甘油管冷冻保藏方法总结

甘油冷冻保藏法

本方法适合于中、长期菌种保藏，保藏时间一般为2-4年左右。

（1）用火焰灭菌的接种环取斜面菌种在平皿上划线分离单菌落。

（2）平皿倒置于30℃或37℃恒温培养箱，培养24-48小时，至单菌落的大小为3mm左右。（3）挑取一个单菌落，接种于一个装50mL的300mL三角瓶中30℃或37℃振荡培养10-15小时，至菌密度OD600为1.0-1.5。

（4）用火焰灭菌的接种环取少量种子液，涂片后，作革兰氏染色，在显微镜下观察菌体的形态，及是否有杂菌。

（5）按30%甘油：种子液为1：1（V/V）的量加入无菌甘油，混合后分装至事先灭菌的菌种保存管（1-2mL/管），-70℃或液氮保存。

用甘油保存过细菌，酵母，霉菌和放线菌，40%-50%的甘油是它的最终浓度。甘油浓度过低低温保存易结冰，使菌死亡。我同学有直接将菌液-20保存的，不加任何保护剂，但保存的时间很短，他们保存过一年的，但很多有死掉的。我们做大肠杆菌感受态，最终甘油是15%的浓度，有时结冰也会使菌死掉。我用40%-50%的甘油最终浓度一直很好，也不结冰。甘油一般是用那种蓝盖的小管（1毫升）灭菌，放0.7毫升左右的甘油，然后加菌悬液0.1至0.2毫升即可。甘油菌种比列为7：1.

甘油管保藏与活化：在做一丝状真菌的甘油管保藏（-80度超低温保存，以甘油做保护剂），大家提点建议。是将菌在液体摇瓶中培养后将菌液与甘油混合、将固体培养的菌块捣碎成菌液再与甘油混合，还是直接将菌块挑至甘油中甘油与菌液的比值多少最合适，等等。

用该法保藏过的菌种，如何活化?

保种的菌先接种在培养液里活化好；配置50%的甘油溶液，灭菌；1：1加入，直接放入-80度；复苏的时候，冰上融化，直接接入培养液中。

除了可以用液体培养基菌丝保藏外。要是你要保藏的丝状真菌能产孢子的话，还可以制成孢子悬浮液保藏，这样保藏的时间能长了些,到时活化的几率也大。

制备过程大致如下：用无菌的蒸馏水将丝状真菌斜面孢子洗出，接着用带脱脂棉的漏斗过滤制备孢子悬浮，.该悬浮液与40-50%甘油溶液按1:1混合均匀后，即可。然后每个甘油管里面加入1.5ml左右甘油菌悬液。

在放入-80度超低温保藏之前，最好在-20度低温下预冻12-15 hr后，再转入-80度环境下保藏。丝状真菌还是用孢子悬液做甘油保藏好点吧！不怕麻烦的用沙土管法保藏更好。

§菌种管由传统的玻璃菌种管改为0.5ml带盖塑料离心管。

方法：①将塑料离心管置耐高压塑料离心管盒内并用双层报纸包好，高压蒸汽15磅15min 消毒，放烤箱80℃烤干。②在净化工作台内将脱脂牛奶洗下的浓厚菌悬液用长毛细玻璃滴管加到塑料离心管的底部，每只0.2ml左右，切记不要将牛奶污染离心管口。

③将加好菌液的离心管盒置-20℃冰箱预冻，预冻好后把离心管盒放置到冷冻干燥机干燥箱内冻干。④冻干后在净化工作台内压好离心管盖，不抽真空。贴标签，用封口膜封离心管口。放-20℃冰箱保存。

§该改良法优点有：

⑴操作过程大大简化，菌种管口不需溶封，不抽真空。⑵菌种管抗破损性极佳；

⑶菌种管体积超小。⑷成本低廉，易于商品化生产、推广。

笔者使用该改良法近七年，本省发放菌种上万只没有破损情况出现；数次发放嗜血杆菌、链球菌、奈瑟氏菌等苛养菌，生长情况良好。近几年我们还向华东地区部分兄弟省分提供了室间质评菌种四万余只，效果满意。

石蜡油封存（流程：标记试管→接种→培养→加石蜡油→保藏）

1菌株待保藏的适龄菌株斜面

2培养基肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。

3 试剂 10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。

4 器具用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l毫升无菌吸管等。5步骤

5.1标记：取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。

5.2接种：将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。

5.3培养：置37恒温箱中培养48小时。

5.4加石蜡油：无菌操作下将5毫升石蜡油到培养好的菌种上面，加入的量以超过斜面或直立柱1厘米高为宜。

5.5保藏：石蜡油封存以后，同样放入4℃冰箱中保存。也可直接放在低温干燥处保藏。这种方法保藏期一般为一至二年。

求助]用甘油冷冻管保藏菌种时，保藏时菌悬液的浓度范围是多少？

想请教各位老师一个问题，再用甘油冷冻管保藏菌种时，要不要先测一下菌悬液的浓度，保藏时菌悬液的浓度范围大概是多少？

还有那个麦氏比浊计是如何使用的，一般微生物检验用得上吗，在那种情况下要用，是如何计算的，跟使用紫外分光光度计有何不同？

以前学校里做的一般都是把对数后期或者稳定期前期的菌体浓度浓缩10倍，当然可以灵活调整，只要保证一定的活力就行。一般20ul接到1.2ml甘油管里就行，当然也可以适当的增减量。

一般不用，当然如果调整一下会更好，可以知道存活率怎样，嫌麻烦的话就不用了，但是浓度不能太低，否则难以保证复活效果。

麦氏比浊只要不做抑菌实验和消毒学评价一般用不上，紫外OD值跟麦氏比浊管之间作用是一致的，但没有绝对的换算关系，0.5麦氏浊度大约相当于OD625＝0.08-0.10（光径1cm）

推荐一种最简单实用的菌种保存方法：菌种保存管

产品特点 

菌株保藏管内含特制的小珠（20-25颗）和特殊溶液，只需将培养好的菌株接入溶液中，摇匀成菌悬液，细胞即吸附于小珠上，然后吸出溶液，将保藏管置-70℃可保存10年，置-10℃至-15℃可保存1-3年。 

产品使用

对需要保存的菌株进行必要的纯化，挑取生长旺盛时期的菌落，接入菌株保藏管中，通常需要接入4-7环，

对于苛养菌应多接一些；

2．  拧上盖子，充分剧烈震荡；

3．  用无菌吸管将溶液吸走，尽可能吸干；

4．  马上放入冰箱中，温度越低越有利于保存；

5．  复苏时，只需将小珠在平板上滚动或置肉汤中培养。

注：多数情况下反复冻融是可以的，但对于一些苛养菌和厌氧菌这样做可能会影响保存效果

注：推荐使用-70℃超低温冰箱；该方法适用于细菌，霉菌和酵母等，特别适合保存苛养和娇弱的菌株，但不同的菌株保存时间会有所不同；特别注意菌株保存的记录，标签和使用流程；很多情况下，复苏须对菌株进行鉴定，以确认无污染

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