些？ 15.经典基因重组方法有那几种？遗传物质的转递有什么不同？ 16.简述原生质体融合育种的特点。 17.原生质体融合育种步骤是什么？ 18.原生质体的制备过程应注意那些？影响原生质体制备的因素 19.如何断定原生质体化的程度 20.简述抗生素浓缩法、夹层法、菌丝过滤浓缩法 21.举例说明生长谱测定 22.如何进行抗性菌株的筛选？ 23.质粒的定义、特性和作用。 24.简述PCR扩增特定基因序列的原理。PCR注意事项有哪些？ 25.简述基因克隆的技术路线 26.利用基因工程技术育种研究的主要步骤是什么？你认为最关键的步骤是什么？说明 理由 27.在工业酶表达应用中，大肠杆菌pET系统常用的载体和宿主有哪些？pET 系统表达 可能存在的问题及解决策略？ 28.毕赤酵母表达系统的常用表达载体的结构是什么？ 29.表达载体与克隆载体的区别是什么？pPIC9K是什么载体？ 30.酶基因是否表达如何确定？

(整理)微生物工业菌种与培养基

微生物工业菌种与培养基 菌种与种子扩大培养 菌种：实现从原料→目的产物的关键 生产效率、产品成本、产品质量 ※ ※ ★从自然界分离：目前土壤中已分离的微生物不到总数的1%，微生物的多样性仍然是以后若干年的研究重点； ★诱变育种：诱变是工业发酵稳产高产的重要保证； ★基因重组：基因定向改造技术大大加快了生物产品开发的进程。

※从自然界中分离菌种的一般过程 采样预处理 →培养 →菌落的选择 →产品的鉴定 ※选择育种方法时综合考虑的因素 (1) 待改良性状的本质及与发酵工艺的关系 (2) 对这一特定菌种的遗传生化的认识程度 (3) 经济费用 ★如，对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少， 则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术； ★如，对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。 ※一些常用工业微生物 ★抗生素生产有关的微生物 放线菌（链霉素真菌（青霉素、头孢等）四环素；红霉素等） 一些产芽孢的细菌 植物或动物来源 ※氨基酸生产有关的微生物

★氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单； ★谷氨酸发酵的菌种：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌； ★其它氨基酸生产菌：常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌。 ※食品工业微生物包括：酿造业，酶制剂等 ★食品用的微生物需经过严格的毒理试验，目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 ★α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌。 2、工业微生物(菌种)的要求 1）能在廉价原料制成的培养基上迅速生长和大量合成目的产物----价值高 2）能在要求不高、易控制的培养条件下迅速生长和发酵，发酵周期短。----可操作性强 3）根据代谢调控要求选择高产菌株，如营养缺陷型菌株或调节突变型菌株 4）菌种抗噬菌体能力强，以防止感染噬菌体而造成“倒罐”现象的发生。 5）菌种纯粹，不易退化，可保证发酵生产和产品质量的稳